Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ mơi trường lỏng LỜI NĨI ĐẦU Enzyme giữ vai trị quan trọng ngành cơng nghệ sinh học đại, việc sản xuất ứng dụng chế phẩm enzym phát triển mạnh mẽ Nước ta nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm thuận lợi cho phát triển vi sinh vật Vì ngành cơng nghiệp sản xuất chế phẩm enzym ứng dụng chúng nước ta phát triển, hệ enzyme amylase số hệ enzyme sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác Với đề tài: “Sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng”, thuộc môn Công nghệ Lên Men Thực Phẩm, đề tài thú vị phù hợp với xu phát triển ngành công nghiệp enzyme, nhờ dẫn tận tình quý thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, mà đặc biệt thầy Lê Văn Việt Mẫn, hồn thành đề tài Trong q trình thực đề tài, khơng tránh khỏi thiếu sót, kính mong góp ý thầy để chúng tơi có thêm kinh nghiệm cho báo cáo tiếp theo, luận văn sau Trang Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng MỤC LỤC GIỚI THIỆU CHUNG ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI 2.1 Định nghĩa 2.2 Phân loại 2.2.1 α – amylase 2.2.2 β – amylase 2.2.3 Glucoamylase 2.2.4 Một số amylase khác 10 NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE 12 3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật 12 3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật 13 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG 13 A Sơ đồ quy trình cơng nghệ 14 B Giải thích quy trình 15 4.1 Chọn giống vi sinh vật 15 4.2 Nhân giống vi sinh vật 16 4.2.1 Môi trường nhân giống 16 4.2.2 Phương pháp điều kiện nhân giống 16 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nhân giống 17 4.2.4 Thiết bị nhân giống 17 4.3 Chuẩn bị môi trường lên men 18 4.4 Tiệt trùng môi trường 19 4.4.1 Mục đích 19 4.4.2 Những biến đổi trình tiệt trùng 19 4.4.3 Thiết bị 19 4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme 20 4.5.1 Mục đích 20 4.5.2 Các biến đổi xảy trình lên men 20 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 21 4.5.4 Thiết bị 22 4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô 24 4.7 Tách tinh enzyme 25 4.7.1 Siêu lọc 25 4.7.2 Tinh enzyme phương pháp lọc gel 27 Trang Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 4.8 Sấy 32 CHẾ PHẨM AMYLASE 34 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase công nghiệp 34 5.2 Các dạng chế phẩm enzyme 35 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại 35 THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 38 α – amylase Bacillus subtilis 38 6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương pháp nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải công nghiệp thực phẩm 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Trang Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng GIỚI THIỆU CHUNG Hệ enzyme amylase hệ enzyme sử dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, y học nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác Những nghiên cứu thực nghiệm enzyme nói chung amylase nói riêng năm 1811 – 1814 Những nghiên cứu gắn liền với tên tuổi nhà bác học Nga – Viện sĩ K.S Kirhof Ông nghiên cứu trình phân giải tinh bột tác dụng dịch chiết malt nảy mầm nhận thấy malt có chứa chất phân giải tinh bột thành đường 19 năm sau, tức vào năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp Payen Persoz tách chất phân giải tinh bột thành