Nghiên cứu đánh giá chức năng của gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF đối với sự phát triển rễ lúa luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐINH VĂN LÂM NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CHỨC NĂNG CỦA GEN CR7 MÃ HÓA YẾU TỐ PHIÊN MÃ THUỘC HỌ C2H2ZF ĐỐI VỚI SỰ PHÁT TRIỂN RỄ LÚA Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 0201 Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Thị Giang TS Nguyễn Văn Giang NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Hoàng Thị Giang TS Nguyễn Văn Giang Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa cơng bố hình thức trước Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Nếu phát gian lận nào, xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng kỷ luật Nhà nước Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Đinh Văn Lâm i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn cố gắng thân cịn có giúp đỡ nhiệt tình, q báu thầy cơ, anh (chị, em) đồng nghiệp Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc TS Hoàng Thị Giang, người trực tiếp, tận tình dạy tơi mặt học thuật phương pháp tiếp cận nghiên cứu suốt q trình thực tập hồn thiện luận văn thạc sĩ Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc TS Nguyễn Văn Giang có nhiều đóng góp khoa học cho tơi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thơm anh, chị (em) đồng nghiệp phịng LMI RICE-2, Viện Di truyền Nơng Nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt q trình thực tập Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình bạn bè ln ủng hộ, khích lệ tinh thần suốt trình học tập thực tập tốt nghiệp Hà Nội, ngày 29 tháng năm 2017 Tác giả luận văn Đinh Văn Lâm ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt .v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu .1 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Phần 2.Tổng quan tài liệu 2.1 Hình thái giải phẫu chức rễ lúa 2.1.1 Hình thái giải phẫu 2.1.2 Chức rễ lúa 2.2 Vai trò rễ lúa việc chống chịu với tác nhân phi sinh học 2.2.1 Ảnh hưởng stress phi sinh học phát triển lúa 2.2.2 Vai trò rễ lúa khả chống chịu hạn .9 2.2.3 Vai trò rễ lúa khả chống chịu mặn 10 2.3 Mạng lưới gen liên quan tới hình thành phát triển rễ lúa 12 Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.1.1 Vật liệu thực vật 16 3.1.2 Mồi vật tư khác .16 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.2.1 Nghiên cứu hoạt động promoter cr7 liên quan đến phát triển rễ lúa .17 3.2.2 Nghiên cứu vai trị gen cr7 hình thành rễ lúa 18 3.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu .18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Chọn lọc dòng lúa t0 siêu biểu gen cr7 kỹ thuật qpcr 18 3.4.2 Đánh giá phân ly di truyền cấu trúc gen chuyển hệ t1, t2 .20 iii 3.4.3 Đánh giá phát triển rễ dòng lúa siêu biểu gen cr7 24 3.4.4 Đánh giá hoạt động promoter cr7 thông qua biểu gen thị gus .24 Phần Kết thảo luận .26 4.1 Kết nghiên cứu hoạt động promoter cr7 thông qua biểu gen thị gus 26 4.1.1 Kết chọn lọc dòng lúa t1 mang copy cấu trúc gen procr7::gus 26 4.1.2 Kết chọn lọc dòng t2 mang đồng hợp tử cấu trúc gen procr7::gus 27 4.1.3 Kết đánh giá hoạt động promoter cr7 29 4.2 Kết nghiên cứu vai trị gen cr7 hình thành rễ lúa 36 4.2.1 Kết nghiên cứu dòng chuyển gen di truyền giống tc65 36 4.2.2 Kết nghiên cứu dòng chuyển gen di truyền thể đột biến crl1.42 Phần Kết luận kiến nghị 45 5.1 Kết luận .45 5.2 Kiến nghị 45 Tài liệu tham khảo 46 Phụ lục 50 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Anh ABA Abscisic Acid ARF Auxin Responsive Factor ARL1 Adventitious Rootless AUX/IAA