Tài liệu CHƯƠNG 9: DI TRUYỀN HỌC CỦA VIRUS VÀ VI KHUẨN docx

1 CHƯƠNG 9: DI TRUYỀN HỌC CỦA VIRUS VÀ VI KHUẨN PHẦN II: CƠ SỞ DI TRUYỀN HỌC TS.Nguyễn Hồi Hương IX. 1. Di truyền học của virus Virus = vật ký sinh nội bào bắt buộc (obligate intracellular parasite) Tế bào chủ: mỗi loại virus chỉ lây nhiễm một số tế bào. E.coli bị nhiễm phage T4 (x 36 500) Bên ngồi tế bào, hạt virus (virion) khơng thể sinh sản Virus chỉ hoạt động khi lây nhiễm tế bào 1. Đặc điểm chung Kích thước nhỏ qua lọc vi khuẩn Cấu tạo chủ yếu gồm lõi acid nucleic và vỏ protein capsid Khơng có bộ máy trao đổi chất, khơng chuyển hóa năng lượng Khơng tăng trưởng về kích thước Khơng có ribosome để tổng hợp protein Sử dụng enzyme, ribosome của tế bào chủ để sinh sản (sao chép nhân bản và tổng hợp protein của mình). Lõi là acid nucleic chứa thơng tin di truyền: DNA mạch kép DNA mạch đơn RNA mạch kép RNA mạch đơn Bộ gene của virus là một phân tử acid nucleic dạng vòng tròn hay thẳng, Số gene: 4 – 100 . Vỏ: protein capsid bảo vệ lõi, vai trò kháng ngun Vỏ protein = capsid Nucleic acid 2. Cấu trúc chính của virus 2 RNA virus như virus khảm thuốc lá, virus cúm, virus bại liệt chứa thơng tin di truyền trong RNA mạch đơn Thơng tin di truyền đi từ RNA – RNA – RNA - Protein Retrovirus: RNA virus nhưng thơng tin di truyền đi từ RNA – DNA – RNA - Protein DNA virus: thơng tin di truyền đi từ DNA – RNA - Protein Dòng thơng tin di truyền của virus Virus đốm thuốc lá (Tobacco mosaic virus) Virus xoắn (Helical virus) a) Vỏ hình que 3. Phân loại virus theo hình thái cấu trúc b) Vỏ đa diện Virus đa diện (Icosahedral symmetry): 20 mặt Virus bại liệt (Poliovirus) Virus lở mồm long móng (FMD virus) c) Virus có màng bao (envelopped virus): màng lipid bao ngồi cấu trúc chính (virus cúm và nhiều virus động vật ) Màng bao: màng lipid hai lớp; chức năng chống mất nước và enzyme Matrix protein: protein virus liên quan đến tổng hợp capsid Glycoprotein: protein xuyên màng lipid, đuôi protein kỵ nứơc gắn vào màng lipid, đầu glycoprotein hướng ra ngoài là kháng nguyên (antigene) của virus. Kênh vận chuyển: gồm protein xuyên màng nhiều lần tạo kênh ion. 3 HIV-1 virus Mũi tên chỉ nucleocapsid d) Virus cấu trúc phức tạp Bacteriophage= đầu đa diện + đuôi hình que Virus của vi khuẩn Đuôi/vỏ co rút Sợi đuôi Phiến gốc có gai Đầu/Capsid Phage T chẵn 3. Phân loại virus theo tế bào chủ a) Bacteriophage Các bacteriophage được phát hiện những nắm 1940, dùng để nghiên cứu sinh học phân tử, được nghiên cứu kỹ nhất Hai cơ chế sinh sản: chu trình tan (lytic cycle) và chu trình tiềm tan (lysogenic cycle) i) Chu trình tan: virus độc (virulent) làm chết tb chủ Vd Phage T4 của E.coli Chu trình tan của bacteriophage 1. Phage dùng sợi đuôi bám vào thụ thể trên bề mặt tb (Adsortion) 2. Phage bơm bộ gene vào tế bào chất vi khuẩn (Penetration) 3. Bộ gene của phage bắt đầu sao chép (early replication) 4. và các bộ phận + enzyme của phage hình thành sử dụng bôï máy trao đổi chất tb (late replication) 5. Lắp ráp các bộ phận của phage (maturation) 6. Enzyme của phage phã vỡ vách tb vi khuẩn, phóng thích phage (release) 4 ii) Chu trình tiềm tan (lysogenic cycle) của phage ôn hòa (temperate bacteriophage) Phage ôn hòa sinh sản theo hai cơ chế: tan và tiềm tan Trên hình, Bước 1-6: chu trình tan Bước 7-9: chu trình tiềm tan 1. Bám (adsorption) 2. Xâm nhập (penetration) 9. Ngẫu nhiên bộ gene phage bò cắt khỏi nhân tế bào 7. Bộ gene của phage gắn vào bộ gene của vi khuẩn tạo prophage (prophage formation) 8. Tế bào phân chia bình thường (binary fission) Giải thích chu trình tiềm tan (lysogenic cycle) b) Virus thực vật và các viroid Virus đốm thuốc lá (Tobacco mosaic virus) i) Virus Phần lớn hình que Bộ gene là RNA Tai họa cho