đường từ dịch chiết malt, hai ơng dùng rượu để kết tủa thu enzyme dạng bột, đồng thời đặt tên diastase Sau này, theo đề nghị Duclo, enzyme phân giải tinh bột gọi amylase Các enzyme amylase có nước bọt, dịch tiêu hóa người động vật, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men vi khuẩn Hiện nay, người ta chủ yếu sản xuất amylase từ vi khuẩn nấm mốc Những nghiên cứu amylase vi sinh vật đặt móng cho việc sản xuất chế phẩm amylase sở khoa học để áp dụng chúng sản xuất đời sống, đồng thời mở phương hướng mới, triển vọng to lớn kinh tế quốc dân ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI 2.1 Định nghĩa Amylase thuộc nhóm hydrolase, phân giải liên kết glycoside, enzyme làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành phân tử có chiều dài mạch ngắn dextrin, oligosaccharide, glucose, … 2.2 Phân loại Dựa theo tính chất cách thức tác dụng lên tinh bột, chia amylase thành loại sau: Trang Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 2.2.1 α – amylase Hình 2.2.1.1: Cấu trúc khơng gian α – amylase  Đặc điểm hoạt động:  α – amylase (α – 1,4 – glucan – 4glucanohydrolase) endo enzyme Nó xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α – 1,4 – glycoside nằm bên phân tử chất amylase, amylopectin glycogen  α – amylase tìm thấy thể động vật, thực vật tế bào vi sinh vật  Tùy theo nguồn gốc mà phân tử lượng enzyme thay đổi, thường dao động khoảng 45 – 60kDa Có số trường hợp đặc biệt α – amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130kDa  Tất α – amylase metalloenzyme Người ta tìm thấy Ca2+ phân tử enzyme với hàm lượng từ – 30g.nguyên tử/1g.mol enzyme Nếu tách toàn Ca 2+ khỏi α – amylase, enzyme bị vơ hoạt  Nhìn chung, tỷ lệ tryptophan tyrosin phân tử amylase cao Riêng thành phần acid glutamic acid aspartic chiếm tới 25% trọng lượng phân tử Ngoài thành phần protein, số enzyme amylase từ nấm mốc cịn có phân đoạn glucid có chứa mannose, xylose hexosamine Chức thành phần glucid này chưa rõ  Một đặc điểm cần lưu ý hầu hết α – amylase bền với tác động protease peppin, trypsin, papain, … Bảng bên giới thiệu tính chất số chế phẩm α – amylase từ vi sinh vật Trang Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ mơi trường lỏng Bảng 2.2.1.1: Một số tính chất α – amylase từ vi sinh vật (Fogarty, 1983) Phân tử lượng (kDa) Tên vi sinh vật pH T opt opt Bacillus acidocaldarius 3.5 75 68 Bacillus stearothermophilus 4.5 – 6.5 65 – 73 48 Bacillus subtilis 5.3 – 6.4 50 47 Acinetobacter sp.I 7.0 50 – 55 55 Acinetobacter sp.II 7.0 50 – 55 65 Bacteirodes amylophilus 6.3 43 92 Micrococcus halobius 6.0 – 7.0 50 – 55 89 Streptomyces hygroscopicus 5.0 – 6.0 50 – 55 48 Streptomyces aureofaciens 4.6 – 5.3 40 40 Thermonospora curvata 5.5 – 6.5 65 62 Aspergillus oryzae 5.5 – 5.9 40 52 Mucor pusillus 3.5 – 4.0 65 – 70 48 Lipomyces kononenkaae 5.5 40 38 Schwaniomyces castellii 6.0 60 40  Dựa trình thủy phân tinh bột thành đường glucose, người ta tạm thời chia α – amylase thành hai nhóm: enzyme dịch hóa enzyme đường hóa o α – amylase dịch hóa - Sản phẩm thủy phân tinh bột amylase dịch hóa chủ yếu dextrin - Enzyme thường sử dụng giai đoạn đầu trình thủy phân tinh bột, nhằm hỗ trợ cho q trình hồ hóa dịch hóa o α– α– oligosaccharide - Tùy Trang Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng ưα– Aspergillus oryzae ủy (maltose (maltotriose α– Bacillus subtilis thủy (malitohexaose α – amylase nấm mốc Aspergillus oryzae bền vững acid α – amylase malt vi khuẩn Bacillus subtilis , tùy thủy α– thủy 2.2.2 β – amylase Hình 2.2.1.2: Cấu trúc khơng gian β – amylase  Đặc điểm hoạt động:  β – amylase exo enzyme, thủy phân từ đầu không khử mạch amylose, amylopectin glycogen Chúng phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside từ đầu không khử mạch tinh bột tạo maltose (dạng β – anomeric)  Enzyme không thủy phân liên kết α – 1,6 – glycoside amylopectin nên sản phẩm cuối thường gồm 50 – 60% maltose β – dextrin  β – amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể tác dụng lên tinh bột hồ hóa, enzyme giữ hoạt tính khơng có Ca2+  Điều kiện hoạt động:  β – amylase bền môi trường acid (kể pH – 4), enzyme hoạt động mạnh mơi trường có pH 4.5 – 5.5  β – amylase bền tác dụng nhiệt độ cao, bị vơ hoạt hồn tồn tác dụng nhiệt độ 700C, dịch nấu, topt 60 – 650C Trang Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 2.2.3 Glucoamylase Hình 2.2.1.3: Cấu trúc khơng gian glucoamylase  Đặc điểm hoạt động:  Glucoamylase ( – ủy – c – – amylase   5– 48 – bên Trang Công nghệ lên men thực phẩm 2.2.3.1: Gratreva, 1987) Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng a glucoamylase t Topt pHopt pH (oC) (kDa) Aspergillus awamori 4.5 60 83.7 – 88 3.7 Aspergillus niger 4.5 – 5.0 - 99 3.4 Aspergillus niger 4.5 – 5.0 - 112 4.0 Aspergillus oryzae 4.5 60 76 5.6 Aspergillus oryzae 4.5 50 38 5.6 Aspergillus oryzae 4.5 40 38 5.6 Aspergillus saitoi 4.5 - 90 3.9 Cephalosporium eichhorniae 4.2 45 – 62 26.85 - Lipomyces kononenkoae 4.5 50 81.5 6.1 Mucor rouxianus 4.6 55 59 8.4 Mucor rouxianus 5.0 55 49 8.4 Penicillium oxalicum 5.0 55 – 60 84 7.0 Penicillium oxalicum 4.5 60 86 7.45 Rhizopus delemar 4.5 40 100 - Rhizopus javanicis 5.0 – 5.2 - 48 7.5 – 8.0 Endomycopsis sp 20-9 5.7 – 5.9 50 53 3.8 Endomyces JF 00111 4.8 – 5.0 - 55 4.8 – 5.5  Nhận xét: o Đa số chế phẩm glucoamylase vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) mơ động vật có pH tối ưu vùng acid: pH 3.5 – 5.5 Trang Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng o T0opt glucoamylase 50 – 600C, hầu hết glucoamylase bị hoạt tính đun nóng 700C o So với α – amylase, glucoamylase bền acid hơn, lại bền tác dụng rượu, acetone, không bảo vệ Ca2+ Bảng 2.2.3.2: Ảnh hưởng pH nhiệt độ đến glucoamylase từ nguồn vi sinh vật khác Nguồn thu glucoamylase Chỉ số Rhizopus detemar Aspergillus niger pHopt 4.5 3.8 pH bảo đảm độ bền cho enzyme 3.5 – 8.0 2.2 – 7.5 ngày 300C Nhiệt độ cao (0C) mà enzyme chịu 15 phút pH 5.5 55 70 Điểm đẳng điện pI 7.4 6.5 2.2.4 Một số amylase khác Bên cạnh loại amylase trên, enzyme thủy phân liên kết nhánh sử dụng nhiều công nghiệpt thủy phân tinh bột α – glucosidase thủy phân từ đầu không khử liên kết α – 1,4 – glycoside α – 1,6 – glycoside gốc glucopyranose để tạo α – D – glucose Enzyme thủy phân tốt đường đôi oligosaccharide, có tiềm ứng dụng nhiều lĩnh vực, đặc biệt chuyển hóa syrup giàu maltose sang syrup giàu glucose Enzyme thủy phân liên kết α – 1,6 – glycoside phân tử amylopectin, glycogen số polymer khác pullulanase, exopullulanase, isomaltose Enzyme thường sử dụng kết hợp với β – amylase, glucoamylase sản xuất số sản phẩm syrup hay glucose với mục đích tăng hiệu suất thủy phân Kể từ Robyt Ackerman phát amylase thủy phân tinh bột thành maltotetraose năm 1971, số amylase vi khuẩn cơng bố có khả tạo