Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài vitex limonifolia wall ex c b clark và vitex trifolia l tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Kim Thoa NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LỒI Vitex limonifolia WALL EX C.B.CLARK VÀ Vitex trifolia L Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số : 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình hồn thành tại: Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS Nguyễn Xuân Nhiệm Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Ninh Khắc Bản Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Hà Nội tháng năm 2019 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Trong vài thập kỉ trở lại đây, xu hướng sâu nghiên cứu thuốc động vật làm thuốc để tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao nhằm sản xuất loại thuốc có giá trị cao phục vụ sống ngày nhà khoa học giới quan tâm Theo Từ điển thuốc Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Đẻn (Vitex) có cơng dụng chữa bệnh như: cảm mạo, sốt rét, chóng mặt, nhức đầu, viêm ruột, rối loạn tiêu hóa, ho, hen suyễn, trị bệnh ngồi da, [1] Các nghiên cứu thành phần hóa học loài thuộc chi Vitex cho thấy chi chứa đa dạng lớp chất như: terpenoid, flavonoid, ecdysteroid, lignan, Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết hợp chất phân lập từ lồi thuộc chi có hoạt tính đáng quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, kháng nấm, kháng khuẩn, Tuy vậy, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi thuộc chi Vitex Việt Nam cịn hạn chế Tính đến nay, Việt Nam có khoảng cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học số lồi thuộc chi Vitex [2-6], chưa có cơng bố hoạt tính sinh học lồi thuộc chi Chính vậy, nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi thuộc chi Vitex Việt Nam tạo sở khoa học việc sử dụng bền vững tài nguyên thuốc này, đồng thời tạo tiền đề cho nghiên cứu việc tạo chế phẩm có hoạt tính sinh học cao phục vụ cơng tác bảo vệ, chăm sóc sức khỏe cộng đồng, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Vitex limonifolia Wall Ex C.B.Clark Vitex trifolia L.” 2 Mục tiêu nghiên cứu luận án Xác định thành phần hóa học chủ yếu hai loài Vitex limonifolia Wall ex C.B.Clarke Vitex trifolia L Việt Nam Đánh giá hoạt tính kháng viêm hoạt tính kháng virus in vitro hợp chất phân lập Các nội dung nghiên cứu luận án: Phân lập hợp chất từ loài V limonifolia V trifolia Việt Nam phương pháp sắc ký; Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp vật lý, hóa học; Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro hợp chất phân lập từ loài V limonifolia; Đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro hợp chất phân lập từ loài V limonifolia V trifolia CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chi Vitex Chi Vitex giới có khoảng 250 loài, phân bố chủ yếu quốc gia nhiệt đới cận nhiệt đới, đa dạng từ bụi tới gỗ trung bình [7] Ở Việt Nam, chi Vitex ghi nhận 20 loài Từ thời cổ đại, người sử dụng nhiều loài thuộc chi Vitex để chữa nhiều bệnh khác đau khớp, co giật, giảm sốt, bệnh đường hô hấp, kháng lao, kháng u, Ở Việt Nam, nhiều loài Vitex sử dụng thuốc dân gian để chữa trị số bệnh thông dụng trị cảm sốt, giảm đau, trúng phong, Các nghiên cứu cho thấy, thành phần hóa học lồi chi Vitex đa dạng, chủ yếu hợp chất terpenoid, flavonoid, ecdysteroid, lignan, iridoid, Các loài thuộc chi có nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm : gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, giảm đau, kháng virus, vi sinh vật số hoạt tính