Auxin/Indole-3-Acetic Acid cDNA Complementary DNA C2H2ZF Cys2 His2 Zinc Finger Protein CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide EC Electric Conductivity EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide HKT High-Affinity K+ Transporter LOB LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN MS Murashige and Skoog Medium PCR Polymerase Chain Reaction qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative Trait Locus TC65 TaiChung 65 TE Tris-EDTA buffer RT-PCR Realtime Polymerase Chain Reaction v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra chuyển gen 17 Bảng 3.2 Thành phần môi trường dinh dưỡng 1/2MS 20 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 22 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 22 Bảng 4.1 Đánh giá tỷ lệ phân ly di truyền hệ T1 dòng chuyển gen proCR7::GUS 27 Bảng 4.2 Kết chọn lọc dòng đồng hợp tử mang cấu trúc gen proCR7::GUS 28 Bảng 4.3 Kết chọn lọc dòng TC65 mang copy cấu trúc gen chuyển 38 Bảng 4.4 Kết chọn lọc dòng đồng hợp tử locus gen pUbi::CR7 TC65 chuyển gen hệ T2 39 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc hình thái rễ lúa Hình 2.2 Sự hình thành rễ lúa từ nốt thân Hình 2.3 Sơ đồ giải phẫu lát cắt ngang rễ lúa Hình 2.4 Con đường vận chuyển nước chất dinh dưỡng vào xylem rễ Hình 2.5 Phản ứng cảm ứng ABA điều kiện hạn Hình 2.6 Gen liên quan tới khả chống chịu mặn lúa 11 Hình 2.7 Đường truyền tín hiệu auxin cho phát sinh rễ phụ lúa 13 Hình 2.8 Mạng lưới gen điều hòa Crl1 15 Hình 3.1 Hình ảnh giống lúa đối chứng 16 Hình 4.1 Kết điện di kiểm tra chuyển gen T1 26 Hình 4.2 Sự biểu GUS dịng 2TR7 GUS 10.2.42 29 Hình 4.3 Sự biểu GUS dòng 2TR7 GUS 11.1.46 30 Hình 4.4 Sự biểu GUS dòng 2TR7 GUS 34.1.17 30 Hình 4.5 Biểu gen GUS rễ dòng 2TR7 GUS 10.2.42 11.1.46 32 Hình 4.6 Biểu gen GUS rễ dòng 2TR7 GUS 34.1.17 33 Hình 4.7 Lát cắt ngang phần gốc thân dòng 2TR7 GUS 10.2.42 34 Hình 4.8 Lát cắt ngang phần gốc thân lúa dịng 2TR7 GUS 11.1.46 34 Hình 4.9 Lát cắt ngang phần gốc thân lúa dòng 2TR7 GUS 34.1.7 35 Hình 4.10 Mức độ biểu gen CR7 lúa TC65 chuyển gen hệ T0 37 Hình 4.11 Kết điện di kiểm tra TC65 chuyển gen hệ T1 38 Hình 4.12 Sàng lọc dịng TC65 mang đồng hợp tử cấu trúc gen chuyển hygromycin 39 Hình 4.13 Số lượng rễ phụ dòng TC65 chuyển gen giai đoạn tuần tuổi 40 Hình 4.14 Khối lượng khơ rễ dòng TC65 chuyển gen giai đoạn tuần tuổi 41 Hình 4.15 Số nhánh dòng TC65 chuyển gen giai đoạn tuần tuổi 41 Hình 4.16 Mức độ biểu gen CR7 crl1 chuyển gen hệ T0 42 Hình 4.17 Kiểu hình rễ dòng lúa crl1 chuyển gen sau tuần tuổi 43 Hình 4.18 Mức độ biểu gen CR7 crl1 chuyển gen hệ T1 44 Hình 4.19 Số lượng rễ phụ dòng lúa crl1 chuyển gen hệ T1 44 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đinh Văn Lâm Tên luận văn: “Nghiên cứu đánh giá chức gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF liên quan tới phát triển rễ lúa” Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62 42 0201 Tên sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Chọn lọc dòng lúa chuyển gen làm sáng tỏ vai trị gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã họ C2H2ZF hình thành phát triển rễ dòng lúa chuyển gen Phương pháp nghiên cứu Vật liệu Các dòng lúa chuyển gen cdsCR7 vào giống Taichung 65 dạng đột biến crl1 hệ T0, T1, T2 kiểm soát promoter Ubiquitin, ký hiệu pUBi::cdsCR7 Các dòng lúa chuyển cấu trúc gen chứa promoter gen CR7 gắn với gen thị GUS, ký hiệu proCR7::GUS chuyển vào TC65 Phương pháp nghiên cứu Đánh giá mức độ biểu gen dòng lúa chuyển gen kỹ thuật qPCR Phương pháp tế bào học đánh giá hoạt động promoter gen CR7 dựa vào gen thị GUS Chọn lọc dòng lúa