sản phẩm từ DP2 đến DP6 Hiện nay, enzyme thủy phân tinh bột tạo malto – oligosaccharide quan tâm Malto – oligosaccharide có tiềm ứng dụng công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược cơng nghiệp hóa chất tinh khiết Những sản phẩm từ DP2 đến DP6 sử dụng việc chẩn đốn lâm sang để xác định có mặt α – amylase Những chất tan tốt, tạo dung dịch nhớt thực phẩm tuyệt hảo cho trẻ sơ sinh người già Tuy nhiên, giá thành sản phẩm đắt khó khăn việc sản xuất chúng Trang 10 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng CHẾ PHẨM AMYLASE 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase cơng nghiệp  Trong sản xuất bánh mì:  Khả dextrin hóa: khơng 2000 hoạt độ/g chế phẩm khơ  Khả đường hóa: khơng 150 đơn vị hoạt độ/g chế phẩm khô  Khả phân giải protein: không đơn vị hoạt độ/g chế phẩm khô  Độ nhiễm chế phẩm amiloirizin: không 150 bào tử  Trong sản xuất bia:  Chế phẩm enzyme không ảnh hưởng đến hương vị bia, tạo bọt độ ổn định bọt  Chế phẩm chứa enzyme bền nhiệt trình nấu, nhiệt độ 45 – 700C  Trong chế phẩm, để tạo pH tối ưu phải có mặt photphatase acid, pH tối ưu c ác enzyme chế phẩm khoảng 5.5 – 5.7  Trong sản xuất rượu:  Chế phẩm không cần độ tinh khiết, thường phức hệ nhiều enzym  Trong sản zuất rượu vang, để tránh tượng màu đỏ rượu vang đỏ vang trắng khỏi bị màu hung, hoạt độ enzyme oxy hóa chế phẩm khơng cao 0.1 đv/mg acid ascorbic phút 1g chế phẩm 30 0C  Để xử lý dịch nho nho nghiền dây chuyền sản xuất, dùng enzyme có hoạt độ cao (12000 đv/g) chế phẩm enzyme không tan  Giai đoạn dịch hóa dextrin hóa nhanh khoảng 60 – 950C khơng tích tụ nhiều glucid phân tử acid amin chế phẩm cần có hoạt lực dịch hóa dextrin hóa α – amylase cao với nhiệt độ tối ưu cao không chứa protease, β – glucanase  Giai đoạn đường hóa có tinh bột chế phẩm có hàm lượng đầy đủ glucoamylase α – amylase để đạt thủy phân sâu thời hạn tinh bột đến đường lên men  Nhiệt độ tối ưu chế phẩm nằm khoảng 55 – 620C (nhiệt độ đường hóa), đồng thời chế phẩm phải giữ hoạt lực đầy đủ 30oC  Trong sản xuất nước rượu trái cây: Các chế phẩm enzyme dùng sàn xuất nước quả, rượu trái khơng chứa enzyme oxy hóa: peroxidase, catalase, polyphenoloxidase, làm biến màu nước nhiều làm giảm tính chất cảm quan  Trong cơng nghiệp dệt giấy:  Các chế phẩm enzym cơng nghiệp dệt, giấy phải có tính chịu nhiệt độ cao enzyme vi khuẩn, dễ nhuộm tẩy vải, … Trang 34 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Trong công nghiệp thường dùng chế phẩm amylase dịch đặc có nồng độ chất khô lớn 50%  Trong chăn nuôi: Trong chăn nuôi, chế phẩm dùng riêng rẽ hay phối hợp enzyme khác với liều lượng nhỏ từ 0.01 – 0.3% lượng thức ăn  Trong y học: Các chế phẩm enzyme dùng y học dạng bột màu trắng, tinh khiết, có hoạt độ cao 5.2 Các dạng chế phẩm enzyme  Chế phẩm enzyme thô (dạng lỏng): Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Chế phẩm enzyme thô  Chế phẩm enzyme kỹ thuật (dạng bột): - Là chế phẩm thô tinh chế sơ bộ, số protein enzyme tạp tách Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa vài enzyme chủ yếu - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Sấy → Chế phẩm enzyme kỹ thuật  Chế phẩm enzyme tinh khiết: - Thường tinh enzyme từ chế phẩm enzyme thô - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Kết tủa → Sấy → Chế phẩm enzyme tinh khiết (mức độ tinh khiết không cao) - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Tinh