khác Ở Việt Nam, có cơng bố nghiên cứu thành phần hóa học số lồi thuộc chi Vitex, chưa có cơng bố hoạt tính sinh học 1.2 Giới thiệu viêm: Giới thiệu viêm, thuốc kháng viêm, vai trò NO bệnh lý viêm 1.3 Giới thiệu kháng virus: Giới thiệu virus, thuốc kháng virus CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu loài Vitex limonifolia Wall ex C.B.Clarke loài Vitex trifolia L thu Vườn quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng 9/2015 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất Phối hợp phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC) sắc ký cột (CC) 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học hợp chất kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại bao gồm: phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ lưỡng sắc tròn (CD), độ quay cực ([]D) 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Hoạt tính kháng viêm in vitro đánh giá qua tác dụng ức chế sản sinh NO tế bào BV2, kích thích LPS Xét nghiệm hoạt tính kháng virus in vitro thực với phương pháp SRB 2.3 Phân lập hợp chất 2.3.1 Các hợp chất phân lập từ lồi V limonifolia Hình 2.1 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài V limonifolia 2.3.2 Các hợp chất phân lập từ lồi V trifolia Hình 2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài V trifolia 2.4 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập 2.4.1 Thông số vật lí hợp chất phân lập từ lồi V limonifolia Phần trình bày thơng số vật lý kiện phổ 12 hợp chất phân lập từ lồi V limonifolia 2.4.2 Thơng số vật lí hợp chất phân lập từ lồi V trifolia Phần trình bày thơng số vật lý kiện phổ 16 hợp chất phân lập từ lồi V trifolia 2.5 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 2.5.1 Hoạt tính kháng viêm in vitro hợp chất phân lập từ loài V limonifolia - 12 hợp chất (VL1-VL12) đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa ức chế sản sinh NO tế bào BV2, kích thích LPS Kết đánh giá hoạt tính nồng độ 20 µM thể bảng Bảng 2.1 Kết đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO hợp chất VL1-VL12 tế bào BV2 Hợp chất % tế bào sống sót IC50 (µM) >50 VL1 87,062,43 VL2 120,757,80 2,500,34 VL3 147,828,55 7,130,87 VL4 87,1211,28 24,701,52 VL5 104,519,50 39,673,14 VL6 86,633,23 19,161,09 VL7 96,935,10 45,315,31 >50 VL8 104,519,50 VL9 141,198,73 44,232,48 VL10 119,536,65 15,881,17 VL11 59,045,83 >50 VL12 80,503,25 L-NMMA 22,101,20 (-) Khơng đánh giá hoạt tính kháng viêm nồng độ tỉ lệ % sống sót nhỏ (< 80%) 2.5.2 Hoạt tính kháng virus in vitro hợp chất Từ loài V limonifolia: Các hợp chất VL1-VL12 tiến hành đánh giá hoạt tính kháng chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) enterovirus 71 (EV71) theo phương pháp thử nghiệm SRB Bảng 2.2 Hoạt tính kháng virus CVB3, HRV1B EV71 số hợp chất từ loài V limonifolia Kí hiệu VL4 VL6 Rupuntrivir VL4 Ribavirin VL4 Rupuntrivir CC50 (M) IC50 (M) Coxsackievirus B3 (CVB3) >50 0,21±0,06 >50 1,86±0,18 >50 0,12±0,06 Human rhinovirus 1B (HRV1B) >50 0,61±0,21 >50 48,07±1,46 Enterovirus 71 (EV71) >50 32,05±0,94 >50 0,11±0,05 Từ loài V trifolia: Các hợp chất VT1-VT16 đánh giá sàng lọc hoạt tính kháng chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B enterovirus 71 nồng độ 10 M Bảng 2.3 Kết sàng lọc hoạt tính kháng số chủng virus hợp chất từ loài V trifolia Hợp chất VT1 VT2 VT3 VT4 VT5 VT6 VT7 VT8 Coxsackievirus B3 2,38 3,52 4,99 13,27 1,94 -2,31 4,20 1,85 % tế bào sống sót Human rhinovirus 1B 5,41 4,23 -1,51 0,71 -0,12 -1,87 -3,10 -0,68 Enterovirus 71 1,30 5,97 -4,34 3,37 2,29 -5,16 6,44 1,42 VT9 VT10 VT11 VT12 VT13 VT14 VT15 VT16 77,14 -5,98 3,44 1,89 6,23 -0,63 -0,19 1,32 80,20 -1,75 1,03 -3,34 -0,95 -0,20 -2,30 -1,79 43,35 -4,99 -4,94 -1,17 -1,87 1,53 -0,19 -8,83 CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được: 28 hợp chất * 12 hợp chất từ lồi V limonifolia: Hình 3.