chuyển gen PCR, đánh giá biểu GUS khả kháng Hygromycine môi trường nuôi cấy Đánh giá kiểu hình rễ dịng lúa chuyển gen ống cát Kết kết luận Dựa vào mức độ phân ly di truyền hệ T1 chọn lọc dòng mang copy cấu trúc gen chuyển proCR7::GUS 1TR7 GUS 10.2, 11.1, 16.3, 29.4, 34.1 39.1 Ở hệ T2 sàng lọc thành cơng dịng đồng hợp tử độc lập gồm: 2TR7 GUS 10.2.42, 11.1.46 34.1.17 Trong dòng đồng hợp tử thu được, hoạt động promoter CR7 chủ yếu đánh giá dựa biểu tương đồng hai dòng 2TR7 GUS 10.2.42 11.1.46 Promoter CR7 hoạt động giai đoạn sớm từ giai đoạn nảy mầm đến viii thật hoạt động chủ yếu vị trí gốc thân mơ phân sinh rễ Trong gốc thân promoter CR7 hoạt động phần bó mạch thân cây, vùng hình thành rễ phụ phôi nốt bao mầm vùng mô phân sinh cho phát sinh mầm rễ phụ nốt gốc thân Ở rễ hoạt động promoter CR7 tập trung vào vùng mô phân sinh đầu rễ Nhận định gen CR7 có vai trị định q trình hình thành rễ phụ phơi rễ phụ tham gia vào phát triển rễ lúa Phân tích phương pháp qPCR khẳng định gen CR7 biến nạp thành công biểu mạnh di truyền TC65 crl1 Đã chọn lọc dòng TC65 mang copy cấu trúc gen pUbi::cdsCR7 1TCR7 TC65 3.2, 11.1 12.1 Ở hệ T2 chọn lọc dòng TC65 đồng hợp tử độc lập 2TCR7 TC65 11.1.6 12.1.17 Đánh giá bước đầu cho thấy giai đoạn tuần tuổi trồng bầu cát, siêu biểu gen CR7 TC65 làm tăng số lượng rễ phụ dòng đồng hợp tử 2TCR7 TC65 12.1.17, nhiên khơng có khác biệt đáng kể khối lượng khô rễ số nhánh Ở giai đoạn tuần tuổi in vitro gen CR7 siêu biểu crl1 giúp khắc phục tượng đột biến làm khơi phục hình thành rễ phụ Đã chọn dòng tiềm cho bước nghiên cứu 1TCR7 CRL1 11.3 94.3 ix 4.2.2.2 Kết đánh giá mức độ biểu phát triển rễ lúa crl1 chuyển gen hệ T1 Năm dịng T0 có mức biểu gen CR7 khác chọn để đánh giá hình thái phát triển rễ khả sinh trưởng giai đoạn mạ, gồm TCR7 CRL1 4.1, 4.3, 11.3, 56.2 94.3 Hạt T0 gieo ống nghiệm chứa môi trường 1/2MS, ngày sau loại bỏ agar bổ sung nước ngập rễ để kích thích phát sinh rễ phụ Theo dõi ghi lại số lượng rễ phụ thời điểm 21 ngày tuổi Quan sát thí nghiệm từ nảy mầm đến tuần tuổi cho thấy đột biến chuyển gen sinh trưởng phát triển bình thường Sau khoảng thời gian 10 ngày lúa chuyển gen bắt đầu phát sinh thêm số rễ phụ (Hình 4.17) Sau hai tuần tuổi ghi nhận crl1 chuyển gen có tốc độ sinh trưởng vượt trội so với đột biến crl1 khơng chuyển gen Hình 4.17 Kiểu hình rễ dòng lúa crl1 chuyển gen sau tuần tuổi Sau đánh giá kiểu hình rễ, T1 đưa trồng nhà lưới Đến sinh trưởng phát triển tốt, tiến hành thu mẫu non để tách chiết mRNA tổng số đánh giá mức độ biểu gen CR7 qPCR Kết cho thấy, T1 phân ly từ dịng T0 có mức biểu gen CR7 khác (Hình 4.18) Nguyên nhân trạng thái kiểu gen cấu trúc gen chuyển pUbi::cdsCR7 T1 khác nhau: đồng hợp tử, dị hợp tử không mang gen (Null sister) Một số có mức độ biểu gen CR7 cao vượt trội so với khác dòng 11.3.1, 56.2.5 Một số có mức biểu gen CR7 tương đương đối chứng crl1 Null sister khơng mang cấu trúc gen chuyển 43 Hình 4.18 Mức độ biểu gen CR7 crl1 chuyển gen hệ T1 (* mức ý nghĩa 0,05, ** mức ý nghĩa 0,01, *** mức ý nghĩa 0,001) Kết đánh giá số lượng rễ phụ 21 ngày tuổi biểu diễn Hình 4.19 Trong dịng chuyển gen đem phân tích số lượng rễ phụ trung bình dịng 1TCR7 CRL1 11.3 94.3 1,5 3,2 rễ/cây, tăng cao số lượng rễ phụ trung bình Null sister dòng 11.3 1,0 rễ/cây crl đối chứng (0,14 rễ/cây) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với trị số p dòng nhỏ 0,05 0,01 Hình 4.19 Số lượng rễ phụ dòng lúa crl1 chuyển gen hệ T1 Như bước đầu kết luận gen CR7 siêu biểu đột biến crl1 giúp khắc phục tượng đột biến làm khơi phục hình thành rễ phụ Đã chọn dòng tiềm cho bước nghiên cứu 11.3 94.3 44 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đánh giá hoạt động promoter gen CR7 dòng đồng hợp tử chọn lọc 2TR7 GUS 10.2.42, 11.1.46 34.1.17 cho thấy: promoter CR7 hoạt động giai đoạn sớm từ giai đoạn nảy mầm đến thật hoạt động chủ yếu vị trí gốc thân mơ phân sinh rễ Trong gốc thân promoter CR7 hoạt động phần bó mạch thân cây, vùng hình thành rễ phụ phôi nốt bao mầm vùng mô phân sinh cho phát sinh mầm rễ phụ nốt gốc thân Ở rễ hoạt động promoter CR7 tập trung vào vùng mô phân sinh đầu rễ Đối với TC65 siêu biểu gen CR7, đánh giá kiểu hình rễ dịng đồng hợp tử 2TCR7 TC65 11.1.6 12.1.17 cho thấy giai đoạn tuần tuổi trồng bầu cát gen CR7 làm tăng số lượng rễ phụ dòng đồng hợp tử 2TCR7 TC65 12.1.17, nhiên khơng có khác biệt đáng kể khối lượng khô rễ số nhánh Ở giai đoạn tuần tuổi in vitro gen CR7 siêu biểu crl1 giúp khắc phục tượng đột biến làm khơi phục hình thành rễ phụ Đã chọn dòng tiềm cho bước nghiên cứu 1TCR7 CRL1 11.3 94.3 5.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục đánh giá hoạt động promoter CR7 dòng đồng hợp tử chọn lọc để xác định mô hình hoạt động chung promoter dịng Để tăng độ tin cậy kết đánh giá kiểu hình rễ dịng chuyển gen TC65 cần bố trí thí nghiệm lặp lại bổ sung thí nghiệm đánh giá phát triển rễ giai đoạn tuần tuổi Cần tiếp tục chọn lọc dòng crl1 chuyển gen thực bước đánh giá kiểu hình rễ bầu cát 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang (2003) Cơ sở di truyền tính chống chịu thiệt hại mơi trường lúa, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, 193tr Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng (2006) Giáo trình Sinh lý thực vật, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, 393tr Tài liệu Tiếng Anh: Ana Paez-Garcia, Christy M Motes, Wolf-Rüdiger Scheible, Rujin Chen, Elison B Blancaflor, Maria J Monteros (2015) Root Trait and Phenotyping Strategies for Plant Improvement, Plants (Basel), 4(2).pp 334-355 Bailey-Serres J and Voesenek LACJ (2008) Flooding stress: Acclimations and genetic diversity, Annu Rev Plant Biol, 59).pp 313–339 Comas Louise H., Steven R Becker, Von Mark V Cruz, Patrick F Byrne, David A Dierig (2013) Root traits contributing to plant productivity under drought, Front Plant Sci Coudert Y., Le V A., Adam H., Bes M., Vignols F., Jouannic S., Guiderdoni E., Gantet P (2015) Identification of CROWN ROOTLESS1-regulated genes in rice reveals specific and conserved elements of postembryonic root formation, New Phytol, 206(1) ).pp 243-254 Coudert Yoan, Bès Martine, Le Thi Van Anh, Pré Martial, Guiderdoni Emmanuel, Gantet Pascal (2011) Transcript profiling of crown rootless1 mutant stem base reveals new elements associated with crown root development in rice, BMC Genomics, 12).pp 387 Courtois Brigitte, Ahmadi Nourollah, Khowaja Farkhanda, Price Adam H., Rami Jean-Franỗois, Frouin Julien, Hamelin Chantal, Ruiz Manuel (2009) Rice Root Genetic Architecture: Meta-analysis from a Drought QTL Database, Rice, 2(2-3) ).pp 115-128 Cruz R.P., Sperotto R.A., Cargnelutti D., Adamski J.M., Terra T.F., Fett J.P (2013) Avoiding damage and achieving cold tolerance in rice plants, Food Energy Sec., 2).pp 96–119 10 Fujino K., Sekiguchi H., Sato T., Kiuchi H., Nonoue Y., Takeuchi Y., Ando T., Lin SY., Yano M (2004) Mapping of quantitative trait loci controlling low- 46 temperature germinability in rice (Oryza sativa L.), Theor Appl Genet., 108).pp 794–799 11 Fukao T And Bailey-Serres J (2004) Plant responses to hypoxia-is survival a balancing act?, Trends Plant Sci., 9).pp 449–456 12 Geldner N., Anders N., Wolters H., Keicher J., Kornberger W., Muller