phương pháp sắc ký (lọc gel/trao đổi ion/hấp phụ) → Sấy → Chế phẩm enzyme tinh khiết (mức độ tinh khiết cao) 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại  Chế phẩm α – amylase Hình 5.3.1: Chế phẩm α – amylase chịu nhiệt dạng lỏng Trang 35 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Nguồn gốc – Phạm vi ứng dụng sản phẩm: o Được tạo thành từ loài Bacillus subtillis phương pháp lên men chìm o Tùy theo mức độ chất lượng khác mà ứng dụng thực phẩm ngành công nghiệp khác o Được sử dụng rông rãi lĩnh vực chế biến tinh bột, cồn, acid hữu cơ, dệt lên men  Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm: o Chỉ tiêu vật lý: Trạng thái vật lý: chất lỏng có cặn lắng nhẹ Khối lượng riêng: 1.02 – 1.35g/ml Nhiệt độ: 65 – 900C o Chỉ tiêu hóa học: pH: 5.5 – 7.0 o Chỉ tiêu hóa sinh: Hoạt tính enzyme: 3,000U/ml o Chỉ tiêu cảm quan: Màu nâu nhạt Mùi: có mùi lên men bình thường  Các thông tin khác: o Điều kiện bảo quản: Sản phẩm phải bảo quản nhiệt độ thấp, tránh xa nơi có nhiệt độ cao o Thời hạn sử dụng: tháng nhiệt độ 250C: hoạt độ ≥ 90% o Liều lượng: – 8U/g ngun liệu chứa amylose o Tính an tồn: Tiếp xúc với enzyme dẫn đến nhạy cảm nguyên nhân gây dị ứng quan nhạy cảm thể Sự tiếp xúc lâu nguyên nhân gây ngứa cho da trẻ em, ảnh hưởng đến mắt, mũi Khi bị dính nên rửa lập tức, rửa nước, hỏi ý kiến bác sĩ Trang 36 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Hình 5.3.2: Chế phẩm α – amylase chịu nhiệt dạng bột Thông tin sản phẩm:  Liquimax loại α – amylase công nghiệp để thủy phân cho dịch lỏng ngơ, lúa mì ngũ cốc khác Đây bước sản xuất ethanol từ ngũ cốc Loại α – amylase chịu nhiệt làm từ giống tốt Bacillus licheniformis phương pháp lên men bề sâu  Đây sản phẩm có tính kháng nhiệt tốt thích nghi điều kiện pH thấp Nó có ứng dụng rộng rãi cho dạng lỏng công nghiệp tạo mật tinh bột, cồn, bia, lactic acid, citric acid …và công nghiệp dệt  Sản phẩm lựa chọn rộng rãi cho chất lỏng công nghiệp đường từ tinh bột, cồn, bia, acid lactic, acid citric,… công nghiệp dệt  Chế phẩm glucoamylase Hình 5.3.3: Chế phẩm glucoamylase Trang 37 Cơng nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm: Chế phẩm glucoamylase phân thành hai loại: dạng lỏng dạng rắn o Chỉ tiêu vật lý: Trạng thái vật lý: lỏng rắn Nhiệt độ hoạt động tối ưu: 58 – 600C o Chỉ tiêu hóa học: pH hoạt động tối ưu: o Chỉ tiêu hóa sinh: Chế phẩm dạng rắn: 150,000 U/g Chế phẩm dạng lỏng: 100,000 U/ml; 120,000U/ml; 130,000U/ml  Các thông tin khác: Chế phẩm dạng rắn: 20 kg/túi Chế phẩm dạng lỏng: 25 kg/thùng Phạm vi sử dụng: tác nhân đường hóa trình sản xuất cồn, rượu bia, calci lactate THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 6.1 α – amylase Bacillus subtilis cs m so v rửa trôi ăng dẫn đến khuôn quan trọng Zoe Konsoula subtilis khuôn gel calcium algenate α – amylase theo mẻ   : Tryp , NaCl, albumin Trang 38 Bacillus α – amylase 2, Bovine serum Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  t Bacillus subtilis E Litopoulou – enzyme thủy   Bacillus subtilis Luria Bertani 0.5% (w/v) NaCl α – amylase 400 1% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) 24 (4500 vịng/phút thí nghiệm tế bào  nh đ 12.5mL (w/v) trọng (0.16% gel) CaCl2 3.5% (w/v) 2, tạo inate hóa 35µ 2+  Tối ưu hóa đặc tính khn 2% (w/v) sodium alginate, 3.5% (w/v) CaCl2 , 3.2% (w/v trọng lượng ướt  Lên men (%, w/v) o o o o o NaCl: 