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài V limonifolia hợp chất gồm: vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) vitexlimolide C (VL3); hợp chất biết gồm: flavonoid, 5,4′dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), vitecetin (VL5), 5,4′-dihydroxy7,3′-dimethoxyflavone (VL6), verrucosin (VL7), 2α,3α-dihydroxyurs-12- en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10), maslinic acid (VL11), maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12), đó, hợp chất VL4, VL6, VL7, VL10 VL12 lần phân lập từ chi Vitex * 16 hợp chất từ lồi V trifolia: Hình 3.2 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài V trifolia 11 [7β-hydroxyisocupressic acid: δH 3,83 (1H, dd, J = 5,0, 11,5 Hz), H-7, đo CD3OD)] [120] hợp chất có nhóm 7α-hydroxy, J  Hz [7αhydroxylabd-8(17)-en-15,18-dioic acid-15-methyl ester: δH 4,38 (br s), H-7, đo CDCl3] [121] Các tương tác HMBC H-14 (δH 6,01) C-12 (δC 67,2)/C-13 (δC 177,5)/C-15 (δC 176,5)/C-16 (δC 73,0); H-16 (δH 5,01) C-14 (δC 114,4)/C-15 (δC 176,5); H-12 (δH 4,58) C-9 (δC 47,6)/C-11 (δC 32,0)/C-13 (δC 177,5)/C-14 (δC 114,4)/C-16 (δC 73,0) khẳng định có mặt vịng γ-lactone chưa bão hịa carbon β (C-13) vị trí nhóm hydroxy C-12 Bằng so sánh độ bội H-12 (δH 4,58, dd, J = 4,0, 8,0 Hz) VL1 với hợp chất có nhóm 12αhydroxy [vitexolide A: δH 4,56 (br d, J = 10,6 Hz, H-12), đo acetone-d6] [42] hợp chất có nhóm 12β-hydroxy [12-epivitexolide A: δH (4,61 br s, H-12), đo acetone-d6] [42], gợi ý nhóm hydroxy C-12 có cấu hình α V L (c =   , r e la tiv e u n it s V L (c = 1a -4 -2 M) M) 1b 0 -0 -1 210 220 230 240 250 260 270 280  , nm Hình 3.5 Phổ CD thực nghiệm hợp chất VL1 tính tốn CD theo lý thuyết hai epimer 1a 1b Để xác định xác cấu hình tuyệt đối C-12, hợp chất VL1 tiến hành đo phổ CD Phổ CD thực nghiệm hợp chất so sánh với tính tốn theo lí thuyết (phương pháp TDDFT) [122] hai epimer 1a (7α,12α-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide) 1b (7α,12β-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide)-cấu trúc khác cấu hình nhóm hydroxy C-12 Kết cho thấy, phổ CD 12 VL1 có hiệu ứng Cotton dương max = 218 nm đo bước sóng 200-244 nm (nồng độ 10-4 M), hiệu ứng Cotton âm max = 251 nm đo bước sóng 245-280 nm (nồng độ 10-2 M) So sánh với phổ CD hợp chất 1a (có hiệu ứng Cotton dương max = 221 nm hiệu ứng Cotton âm max = 249 nm) hợp chất 1b (có hiệu ứng Cotton âm max = 221 nm) Như vậy, phổ CD hợp chất VL1 có giống với 1a, có cấu hình nhóm hydroxy C-12 chứng minh α (tức cấu hình R) Từ phân tích trên, cấu trúc hợp chất VL1 xác định 7α,12α-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide Đây hợp chất đặt tên vitexlimolide A C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Bảng 3.1 Số liệu NMR hợp chất VL1 hợp chất tham khảo δCa,b DEPT δHa,c (J = Hz) δ C 39,7 39,8 CH2 1,19 (ddd, 3,0, 12,5, 13,0, α)/1,74 (m, β) 20,1 20,4 CH2 1,54 (m, α)/1,64 (m, β) 43,0 43,3 CH2 1,30 (m, α)/1,45 (brd, 13,0, β) 34,3 34,1 C 56,4 48,8 CH 1,75 (m) 25,3 32,5 CH2 1,60 (m, α)/1,91 (ddd, 2,5, 3,0, 14,0, β) 39,0 74,7 CH 4,38 (t, 3,0) 149,5 150,6 C 52,8 47,6 CH 2,60 (dd, 4,0, 9,0) 40,1 40,5 C 32,1 32,0 CH2 1,76 (m) 67,3 67,2 CH 4,58 (dd, 4,0, 8,0) 176,3 177,5 C 114,2 114,4 CH 6,01 (d, 2,0) 174,1 176,5 C 71,8 73,0 CH2 5,01 (m) 107,1 110,0 CH2 4,65 (s)/5,13 (s) 