P., Delbarre A., Ueda T., Nakano A., Jürgens G (2003) The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, an auxin-dependent plant growth, Cell, 112).pp 219–230 13 Ghosh Bhaswati, Nasim Ali Md and Saikat Gantait (2016) Response of Rice under Salinity Stress: A Review Update, J Res Rice, 4(2): 167 14 Gray W.M., Kepinski S., Rouse D., Leyser O., Estelle M (2001) Auxin regulates SCFTIR1-dependent degradation of Aux/IAA proteins, Nature, 414).pp 271–276 15 Gregory P J and Kirkegaard J A (2017) Growth and Function of Root Systems, Encyclopedia of Applied Plant Sciences, 1).pp 230-237 16 Hagen G and Guilfoyle T (2002) Auxin-responsive gene expression: Genes, promoters and regulatory factors, Plant Mol Biol, 46).pp 373–385 17 Hasegawa P.M (2013) Sodium (Na+) homeostasis and salt tolerance of plants, Environmental and Experimental Botany, 92).pp 19-31 18 Inukai Y., Sakamoto T., Ueguchi-Tanaka M., Shibata Y., Gomi K., Umemura I., Hasegawa Y., Ashikari M., Kitano H., Matsuoka M (2005) Crown rootless1, which is essential for crown root formation in rice, is a target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in auxin signaling, Plant Cell, 17(5) ).pp 1387-1396 19 Jain M., Kaur N., Garg R., Thakur J.K., Tyagi A.K., Khurana J.P (2005) Structure and expression analysis of early auxin-responsive Aux/IAA gene family in rice (Oryza sativa), Funct Integr Genomics, 6).pp 47-59 20 Jena K.K., Kim S.M, Suh J.P., Yang C.I., Kim Y.J (2012) Identification of cold-tolerant breeding lines by Quantitative Trait Loci associated with cold tolerance in rice, Crop Sci, 51).pp 517–523 21 Ji-Ping Gao, Dai-Yin Chao, Hong-Xuan Lin (2007) Understanding Abiotic Stress Tolerance Mechanisms: Recent Studies on Stress Response in Rice, Journal of Integrative Plant Biology, 49(6).pp 742-750 47 22 Kitomi Yuka, Atsushi Ogawa, Hidemi Kitano, Yoshiaki Inukai (2008) CRL4 regulates crown root formation through auxin transport in rice, Plant Root, 2).pp 19-28 23 Liscum E and Reed JW (2002) Genetics of AUX/IAA and ARF action in plant growth and development, Plant Mol Biol, 49).pp 387-400 24 Liu S., Wang J., Wang L., Wang X., Xue Y., Wu P., Shou H (2009) Adventitious root formation in rice requires OsGNOM1 and is mediated by the OsPINs family, Cell Res, 19).pp 1110–1119 25 Menguer P.K., Sperotto R.A., Ricachenevsky F.K (2017) A walk on the wild side: Oryza species as source for rice abiotic stress tolerance, Genet Mol Biol., 40).pp 238-252 26 Mickelbart M.V., Hasegawa P.M., Bailey-Serres J (2015) Genetic mechanisms of abiotic stress tolerance that translate to crop yield stability, Nat Rev Genet, 16(4).pp 237-251 27 Munns R and Tester M (2008) Mechanisms of salinity tolerance, Annu Rev Plant Biol., 59).pp 651-681 28 Niroula R.K , Pucciariello C., Ho V.T., Novi G., Fukao T., Perata P (2012) SUB1A-dependent and -independent mechanisms are involved in the flooding tolerance of wild rice species, Plant J., 72.pp 282–293 29 Rebouillat J., Dievart A., Verdeil J L., Escoute J., Giese G., Breitler J C., Gantet P., Espeout S., Guiderdoni E., Périn C (2008) Molecular Genetics of Rice Root Development, Rice, 2(1) pp 15-34 30 Richter S., Anders N., Wolters H., Beckmann H., Thomann A., Heinrich R., Schrader J., Singh M.K., Geldner N., Mayer U., Jürgens G (2010) Role of the GNOM gene in Arabidopsis apical-basal patterning – from mutant phenotype to cellular mechanism of protein action, Eur J Cell Biol, 89.pp 138–144 31 Shrivastava Pooja and Kumar Rajesh (2015) Soil salinity: A serious environmental issue and plant growth promoting bacteria as one of the tools for its