0.01 (NH4)2SO4: 0.02 MgSO4.7H2O: 0.005 CaCl2: 0.0075 Tryptone: : : 400C : 36 trình lên men đươc tiếp tục Trang 39 Công nghệ lên men thực phẩm  Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng : ỷ α – amylase : = Cimm /Cfree :   ng α – amylase α – amylase c (%) = 100x(Cx /C1) : :  α – amylase  Phương pháp phân tích hoạt tính amylase α – amylase 0.1M dung dịch 100 C bovine serum albumin kết tinh  Kết Bacillus subtilis 1350 Trang 40 n Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Hình 6.1.1: Động học trình sản xuất α – amylase ngoại bào b i tế bào tự (A) tế bào cố định khuôn gel calcium alginate (B) Hoạt tính amylase canh trường ( ), nồng độ tế bào canh trường (▲) tế bào khn gel (×) α – amylase Bacillus subtilis d 22 22 1.9mg/ml canh trườ Trang 41 Công nghệ lên men thực phẩm (H Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng , động học 22 12 độ ịnh lại khác 4mg/ml nồng 30 (h 22B) Hơn , tỷ 5mg/ml algenate gel tương đươn 1.25mg/ml nồng độ , người ta xác định nồng độ 0.2mg/ml α – amylase 22 α – amylase α – amylase Kỹ , cách thức 48 hai 24 ia 30 Sau 36 (9.34 U/ml/giờ 90% (3.7 U/ml/giờ a loài Bacillus  ,t Bacillus subtilis α – amylase nồng độ Bacillus subtilis nồng độ khuôn gel, C Bacillus subtilis ,đ α – amylase Trang 42 nhiều lần mà Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng đạt hiệu cao trình lên men amylase α– 6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương pháp nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải công nghiệp thực phẩm Công nghiệp chế biến thức ăn bia thải lượng lớn nước thải có số COD (biểu thị nhu cầu oxy hóa học: số mg oxy cần dùng để oxy hóa tồn lượng chất nhiễm có lít nước thải phản ứng hóa học) BOD (biểu thị nhu cầu oxy sinh học: số mg oxy mà vi sinh vật cần dùng để oxy hóa tồn lượng chất nhiễm dễ bi phân hủy sinh học có lít nước thải) cao Nguồn nước thải chưa qua xử lý từ nhà máy bia có số BOD vào khoảng 500 – 2600mg/L, COD 780 – 3500mg/L, nguồn nước thải chưa qua xử lý từ nhà máy chế biến thịt có số BOD 600 – 3000mg/L, COD 800 –400mg/L thề vấn đề môi trường nghiêm trọng Santiago de Cuba Do đó, cần thiết phải có kỹ thuật công nghệ xử lý nguồn nước thải Khả lọc chất thải từ công nghiệp thực phẩm, việc sử dụng chúng chất cho cơng nghệ hóa sinh có tiềm lợi ích kinh tế, biết đến trước Chất thải qua quy trình xử lý Mussel sử dụng để sản xuất protein đơn bào (single cell protein) trình phân giải với ổn định cao từ giống Aspergillus Xử lý vi sinh nguồn thải phương pháp hiệu để làm hạ số COD khoảng 90% Giống Aspergillus sản xuất nhiều lọai enzyme ngoại bào, amylase enzyme quan trọng công nghiệp Amylase không sử dụng trình lên men, mà cịn ứng dụng cơng nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp giấy vải sợi Dựa vào có sẵn nguồn nước thải lớn với giá thấp từ nhà mày bia chế biến thịt Santiago de Cuba, việc sử dụng nguồn môi trường gieo trồng cho q trình sản xuất vi sinh, cung cấp nguyên liệu đầu vào rẻ tiền cho quy trình sản xuất chi phí thấp, với thuận lợi khả làm giảm số COD hiệu Tuy nhiên, chưa có thơng tin việc sử dụng nguồn thải từ nhà máy bia chế biến thịt cho sản xuất lọai enzyme công nghiệp nấm mốc Aspergillus niger C.F Gonzalez xác định khả ứng dụng hai nguồn nước thải từ nhà máy bia nhà máy chế biến thịt Santiago de Cuba cho sản xuất amylase từ chủng Aspergillus niger UO – điều kiện môi trường nuôi cấy bề sâu