22,1 33,8 CH3 0,92 (s) 34,0 22,0 CH3 0,86 (s) 15,2 14,3 CH3 0,74 (s) C vitexolide E (VL1a, đo acetone-d6) [41], ađo CD3OD, b125MHz, c500MHz # 13 3.1.1.2 Hợp chất VL2: Vitexlimolide B (hợp chất mới) Hình 3.14 Cấu trúc hóa học VL2 hợp chất tham khảo (VL1) Hợp chất VL2 thu dạng chất bột vơ định hình màu trắng Công thức phân tử VL2 xác định C20H30O5 dựa vào kết phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS xuất pic ion m/z 385,1772 [M+Cl] ̶ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức [C20H30O5Cl] ̶ : 385,1787) Trên phổ 1H-NMR hợp chất VL2 (đo CD3OD) xuất tín hiệu proton ba nhóm methyl liên kết với carbon bậc bốn δH 0,74 (3H, s), 0,86 (3H, s) 0,92 (3H, s), hai proton hydroxymethine δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz) 4,58 (br s), ba proton olefin δH 4,78 (s), 5,13 (s) 6,04 (s) Trên phổ 13C-NMR DEPT VL2 xuất tín hiệu 20 nguyên tử carbon, có ba carbon methyl δC 14,2, 22,0 33,8, sáu methylene δC 20,3, 31,2, 32,4, 39,8, 43,3 110,5, sáu methine δC 66,9, 47,6, 49,0, 74,7, 100,2 117,1, bốn carbon không liên kết trực tiếp với hydro δC 34,1, 40,5, 150,0 173,1 carbon carbonyl δC 173,1 Số liệu phổ NMR VL2 giống với hợp chất VL1 gợi ý hợp chất khung labdane Tuy nhiên, so sánh số liệu phổ NMR hai hợp chất có điểm khác biệt lớn, tín hiệu nhóm oxymethylene (δH 5,01 δC 73,0) hợp chất VL1 14 thay nhóm hemiacetal (δH 6,23 δC 100,2) hợp chất VL2 Tín hiệu cộng hưởng proton vịng γ-hydroxy-γlactone phổ 1H-NMR VL2 rộng thấp, tín hiệu cộng hưởng C-14 (δC 117,1) C-16 (δC 100,2) khó quan sát phổ 13 C-NMR gợi ý tồn cân hai đồng phân epimer C-16 Hình 3.15 Các tương tác HMBC, COSY NOESY hợp chất VL2 Vị trí nhóm hydroxy C-7 liên kết đơi C-8/C-17 xác định dựa tương tác HMBC từ H-17 (δH 4,78 5,13) đến C-7 (δC 74,7)/C-8 (δC 150,0)/C-9 (δC 47,6); từ H-7 (δH 4,38) đến C-5 (δC 49,0)/C-6 (δC 32,4)/C-9 (δC 47,6) Vị trí nhóm hydroxy C-12 xác định dựa tương tác HMBC từ H-11 (δH 1,65 1,73)/H-14 (δH 6,04) đến C-12 (δC 66,9) tương tác COSY H-9 (δH 2,62)/H-11 (δH 1,65 1,73)/H-12 (δH 4,58) Cấu hình nhóm hydroxy C-12 xác định β dựa so sánh độ bội H-12 (δH 4,58, br s) VL2 với hợp chất có nhóm 12α-hydroxy [vitexolide A: δH 4,56 (br d, J = 10,6 Hz), H-12, đo acetone-d6] [42] hợp chất có nhóm 12βhydroxy [12-epivitexolide A: δH (4,61 br s), H-12, đo acetone-d6] [42] Từ phân tích trên, cấu trúc hợp chất VL2 xác định 7α,12β,16-trihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide Đây hợp chất đặt tên vitexlimolide B 15 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất VL2 hợp chất tham khảo C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 # C δ C 39,8 20,4 43,3 34,1 48,8 32,5 74,7 150,6 47,6 40,5 32,0 67,2 177,5 114,4 176,5 73,0 110,0 33,8 22,0 14,3 δCa,b 39,8 20,3 43,3 34,1 49,0 32,4 74,7 150,0 47,6 40,5 31,2 66,9 173,1 117,1 173,1 100,2 110,5 33,8 22,0 14,2 DEPT CH2 CH2 CH2 C CH CH2 CH C CH C CH2 CH C CH C CH CH2 CH3 CH3 CH3 δHa,c (J = Hz) 1,19 (ddd, 3,0, 13,0, 13,0)/1,71 (m) 1,53 (m)/1,63 (m) 1,26 (m)/1,45 (brd, 13,0) 1,75 (m) 1,61 (dd, 3,0, 13,0)/1,90 (m) 4,38 (t, 3,0) 2,62 (br d, 12,0) 1,65 (m)/ 1,73 (m) 4,58 (br s) 6,04 (s) 6,23 (s) 4,78 (s)/5,13 (s) 0,92 (s) 0,86 (s) 0,74 (s) vitexlimolide A (VL1, đo CD3OD), ađo CD3OD, b125MHz, c500MHz 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ lồi V trifolia Phần trình bày kết phân tích phổ xác định cấu trúc 16 hợp chất phân lập từ loài V trifolia 3.1.2.2 Hợp chất VT2: Matairesinol 4’-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới) Hợp chất VT2 thu dạng chất bột vô định hình màu trắng VT2 có cơng thức phân