alleviation, Saudi J Biol Sci, 22(2).pp 123-131 32 Singh Chandra Mohan, Binod Kumar, Suhel Mehandi, Kunj Chandra (2012) Effect of Drought Stress in Rice: A Review on Morphological and Physiological Characteristics, Trends in Biosciences, (5).pp 261-265 48 33 Sumithra Muthayya, Jonathan D Sugimoto, Scott Montgomery, Glen F Maberly (2014) An overview of global rice production, supply, trade, and consumption, Annals of The New York Academy of Sciences, 1324.pp 7-14 34 Tiwari S.B., Wang X.J., Hagen G., Guilfoyle T.J (2001) Aux/IAA proteins are active repressors and their stability and activity are modulated by auxin, Plant Cell, 13.pp 2809–2822 35 Ulrich Luttge, Francisco M Cánovas, Rainer Matyssek (2016) Progress in Botany 77, Springer International Publishing 36 Wachsman G., Sparks E.E., Benfey P.N (2015) Genes and networks regulating root anatomy and architecture, New Phytol, 208(1).pp 26-38 37 Wu W And Cheng S (2014) Root genetic research, an opportunity and challenge to rice improvement, Field Crops Research, 165.pp 111-124 38 Yan-Bo Jia, Xiao-E Yang, Ying Feng, Ghulam Jilani (2008) Differential response of root morphology to potassium deficient stress among rice genotypes varying in potassium efficiency, J Zhejiang Univ Sci B, 9(5) pp 427-434 39 Zenser N., Ellsmore A., Leasure C., Callis J (2001) Auxin modulates the degradation rate of Aux/IAA proteins, Proc Natl Acad Sci USA, 98.pp 11795–11800 40 Zhang Q., Chen Q., Wang S., Hong Y., Wang Z (2014) Rice and cold stress: Methods for its evaluation and summary of cold tolerance-related quantitative trait loci, Rice, 7.pp 24–24 41 Zhong-Hai Ren, Gao J.P., Li L.G., Cai X.L., Huang W., Chao D.Y., Zhu M.Z., Wang Z.Y., Luan S., Lin H.X (2005) A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter, Nature Genetics, 37.pp 1141-1146 49 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phân tích phân ly di truyền hệ T1 dòng chuyển gen TR7 GUS theo phân phối χ2 Dòng TR7 GUS Tổng số (cây T1) + 10.1 11.1 16.3 21.2 29.4 34.1 39.1 Số Số lý thực tế thuyết (O) (E) 33 38.25 (O-E) -5.25 (O2 E) /E χ2 0.72 51 2.88 - 18 12.75 5.25 2.16 + 35 36.75 -1.75 0.08 49 0.33 - 14 12.25 1.75 0.25 + 12 12.75 -0.75 0.04 17 0.17 - 4.25 0.75 0.13 + 25 18.75 6.25 2.08 25 8.33 - 6.25 -6.25 6.25 + 19 18.75 0.25 0.00 25 0.01 - 6.25 -0.25 0.01 + 19 18 0.06 24 0.23 - -1 0.17 + 21 23.25 -2.25 0.22 - 10 7.75 2.25 0.65 31 0.87 50 Phụ lục 2: Phân tích phân ly di truyền hệ T1 dòng chuyển gen TCR7 TC65 theo phân phối χ2 Dòng TCR7 TC65 Tổng số (cây T1) 3.2 20 11.1 24 12.1 16 Số thực tế (O) Số lý thuyết (O-E) (E) (O2 E) /E + 16 15 0.07 - -1 0.2 + 16 18 -2 0.22 - 0.67 + 12 -3 0.75 - 2.25 51 χ2 0,27 0,89 3,00 Phụ lục 3: Kết phân tích qPCR đánh giá biểu gen CR7 lúa chuyển gen TCR7 TC65 hệ T0 № Name of Sample Samples TC65 WT TCR7 TC65 3.2 TCR7 TC65 3.3 TCR7 TC65 4.1 TCR7 TC65 9.1 TCR7 TC65 11.1 TCR7 TC65 11.2 TCR7 TC65 12.1 TCR7 TC65 12.2 10 TCR7 TC65 13.1 11 TCR7 TC65 13.2 12 TCR7 TC65 22.1 13 TCR7 TC65 27.1 Ct 24.33 24.08 18.7 19.19 15.7 16.94 28.09 28.9 29.53 30.62 18.26 18.77 18.47 19.52 17.96 18.72 18.73 19.93 21.64 20.26 18.65 19.15 16.37 16.69 17.12 17.59 Ref ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT Ct Eref Etarget 19.63 19.25 23.24 21.75 20.47 21.04 21.5 21.91 21.38 20.61 21.86 21.8 21.32 20.55 20.13 21.2 21.55 21.01 21.12 21.32 19.73 21.08 21.01 20.67 20.1 20.57 1196851.274 912810.7015 15696581.92 5425704.555 2178359.366 3270534.409 4539924.178 6081307.561 4167666.696 2407009.202 5868342.593 5622605.976 3993145.817 2306215.786 1709445.543 3665722.198 4704680.204 3201325.379 3462494.849 3993145.817 1285296.14 