Những ảnh hưởng mức tinh bột ban đầu nguồn nitơ trình sản xuất enzyme amylase nghiên cứu Ảnh hưởng pH, nhiệt độ ion kim lọai lên tính ổn định enzyme amylase tìm hiểu Thêm vào đó, xác định mức độ giảm số COD hai nguồn nước thải sau trình xử lý vi sinh Trang 43 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Nguyên liệu phương pháp  Hệ vi sinh vật: Chủng Aspergillus niger UO – nuôi ống thạch nghiêng chứa dextrose khoai tây 40C  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy điều kiện lên men : o Glucose: 20g/L o (NH4)2SO4: 6.6g/L o KH2PO4 : 3.5g/L o FeSO4.7H2O: 0.15g/L o MgSO4.7H2O: 0.1g/L o MnCl2.2H2O: 0.45g/L o Mycological peptone: 3.0g/L : pH 6.8 300C : 48 : 220vòng/phút Nước thải từ nhà máy bia từ nhà máy chế biến thịt, sử dụng chất môi trường nuôi cấy Cả hai nguồn nước thải ly tâm 12,000g/15 phút để loại bỏ tạp chất 6.2.1: COD 3.4g/L Đường 1.98g/L Nitơ 0.095g/L Phospho 0.034 g/L COD 3.0g/L Đường 1.82 g/L Nitơ 0.172 g/L Phospho 0.028 g/L Môi trường sản xuất lấy từ chất bề mặt với hàm lượng dinh dưỡng: NaCl 5g/L KH2PO4 3.5g/L FeSO4.7H2O 0.15g/L MgSO4.7H2O 0.12g/L Giống cấy 3.0g/L (NH4)2SO4 6.6 g/L CaCO3 8.0g/L Trang 44 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Để nghiên cứu ảnh hưởng ban đầu tinh bột việc sản xuất amylase, môi trường bổ sung tinh bột khoai tây hòa tan để thu môi trường với hàm lượng tinh bột ban đầu 10, 20, 30 40 g/L Mơi trường khơng có tinh bột dùng để điều khiển, môi trường điều chỉnh pH 6.0 tiệt trùng 1210C 15phút, tiêm giống với 2% giống cấy ủ 300C 88 Tất giống nuôi cấy chìm erlen 250ml với 50ml mơi trường sản xuất lắc 200 vòng/phút, dùng lọ loạt lên men Mẫu cấy ống thí nghiệm thu nhận sau 12 Khối Mycelial thu giấy lọc, rửa vòi nước nhỏ sấy 1050C Giấy lọc dùng để thực phân tích (độ pH, mức độ sinh tổng hợp enzyme, hàm lượng đường tổng, nitơ tổng, phospho tổng số COD) Sự phân tích số COD thực giấy lọc trình lên men, sử dụng phương pháp so màu reflux  Phân tích hoạt tính amylase Hoạt tính amylase tổng (TAA) xác định theo Murado (1993): trộn lẫn 80µl mơi trường giấy – lọc với 400µl citrate – phosphate 0.15M, điều kiện pH 5.0 4% bột hoà tan trước bảo quản 400 C 15 phút, sau ủ 40o C 10 phút để phản ứng xảy Phản ứng dừng lại thêm 480µl acid dinitrosalicylic, lượng glucose giải phóng xác định phản ứng với 3, – dinitrosalicylic (Bernfeld, 1951) Một đơn vị hoạt động amylase xác định số lượng enzyme chuyển hóa 1mg/mL đường khử (xem glucose) điều kiện phân tích  Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt động amylase Mẫu ủ với hỗn hợp 30 phút điều kiện nhiệt độ độ pH tối ưu xác định phân tích trước Sau ủ, hoạt tính cịn lại xác định phân tích enzyme tương ứng Hoạt tính enzyme dư biểu thị phần trăm hoạt động mẫu kiểm tra khơng có chất phản ứng (Aquino, Jorge, Terenzi & Polizeli, 2003) Mỗi thí nghiệm thực lần Những liệu phân tích phân tích độ biến thiên (ANOVA) SPSS 8.0 Windows  Kết Sản xuất amylase môi trường nước thải từ nhà máy bia nhà máy chế biến thịt bổ sung tinh bột Thời gian sinh trưởng, độ pH, đường tổng enzyme trình 24 Mức độ sinh tổng hợp enzyme amylase tùy thuộc vào nồng độ tinh bột ban đầu mơi trường ni cấy (hình 24 ) Với nồng độ tinh bột ban đầu cao (40g tinh bột/l) môi trường tối ưu cho phát triển tế bào, hàm lượng amylase đạt cực đại môi trường nước thải từ nhà máy bia (70.29 EU/ml) cao so với môi trường nước thải từ nhà máy chế biến