tử C26H32O11 dựa vào phổ HR-ESI-MS xuất pic ion tại m/z 521,2009 [M+H]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức [C26H33O11]+, 521,2017) 16 Hình 3.51 Cấu trúc hóa học VT2 hợp chất tham khảo Trên phổ 1H-NMR VT2 xuất tín hiệu proton thuộc vòng thơm hệ ABX δH 6,49 (dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 6,55 (d, J = 1,6 Hz), 6,66 (d, J = 8,0 Hz); 6,64 (dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 6,73 (d, J = 1,6 Hz), 7,04 (d, J = 8,0 Hz), hai nhóm methoxy δH 3,75 (s) 3,79 (s), proton anome δH 4,84 (d, J = 8,0 Hz) Phổ 13 C-NMR VT2 xuất tín hiệu 26 nguyên tử carbon, 18 carbon thuộc khung lignan, hai methoxy sáu carbon thuộc đơn vị đường Dữ liệu phổ 1H- 13C-NMR VT2 tương tự với số liệu công bố hợp chất VT2a (matairesinol 4-O-β-D-glucopyranoside) [134], ngoại trừ thay đổi vị trí đơn vị đường glucopyranosyl với khung lignan từ vị trí C-4 chuyển sang vị trí C-4′ Hình 3.52 Các tương tác HMBC, COSY NOESY VT2 17 Các tương tác HMBC H-9 (δH 3,91 4,16) C-9′ (δC 181,5); tương tác COSY H-8′ (δH 2,66)/H-8 (δH 2,47)/H-9 (δH 3,91 4,16) gợi ý có mặt vịng butanolide cấu trúc phân tử hợp chất VT2 Các tương tác HMBC H-7 (δH 2,52) C-1 (δC 131,3)/C-2 (δC 113,3)/C-6 (δC 122,2)/C-8 (δC 42,6)/C-9 (δC 72,9)/C-8′ (δC 47,6); proton nhóm methoxy (δH 3,75) C-3 (δC 149,0); H-7′ (δH 2,85) C-1′ (δC 134,2)/C-2′ (δC 114,8)/C-6′ (δC 123,0)/C-8′ (δC 47,6)/C-9′ (δC 181,5)/C-8 (δC 42,6); proton nhóm methoxy (δH 3,79) C-3′ (δC 150,6) khẳng định vị trí hai nhóm 3-methoxy-4-hydroxyphenyl vị trí C-7 C-7′ Hằng số tương tác proton H-1 H-2 hợp phần đường, JH-1″/H-2″ = 8,0 Hz độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR nguyên tử carbon phân tử đường: C-1′′ (δC 102,9), C-2′′ (δC 74,9), C-3′′ (δC 77,8), C-4′′ (δC 71,3), C-5′′ (δC 78,1) C-6′′ (δC 62,5) gợi ý có mặt phân tử đường β-D-glucopyranosyl Thêm vào đó, tương tác HMBC glc H-1″ (δH 4,84) C-4′ (δC 146,8) xác định vị trí đường C-4′ Cấu hình tuyệt đối aglycone xác định nhờ phổ NOESY phổ CD Các tương tác NOE H-8′ (δH 2,66) Hα-9 (δH 3,91); H-8 (δH 2,48) Hβ-9 (δH 4,16)/H-7 (δH 2,52); H-7 (δH 2,52) Hα-9 (δH 3,91), gợi ý cấu hình H-8 H-8′ cấu hình trans Trên phổ CD, VT2 cho hiệu ứng Cotton âm bước sóng 226 275 nm xác định cấu hình (8R,8′R) hợp phần matairesinol [134] Từ phân tích trên, cấu trúc VT2 xác định matairesinol 4′-O-β-Dglucopyranoside Tra cứu cấu trúc VT2 Scifinder cho thấy chưa có cơng bố/cơng trình liên quan đến hợp chất này, chứng tỏ hợp chất 18 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR hợp chất VT2 hợp chất tham khảo # C C δ C 132,6 112,9 148,8 145,1 115,3 120,5 36,9 40,8 70,8 δCa,b 131,3 113,3 149,0 146,2 116,2 122,2 38,9 42,6 72,9 3-OMe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3-OMe 4-O-glc 1 2 3 4 5 6 55,6 129,0 113,5 147,5 145,1 115,4 121,6 33,8 45,7 178,6 55,6 56,4 134,2 114,8 150,6 146,8 117,8 123,0 35,3 47,6 181,5 56,7 100,2 73,3 77,1 69,7 76,9 60,7 102,9 74,9 77,8 71,3 78,1 62,5 δHa,c (J = Hz) 6,55 (d, 1,6) 6,66 (d, 8,0) 6,49 (dd, 1,6, 8,0) 2,52 (m) 2,47 (m) 3,91 (dd, 8,0, 8,8, α) 4,16 (dd, 7,2, 8,8, β) 3,75 (s) 6,73 (d, 1,6) 7,04 (d, 8,0) 6,64 (dd, 1,6, 8,0) 2,85 (dd, 6,8, 12,8) 2,66 (m) 3,79 (s) 4,84 (d, 8,0) 3,46 (dd, 8,0, 9,2) 3,45 (m) 3,38 (m) 3,38 (m) 3,67 (dd, 4,0, 10,8) 3,85 (br d, 10,8) matairesinol 4-O-β-D-glucopyranoside (đo DMSO-d6) [134], ađo CD3OD, b100MHz, c400MHz 19 3.2 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 3.2.1 Hoạt tính kháng viêm in vitro hợp chất phân lập từ loài V limonifolia Đầu tiên 12 hợp chất (VL1-VL12) từ loài V limonifolia đánh giá độ độc dòng tế bào BV2 nồng độ 20 M Kết sàng lọc cho thấy hợp chất VL11 có độc tính mạnh (tỉ lệ sống sót 59,04% < 80%), không lựa chọn đánh giá hoạt tính kháng viêm Các hợp chất cịn lại khơng gây độc dịng tế bào BV2 (tỉ lệ sống sót > 80%) Tiếp đó, hợp chất VL1-VL10, VL12 đánh giá sàng lọc ức chế sản sinh NO dịng tế bào BV2, kích thích LPS 50 µM Kết sàng lọc cho thấy tất hợp chất đánh giá thể tác dụng ức chế sản sinh NO mạnh (% ức chế > 50%) đánh giá nồng độ nhỏ hơn: 1,0, 5,0, 10, 20 µM để xác định giá trị IC50 Các hợp chất VL2 VL3 gây ức chế mạnh sản sinh NO mạnh với giá trị IC50 2,500,34 7,130,87 M Các hợp chất VL6 VL10 thể khả ức chế sản sinh NO tế bào BV2 với giá trị IC50 19,161,09, 15,881,17 M, mạnh chất đối chứng dương L-NMMA (IC50 22,101,20 M) Bốn hợp chất VL4, VL5, VL7 VL9 gây ức chế đáng kể sản sinh NO với giá trị IC50 nằm khoảng 24,70 đến 45,31 M (Thấp chất đối chứng dương, L-NMMA) Các kết thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh NO tế bào BV2 hợp chất từ loài V limonifolia gợi ý số nhận định ban đầu mối liên hệ cấu trúc hóa học hoạt tính kháng viêm hợp chất sau: - Trong số hợp chất labdane phân lập (VL1-VL3), hợp chất VL2, VL3 thể hoạt tính ức chế mạnh sản sinh NO tế bào 20 BV2 (giá trị IC50 2,500,34, 7,130,87 M) cấu trúc phân tử có nhóm hydroxy C-16, hợp chất VL1 (hoạt tính yếu) khơng có nhóm hydroxy vị trí trên; đặc biệt hợp chất VL2 có thêm nhóm hydroxy C-12 so với hợp chất VL3 thể hoạt tính ức chế NO mạnh - Các hợp chất flavonoid phân lập (VL4, VL5 VL6) thể hoạt tính ức sản sinh NO mức độ trung bình (giá trị IC50 từ 19,16 đến 39,67 M) 3.2.2 Hoạt tính kháng virus in vitro hợp chất 3.2.2.1 Hoạt tính kháng virus in vitro hợp chất từ loài V limonifolia Các hợp chất VL1-VL12 phân lập từ loài V limonifolia tiến hành đánh giá hoạt tính kháng chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) enterovirus 71 (EV71) Kết cho thấy, hai hợp chất flavonoid VL4 VL6 thể hoạt tính kháng virus mạnh tế bào nhiễm virus CVB3 với giá trị IC50 0,21 ± 0,06, 1,86 ± 0,18 μM có giá trị CC50 >50 µM (chất đối chứng dương rupintrivir có IC50 0,12 ± 0,06 μM) Đồng thời, hợp chất VL4 thể tác dụng ức chế virus HVR1B (với giá trị IC50 0,61±0,21 μM CC50 >50 µM) mạnh so với chất đối chứng dương ribavirin (IC50 48,07±1,46 μM) Hợp chất thể hoạt tính kháng virus EV71 mức độ trung bình (với giá trị IC50 32,05±0,94 μM) Kết cho thấy phạm vi kháng virus hợp chất VL4 chủng entrovirus rộng Các kết hoạt tính kháng virus enterovirus hợp chất từ loài V limonifolia cho thấy hợp chất khung flavonoid (VL4 VL6) thể hoạt tính kháng virus mạnh Nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố 21 cho thấy khả kháng số chủng enterovirus hợp chất flavonoid Kết thử nghiệm hoạt tính kháng virus in vitro từ hợp chất phân lập từ lồi V limonifolia góp phần gợi mở mối liên hệ khả kháng chủng enterovirus hợp chất flavonoid 3.2.2.2 Hoạt tính kháng virus in vitro hợp chất từ loài V trifolia Các hợp chất VT1-VT16 phân lập từ loài V trifolia đánh giá khả ức chế ba chủng entrovirus CVB3, HRV1B, EV71 nồng độ 10 M Qua đánh giá sơ hoạt tính kháng số chủng entrovirus, hợp chất VT9 cho thấy hiệu tác dụng chống lại chủng virus CVB3/ HRV1B/ EV71 nồng độ 10 M với giá trị tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót 77,14%, 80,20%, 43,35% Các hợp chất cịn lại khơng thể hoạt tính kháng chủng virus thử nghiệm KẾT LUẬN Từ lồi Vitex limonifolia Vitex trifolia, chúng tơi phân lập xác định cấu trúc 28 hợp chất nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất Từ loài Vitex limonifolia phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất Trong đó, có hợp chất vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) vitexlimolide C (VL3); hợp chất lần phân lập từ chi Vitex 5,4′-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6), verrucosin (VL7), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10) maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12); hợp chất biết khác vitecetin (VL5), 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9) maslinic acid (VL11) 22 Từ loài Vitex trifolia phân lập xác định cấu trúc 16 hợp chất Trong đó, có hợp chất 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26oic acid (VT1) matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (VT2); hợp chất lần phân lập từ chi Vitex 20-hydroxyecdysone 2,3monoacetonide (VT5); hợp chất lần phân lập từ loài V trifolia ecdysone (VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4) turkesterone (VT6); 10 hợp chất biết polypodine B (VT7), rubrosterone (VT8), luteolin (VT9), (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10), vitexin (VT11), orientin (VT12), homoorientin (VT13), 2-Orhamnosylvitexin (VT14), euscaphic acid (VT15) tormentic acid (VT16) Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro thông qua ức chế sản sinh NO tế bào BV2 12 hợp chất (VL1 - VL12) phân lập từ loài Vitex limonifolia Kết cho thấy, hợp chất VL2, VL3 thể hoạt tính kháng viêm mạnh với giá trị IC50 2,500,34, 7,130,87 M; hợp chất VL6, VL10 thể hoạt tính kháng viêm với giá trị IC50 19,161,09, 15,881,17M, giá trị nhỏ so với chất đối chứng dương sử dụng L-NMMA (IC50 22,101,20 M) Các hợp chất VL4, VL5, VL7 VL9 thể hoạt tính kháng viêm trung bình với giá trị IC50 từ 15,88 đến 72,50 M Đã nghiên cứu hoạt tính kháng virus in vitro ba chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B enterovirus 71 12 hợp chất (VL1-VL12) phân lập từ loài Vitex limonifolia 16 hợp chất (VT1-VT16) phân lập từ loài Vitex trifolia Kết cho thấy, hợp chất VL4 VL6 thể hoạt tính kháng virus mạnh tế bào nhiễm virus coxsackievirus B3 với giá trị IC50 0,21 ± 0,06 1,86 ± 0,18 μM Hợp chất VL4 thể hoạt tính kháng virus thử nghiệm kháng virus human rhinovirus 1B (với giá trị IC50 23 0,61±0,21 μM) kháng virus enterovirus 71 (với giá trị IC50 32,05±0,94 μM) Các hợp chất VT1-VT16 sàng lọc hoạt tính kháng chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B enterovirus 71, có hợp chất VT9 cho kết khả quan, nồng độ 10 μM, với giá trị tỷ lệ phần trăm tế bào sống sót 77,14%, 80,20%, 43,35% KIẾN NGHỊ Các kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi Vitex limonifolia Vitex trifolia bổ sung thêm hợp chất vào thành phần hóa học lồi Đặc biệt thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất labdane VL2 VL3 thể hoạt tính ức chế NO tế bào BV2, kích thích LPS mạnh Vì thế, tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng viêm in vivo, từ định hướng khả ứng dụng hợp chất VL2, VL3 Hợp chất VL4 VT9 thể phạm vi hoạt tính kháng virus chủng entrovirus phạm vi rộng (bao gồm chủng CVB3, HRV1B EV71) Vì cần có thêm nghiên cứu sâu hoạt tính hơp chất VL4 VT9 24 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đã phân lập xác định cấu trúc 28 hợp chất từ loài V limonifolia V trifolia Trong đó: - hợp chất từ tự nhiên, có hợp chất từ lồi V limonifolia vitexlimolide A-C (VL1-VL3); hợp chất từ loài V trifolia 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (VT1) matairesinol 4′-Oβ-D-glucopyranoside (VT2) - hợp chất lần phân lập từ chi Vitex : 5,4′-dihydroxy3,7-dimethoxyflavone (VL6), verrucosin (VL4), (VL7), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs- 11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10), maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12) 20-hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide (VT5) - hợp chất lần phân lập từ loài V trifolia ecdysone (VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4) turkesterone (VT6) Lần 12 hợp chất từ loài V limonifolia Việt Nam đánh giá hoạt tính kháng viêm thơng qua ức chế sản sinh NO tế bào BV2 kích thích LPS Kết cho thấy hợp chất vitexlimolide B-C (VL2-VL3), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10) thể hoạt tính kháng viêm mạnh với giá trị IC50 từ 2,50 µM đến 19,16 µM Lần 28 hợp chất từ loài V limonifolia V trifolia Việt Nam thử hoạt tính kháng virus in vitro chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) enterovirus 71 (EV71) Kết cho thấy, hợp chất 5,4′-dihydroxy-3,7dimethoxyflavone (VL4) thể hoạt tính kháng virus mạnh virus CVB3/HRV1B/EV71 với giá trị IC50 0,21, 0,61, 32,05 μM Hợp chất 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6) thể hoạt tính kháng chủng virus CVB3 với giá trị IC50 1,86 μM DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Ninh Khac Ban, Nguyen Thi Kim Thoa, Tran My Linh, Do Thi Trang, Phan Van Kiem, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, JaeHyoung Song, Hyun-Jeong Ko, Seung Hyun Kim Labdane-type diterpenoids from Vitex limonifolia and their antivirus activities Journal Natural Medicine, 2018, 72, 290-297 Ninh Khac Ban, Nguyen Thi Kim Thoa, Tran My Linh, Vu Huong Giang, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Tran Hong Quang, Pham Hai Yen, Chau Van Minh, Phan Van Kiem Chemical constituents of Vitex trifolia leaves Natural Product Communications 2018, 13 (2), 129-130 Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh, Vu Huong Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem Triterpenes from Vitex limonifolia Vietnam Journal of Chemistry, 2017, 55(6), 715 -719 Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh, Vu Huong Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem Flavonoid and other compounds from Vitex limonifolia Vietnam Journal of Chemistry, 2018, 56(6),679-683 Nguyen Thi Kim Thoa, Ninh Khac Ban, Do Thi Trang, Tran My Linh, Vu Huong Giang, Nguyen Xuan Nhiem, Phan Van Kiem Ecdysteroids from leaves of Vitex trifolia Vietnam Journal of Chemistry, 2018, 56(2), 127-261 Nguyễn Thị Kim Thoa, Vũ Kim Thư, Ninh Khắc Bản, Đỗ Thị Trang, Phan Văn Kiệm Các hợp chất triterpenoid ecdysteroid từ loài mạn kinh Tạp chí Nghiên cứu Khoa học cơng nghệ quân sự, 2018, Số đặc san CBES2, 83-87 Nguyễn Thị Kim Thoa, Nguyễn Thị Thu Hiền, Ninh Khắc Bản, Nguyễn Xuân Nhiệm, Đỗ Thị Trang Các hợp chất triterpene lignan phân lập từ loài Vitex limonifolia Kỷ yếu Hội nghị Gắn kết khoa học với khoa học trái đất lần thứ hai (CBES2), 2018, 17-22 ... cao ph? ?c vụ c? ?ng t? ?c b? ??o vệ, chăm s? ?c s? ?c khỏe c? ??ng đồng, chúng tơi l? ??a chọn đề tài: ? ?Nghiên c? ??u thành phần hóa h? ?c hoạt tính sinh h? ?c l? ??i Vitex limonifolia Wall Ex C. B. Clark Vitex trifolia L. ”... c? ? khoảng c? ?ng trình nghiên c? ??u thành phần hóa h? ?c số l? ??i thu? ?c chi Vitex [2-6], chưa c? ? c? ?ng b? ?? hoạt tính sinh h? ?c l? ??i thu? ?c chi Chính vậy, nhằm m? ?c đích nghiên c? ??u l? ?m rõ thành phần hóa h? ?c. .. trifolia L. ” 2 M? ?c tiêu nghiên c? ??u luận án X? ?c định thành phần hóa h? ?c chủ yếu hai loài Vitex limonifolia Wall ex C. B. Clarke Vitex trifolia L Việt Nam Đánh giá hoạt tính kháng viêm hoạt tính kháng