trồng trọt (chưa có cách chữa) ii) Viroid: cấu trúc đơn giản hơn virus Chỉ gồm đoạn RNA trần vài trăm nucleotide, không có protein Ứng dụng virus thực vật: chuyển gene trong kỹ thuật di truyền c) Virus động vật Virus gắn vào thụ thể trên bề mặt tb (receptor binding) Bóc vỏ (uncoating) RNA vào tb chất RNA đóng vai trò mRNA tổng hợp prorein trong tb chất (protein synthesis) Biến đổi protein (protein cleavage) Sao chép RNA từ khuôn RNA tạo RNA âm (antisense), sao chép tiếp thu được RNA giông RNA virus (RNA dương) Lắp ráp virus (RNA packaging & Final cleavage and assembly) Phóng thích virus – virus bắt đầu chu trình mới. Poliovirus (virus bệnh bại liệt, tấn công tb thần kinh vận động) Virus gồm bộ gene là RNA, vỏ capsid đa diện i) Virus sao chép RNA-RNA 5 Virus động vật có xương sống ii) Retrovirus virus có bộ gene RNA sinh sản qua trung gian là DNA (RNA-DNA-RNA) Đại diện của retrovirus: human immunodeficiency virus (HIV) tấn công tế bào miễn dòch T cell. Glycoprotein Màng bao Capsid RNA HIV chứa bộ gene gồm hai sợi RNA Glycoprotein gắnvào thụ thể Nhâ n Virus xâm nhập vào tb Bóc vỏ Tổng hợp DNA từ RNA DNA virus gắn vào DNA tb Phiên mã RNA virus Tổng hợp protein virus Chế biến và lắp ráp virus Phóng thích Tế bào chủ IX.2. Di truyền học vi khuẩn Ba cách truyền gene từ vi khuẩn cho (donor) sang vi khuẩn nhận (recipient): 1. Biến nạp (transformation): vi khuẩn sống (recipient) hấp thụ trực tiếp DNA của vi khuẩn chết (donor). 2. Tải nạp (transduction): DNA truyền từ donor sang recipient qua trung gian là phage. 3. Giao nạp hay tiếp hợp (conjugation): DNA qua pili truyền từ donor sang recipient (tiếp xúc trực tiếp giữa donor và recipient. 6 1. Biến nạp (transformation) Điều kiện xảy ra biến nạp: Tế bào nhận có khả năng dung nạp (competence), tức là điều kiện sinh lý phù hợp (ví dụ môi trường tăng trưởng) để tổng hợp competence factor, nhờ đó nhận DNA của donor một cách tự nhiên. DNA mạch kép, đoạn biến nạp =1/200 bộ gene vi khuẩn Các bước: Xâm nhập của DNA của donor vào recipient, một mạch DNA bò nuclease thủy phân. Bắt cặp (synapsis): đoạn DNA còn lại bắt cặp vói DNA tương đồng của recipient. Sao chép. Ứng dụng: công nghệ tái tổ hợp DNA 2. Tải nạp (transduction) Phage là nhân tố chuyển gene Phage lây nhiễm donor (A) Phage sao chép và cắt DNA tế bào chủ (A) Lắp ráp các bộ phận của phage, 1-2% phage mới vô tình chứa DNA của donor (A) Phage mang gene của A lây nhiễm tế bào nhận (B) Tái tổ hợp làm gene A gắn vào bộ gene B Tải nạp chung (generalized transduction): tải nạp mọi gene (A) (B) 3. Giao nạp hay tiếp hợp ở vi khuẩn (conjugation) a) Giới tính ở vi khuẩn Vi khuẩn có Sex pilus F + (đực), ngược lại - F - (cái) F factor = sex factor (fertility)=episome Plasmid: DNA vòng tồn tại độc lập với bộ gene có khả năng sao chép Episome : plasmid có thể gắn vào bộ gene Donor Recipient F + F - episome Sex pilus 1 µm b) Các trạng thaiù sinh lý của F factor F+ F + Hfr F factor tồn tại độc lập F factor gắn vào bộ gene vi khuẩn = Hfr (high frequency of recombination) Hfr F’ F factor tồn tại độc lập mang gene của donor 7 i) Cơ chế lai F + x F - F + F - F + F - F + F + F + F + Bắt cặp dùng sex pilus làm cầu nối giao nạp F factor sao chép và chuyển sang Kết quả F +  F + F -  F + Tần số lai 10 -6 (1 triệu tb sẽ có một tb lai). c) Tái tổ hợp ii) Cơ chế lai Hfr x F - Hfr F - Hfr F - Hfr F - Hfr F - Bắt cặp dùng sex pilus làm cầu nối giao nạp Một phần DNA sao chép và chuyển sang Tái tổ hợp Kết quả: Hfr  Hfr F - hiếm khi trở thành Hfr Tần số lai một số gene trên nhiễm sắc thể cao F’ F’F’ F’ F’ F - F’ F - iii) Cơ chế lai F ’ x F - Bắt cặp dùng sex pilus làm cầu nối giao nạp F factor chưa DNA nhiễm sắc thể sao chép và chuyển sang Kết quả F’  F ’ F -  F ’ Tần số lai gene trên F’ cao, tần số lai gene trên nhiễm sắc thể thấp. 4. Khả năng di chuyển chỗ của gene trên nhiễm sắc thể ở vi khuẩn (transposition) Các phần tử gene di động (transposable genetic elements): các đoạn DNA có khả năng di chuyển từ chỗ này sang chỗ khác trên bộ gene, còn được gọi là các gene nhảy (jumping gene). Tính chất: Di chuyển ngẫu nhiên: từ phân tử DNA này sang phân tử DNA khác hay chuyển chỗ trên một phân tử DNA. Không có khả năng tự sao chép (phải phụ thụôc vào một replicon). Sự chuyển chỗ được thực hiện do tái tổ hợp không tương đồng (site-specific, illegitimate hay nonhomologous recombination) nhờ enzyme transposase. Sự dời chỗ có thể kèm theo nhân đôi (duplication):  Dời chỗ bằng cách cắt khỏi vò trí cũ và dán vào vò trí mới (cut + paste)  Dời chỗ bằng cách nhân đôi, trình tự ban đầu nằm ở vò trí cũ, bản sao chuyển sang vò trí mới (copy + paste). 8 Các dạng phần tử di động 1. Trình tự gắn vào (insertion sequence – IS): là những phần tử gene di động không chứa những gene thông thường trừ những gene cần thiết cho sự dời chỗ (mã hóa transposase). IS với hai đầu có đoạn DNA đối xứng đảo ngược (inverted repeat) 2. Transposon (Tn): là những phần tử gene di động chứa một hoặc nhiều gene khác (thường là gene kháng thúôc ở vi khuẩn) ngoài những gene cần thiết cho việc dời chỗ. Cấu trúc của một phức hợp Tn với IS thuận hay đảo ngược ở hai đầu Vai trò: Gây đột biến: có thể làm mất hoạt tính của gene Thường plasmid chèn vào chromosome tại hay gần vò trí một IS trong chromosome. Nguyên nhân gây ra hiện tượng kháng nhiều loại thuốc ở vi khuẩn (multidrug resistance). Các phần tử gene di động và tương quan với các gene khác Một plasmid chứa nhiều Tn (chứa gene kháng thúôc) và các gene chòu trách nhiệm việc truyền các gene kháng thúôc (resistance transfer factor) = IS IX. 3. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng 1. Kỹ thuật di truyền – công nghệ tái tổ hợp DNA (DNA recombinant technology) Những năm 1972-1973: sinh học phân tử + di truyền học  Phương pháp tách và ghép gene in vitro tạo DNA tái tổ hợp.  Công cụ: enzyme cắt, nối, sao chép nucleic acid. Enzyme cắt: enzyme giới hạn (restriction enzyme) thuộc nuclease (exonuclease, endonuclease) Enzyme tổng hợp nucleic acid - sao chép: DNA polymerase, reverse transcriptase Enzyme nối: ligase. Cắt với cùng một loại enzyme giới hạn, BamHI Đầu dính Trộn Nôi với DNA ligase 9 Enzyme giới hạn (Restriction enzyme) Cắt DNA mạch kép tại các điểm hay đoạn nhận biết (recognition site hay sequence)- trình tự 4-6 nucleotide đối xứng đảo ngược (palindrome) Vai trò: bảo vệ tb trước sự xâm nhập của DNA lạ DNA của phage không được bảo vệ bò enzyme giới hạn cắt Bộ gene vi khuẩn Các điểm nhận biết được methyl hóa Enzyme giới hạn plasmid Đầu dính (sticky end, cohesive end): hoạt tính bắt cặp cao Nguyên tắc của công nghệ tái tổ hợp DNA 1. Thu nhận gene, 2. Tách chiết vector (plasmid) từ vi khuẩn, 3. Cắt DNA sinh vât và vector với cùng một enzyme giới hạn, 4. Trộn đều và dùng enzyme ligase tạo recombinant DNA (vector chứa DNA quan tâm), 5. Đưa vector chứa recombinant DNA vào tế bào vi khuẩn – biến nạp, 6. Tạo dòng vi khuẩn chứa gene quan tâm. Chọn clone chứa gene quan tâm. 1 2 3 4 Sản xuất insulin người bằng DNA tái tổ hợp RE cắt DNA người và plasmid Enzyme ligase nối gene người và plasmid 5 6 Tế bào chủ thu nhận plasmid tái tổ hợp Sản xuất insulin người bằng DNA tái tổ hợp Tạo dòng . 1 CHƯƠNG 9: DI TRUYỀN HỌC CỦA VIRUS VÀ VI KHUẨN PHẦN II: CƠ SỞ DI TRUYỀN HỌC TS.Nguyễn Hồi Hương IX. 1. Di truyền học của virus Virus = vật ký. trúc chính của virus 2 RNA virus như virus khảm thuốc lá, virus cúm, virus bại liệt chứa thơng tin di truyền trong RNA mạch đơn Thơng tin di truyền đi