thịt (60.12 EU/ml) Trang 45 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trong thời gian lên men, pH ban đầu giảm từ 6.0 xuống 4.0 sau 24 giờ, sau tăng đến xấp xỉ 7.4 (48 ) Nồng độ đường tổng, nitơ tổng phospho tổng giảm thời gian lên men, sinh khối mức độ sinh tổng hợp enzyme tăng Môi trường ni cấy bổ sung 40g tinh bột/l có số COD 0.24g/L, thấp so với môi trường ni cấy có nồng độ tinh bột ban đầu Điều cho thấy 92 – 93% COD ban đầu loại từ nước thải nhà máy bia nhà máy chế biến thịt Hình 6.2.1: Thời gian sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme chủng Aspergillus niger UO – với chất từ nước thải nhà máy bia nhà máy chế biến thịt đường tổng nồng độ khác ((d)0,(s) 10, (h) 20; (n) 30; (�) 40g/L) TS: đường tổng; TAA: hoạt tính phân giải tổng; PA: hoạt tính protease; Nt: nitơ tổng; P: phosphor tổng Canh trường giữ 300C 88 với vận tốc lắc đảo 200 vịng/phút Trang 46 Cơng nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Kết luận , việc sử dụng nước thải từ nhà máy bia nhà máy chế biến thịt làm môi trường nuôi cấy cho sản xuất quy mô lớn amylase từ chủng Aspergillus niger UO – 1, góp phần bảo vệ môi trường thông qua việc xử lý nguồn nước thải nhà máy Tuy nhiên, nghiên cứu dựa vào việc sử dụng nguồn carbon từ cám lúa mì, cám gạo, vỏ hạt gạo, cám ngô, …cho sản xuất amylase thiết yếu TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Bạch Tuyết (chủ biên), Các q trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh Lê Ngọc Tú (chủ biên), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 2004 Lê Văn Hịang, Các q trình & thiết bị công nghệ sinh học công nghiệp, Nhà Xuất Bản Khoa Học Kỹ Thuật, 2004 Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa thức uống – tập – Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004 Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Công nghệ enzym, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, 2004 PTS Nguyễn Đức Lượng – Nguyễn Chúc – Lê Văn Việt Mẫn, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa TP HCM A S Grandison and M J Lewis, Separation Process in the Food and Biotechnology Industries, published by Woodhead Publishing Limited, Abington Hall, Abington, Cambridge CB1 6AH, England, 1996 Mark C Porter, Handbook of Industrial Membrane Technology, published in the United States of America by Noyes Publications, 1990 Richard W Baker, Membrane technology and applications, published by McGraw – Hill, 2000 10 Sliva E M and Shang Tian Yang (1998), Production of Amylases from rice by state fermentation in a Gas- solic spouted- bed bioriator, Biotechnology ang progress 14, pp 580- 587 11 Smith and Rose (1996), Biological Chemistry 179 (2), pp 53- 58 12 Tipton K.F 1992, Principle of enzyme assay and kinetic studies, pp 1- 53, Enzyme assays, Oxford University Pres, New Yord Trang 47 ... nghiệp dệt  Chế phẩm glucoamylase Hình 5.3.3: Chế phẩm glucoamylase Trang 37 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm: Chế phẩm glucoamylase... Một số chế phẩm amylase thương mại  Chế phẩm α – amylase Hình 5.3.1: Chế phẩm α – amylase chịu nhiệt dạng lỏng Trang 35 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Nguồn gốc... macerans SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG Trang 13 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng A Sơ đồ quy trình cơng nghệ Ngun liệu Chuẩn bị mơi trường Giống VSV