3365146.14 3201325.379 2512207.806 1673271.312 2339335.675 48703313.03 40603728.82 810299.2931 1157366.558 91355.44211 225184.0636 750943052.8 1353764071 2140939039 4731643087 588326.6318 852635.4478 685444.4757 1471435.207 472963.2584 822176.1358 828179.6797 1982845.997 6880155.845 2520920.785 781352.3862 1124170.321 148742.3214 187734.9216 256691.9884 361341.9439 52 Ratio = Eref/Etarget 0.0246 0.0225 19.3713 4.6880 23.8449 14.5238 0.0060 0.0045 0.0019 0.0005 9.9746 6.5944 5.8256 1.5673 3.6143 4.4586 5.6807 1.6145 0.5033 1.5840 1.6450 2.9934 21.5226 13.3817 6.5186 6.4740 0.0295 0.0187 13.5623 6.6959 9.6737 35.8001 0.0034 0.0081 0.0009 0.0011 6.8826 9.5569 2.7138 3.3646 2.0792 7.7505 2.3727 3.8655 1.3735 0.5804 1.1433 4.3068 17.0524 16.8897 4.6307 9.1134 Mean ratio STDEV 0.0 0.00 11.1 6.71 21.0 11.51 0.0 0.00 0.0 0.00 8.3 1.76 3.4 1.80 4.5 2.40 3.4 1.79 1.0 0.55 2.5 1.42 17.2 3.34 6.7 1.84 Phụ lục 4: Kết phân tích qPCR đánh giá biểu gen CR7 lúa chuyển gen 1TCR7 CRL1 hệ T0 № Name of Samples Mean Ct CRL1 WT TCR7 CRL1 4.1 TCR7 CRL1 4.3 TCR7 CRL1 6.4 TCR7 CRL1 8.3 TCR7 CRL1 11.3 TCR7 CRL1 28.2 TCR7 CRL1 51.3 TCR7 CRL1 53.3 32.51 Ref Ct Eref Etarget Ratio = Eref/Etarget 27.4 304695883.9 18715262841 0.0163 0.0111 27.56 341513136.9 27520746750 0.0124 0.0182 24.47 25.33 69651767.38 53925521.45 1.2916 0.0025 24.31 25.42 74267508.73 47999763.55 1.5472 1.3772 24.55 26.68 182361378.7 57157336.27 3.1905 3.7992 24.18 26.69 183666169.5 43667964.96 4.2060 3.2133 24.54 39657406.47 339781185.6 0.1167 0.1410 24.45 37192690.28 281220539.8 0.1323 0.1095 23.62 20580909.1 269208530.1 0.0764 0.0346 23.73 22259934.04 594971952.7 0.0374 0.0827 24.17 30462191.69 29912889.97 1.0184 1.6341 24.12 29395417.87 18641362.38 1.5769 0.9827 24.79 47394926.11 29696048.93 1.5960 2.2467 24.9 51261483.32 21095635.25 2.4300 1.7262 24 26985099.16 17275840781 0.0016 0.0020 24.04 27765738.23 13392127393 0.0021 0.0016 23.99 26793393.14 5905334.506 4.5372 7.5503 24.64 42588007.84 3548667.11 12.0011 7.2118 33.04 27 26.74 26.68 27.77 23.66 23.01 23.65 23.18 32.4 32.05 21.43 20.73 ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT 53 ratio STDEV 0.0 0.00 1.1 0.71 3.6 0.49 0.1 0.01 0.1 0.03 1.3 0.35 2.0 0.40 0.0 0.00 7.8 3.09 10 TCR7 CRL1 56.2 11 TCR7 CRL1 82.5 12 TCR7 CRL1 92.1 13 TCR7 CRL1 92.2 14 TCR7 CRL1 92.3 15 TCR7 CRL1 94.3 16 TCR7 CRL1 94.4 22.98 22.7 21.46 20.95 24.75 24.44 22.44 22.3 23.69 24.08 21.71 21.82 25.11 24.94 ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT 24.24 32021027.12 18238895.65 1.7556 2.1523 24.18 30680147.86 14877393.22 2.0622 1.6821 24.46 37458802.99 6035643.967 6.2063 8.9945 24.99 54658522.01 4164652.191 13.1244 9.0560 26.18 127678503.3 66109831.47 1.9313 2.4199 26.47 157003933 52761270.27 2.9757 2.3749 24.07 28366002.05 12313302.59 2.3037 2.5507 24.45 37192690.28 11120868.46 3.3444 3.0205 25.36 71157559.71 30572959.7 2.3275 1.7525 25.41 73739901.69 40603728.82 1.8161 2.4119 26.32 141080180.5 7239627.147 19.4872 17.9884 26.49 159258688.5 7842832.464 20.3063 21.9982 23.85 24248199.31 85904393.19 0.2823 0.3194 23.83 23904897.71 75910248.95 0.3149 0.2783 54 1.9 0.23 9.3 2.85 2.4 0.43 2.8 0.47 2.1 0.34 19.9 1.67 0.3 0.02 Phụ lục 5: Kết phân tích qPCR đánh giá biểu gen CR7 lúa chuyển gen 1TCR7 CRL1 hệ T1 № Name of Sample Samples CRL1 WT 1TCR7 CRL1 4.1.8 1TCR7 CRL1 4.3.1 1TCR7 CRL1 11.3.1 1TCR7 CRL1 11.3.3 1TCR7 CRL1 11.3.5 1TCR7 CRL1 11.3.6 1TCR7 CRL1 11.3.9 1TCR7 CRL1 56.2.1 10 1TCR7 CRL1 56.2.4 Ct 25.38 25.75 24.37 24.89 23.57 22.71 22.61 22.63 22.92 21.76 23.6 23.35 27.92 28.73 24.65 24.94 24.4 28.54 21.5 21.45 Ref ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT Ct Eref Etarget Ratio = Eref/Etarget 22.8 11470116.19 104550801.8 0.1097 0.0838 22.82 11634840.14 136847351.1 0.0850 0.1113 23.3 16382602.77 50141499.64 0.3267 0.2238 23.39 17468258.74 73198452.29 0.2386 0.3484 22.37 8441640.348 28016962.09 0.3013 0.5633 23.04 13610656 14986028.19 0.9082 0.4858 25.15 61263063.58 13934439.71 4.3965 4.3330 25.59 83837049.26 14138681.71 5.9296 6.0165 23.9 25128178.1 17459842.34 1.4392 3.3469 24.24 32021027.12 7507834.958 4.2650 1.8340 24.47 37726819.73 28635195.52 1.3175 1.5803 23.75 22579612.08 23873031.24 0.9458 0.7885 23.46 18362158.33 663578100.8 0.0277 0.0153 23.9 23.76 25128178.1 1196266731 0.0210 0.0379 22741168.6 61470821.28 0.3700 0.2996 23.48 18625859.87 75910248.95 0.2454 0.3030 24.48 37996754.13 51247941.92 0.7414 0.0365 24.77 46723917.36 1041822324 0.0448 0.9117 23.37 17220946.31 6213873.78 2.7714 2.8740 23.44 18102190.23 5991891.078 3.0211 2.9132 55 Mean ratio STDEV 0.1 0.02 0.3 0.06 0.6 0.25 5.2 0.93 2.7 1.32 1.2 0.36 0.0 0.01 0.3 0.05 0.4 0.46 2.9 0.10 11 1TCR7 CRL1 56.2.5 12 1TCR7 CRL1 56.2.6 13 1TCR7 CRL1 56.2.7 14 1TCR7 CRL1 56.2.8 15 1TCR7 CRL1 56.2.9 16 1TCR7 CRL1 56.2.10 17 1TCR7 CRL1 56.2.11 18 1TCR7 CRL1 94.3.1 19 1TCR7 CRL1 94.3.2 20 1TCR7 CRL1 94.3.4 21 1TCR7 CRL1 94.3.5 22 1TCR7 CRL1 94.3.7 23 1TCR7 CRL1 94.3.8 20.95 20.85 22.47 21.81 27.12 27.57 27.32 26.3 27.84 28.33 24.99 27.16 22.31 22.13 23.13 23.23 24.44 24.15 23.67 22.91 23.14 23.09 21.69 22.3 22.49 22.58 ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT ACT 23.01 13322635.7 4164652.191 3.1990 3.4404 23.42 17845902.71 3872413.297 4.6085 4.2851 23.62 20580909.1 12585012.82 1.6354 2.6433 23.53 19301801.26 7785979.115 2.4790 1.5337 23.62 23.4 23.65 23.98 23.05 22.81 23.3 23.25 23.23 23.35 23.95 23.67 23.36 23.4 23.42 23.67 24.65 24.28 22.65 22.89 22.86 22.92 20580909.1 370779546.4 0.0555 0.0400 17593243.67 21025845.05 26603049.03 13708039.88 11552184.57 16382602.77 15808890.55 15585071.15 16977135.28 26040091.74 21327800.17 17098606.24 17593243.67 17845902.71 21327800.17 42892723.91 32947348.15 10306786.79 12230227.41 11971418.89 12494631.08 56 514401734.4 428854368 204183237.4 626057780.9 894210750.5 78722510.04 381728497.2 11202073.22 9827063.106 20342020.63 21877169.16 52761270.27 42725174.27 30131314.39 17333274.48 20490558.4 19758559.39 7135046.256 11120868.46 12769475.8 13633595.37 0.0342 0.0490 0.1303 0.0219 0.0129 0.2081 0.0414 1.3913 1.7276 1.2801 0.9749 0.3241 0.4118 0.5923 1.2305 2.0933 1.6675 1.4445 1.0998 0.9375 0.9165 0.0474 0.0409 0.0620 0.0671 0.0185 0.0183 0.2008 0.0408 1.5155 2.6498 1.0485 0.7816 0.3334 0.4177 0.7078 2.4746 1.6079 0.5216 1.7141 1.0765 0.9785 3.9 0.67 2.1 0.57 0.0 0.01 0.1 0.04 0.0 0.02 0.1 0.10 1.2 0.76 1.5 0.79 0.5 0.22 0.7 0.35 2.0 0.41 1.2 0.51 1.0 0.07 Phụ lục 6: Một số hình ảnh thí nghiệm đánh giá kiểu hình rễ lúa nhà lưới 57 ... 13 gen gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF mà chúng tơi quan tâm Để xác định xác chức gen CR7 phát triển rễ phụ lúa, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu đánh giá chức gen CR7 mã hóa yếu tố phiên. .. Đinh Văn Lâm Tên luận văn: ? ?Nghiên cứu đánh giá chức gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã thuộc họ C2H2ZF liên quan tới phát triển rễ lúa? ?? Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62 42 0201 Tên sở đào tạo: Học... phiên mã thuộc họ C2H2ZF liên quan đến phát triển rễ lúa? ?? 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Chọn lọc dòng lúa chuyển gen làm sáng tỏ vai trị gen CR7 mã hóa yếu tố phiên mã họ C2H2ZF hình thành phát