THÔNG TIN TÀI LIỆU
i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGÂN NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi KHÁNG ĐỒNG THỜI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 Cán hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 4/2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi được thực hiện dưới sự hướng dẫn GS.TS Chu Hồng Mâụ Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, ngày 10 tháng năm 2015 Tác giả Nguyêñ Thi PP̣hương Ngân Ban chủnhiêṃ khoa Cán bô ̣hướng dẫn khoa hoc ̣ GS.TS Chu Hồng Mâu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện để tơi hồn thành Bản lṇ văn thacc̣ si ̃này Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, cảm ơn Ban chủ nhiêṃ khoa vàcác thầy cô khoa Sinh - KTNN tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập hồn thành đề tài luận văn Tôi xin cảm ơn cán bô c̣ Phịng ADN ứng dung,c̣ Phịng thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ gen, Viêṇ Công nghê c̣ sinh hoc,c̣ Viêṇ Hàn lâm Khoa học Công nghê c̣ViêṭNam taọ điều kiêṇ vàgiúp đỡ tơi qtrình tiến hành thí nghiêṃ đềtài Tơi xin cảm ơn Tiến sỹ Lị Thị Mai Thu Thạc sĩ Lê Thị Hồng giúp đỡ tơi q trình thưcc̣ hiêṇ đềtài luận văn Đề tài luận văn thuôc ̣ chương tri ǹ h đào taọ nghiên cứu sinh cao hoc ̣ của Bô ̣ môn Di truyền & Sinh hoc ̣ hiêṇ đại, khoa Sinh-Kỹthuâṭ nông nghiêp, ̣ trường Đaị hoc ̣ Sư phaṃ - Đaị hoc ̣ Thái Nguyên Tác giả Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ii MUCc̣ LUCc̣ iii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 1.1 SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ BEAN YELLOW MOSAIC VIRUS 1.1.1 Bệnh khảm ở đậu tương 1.1.2 Hệ gen SMV, BYMV Potyvirrus 1.2 ỨNG DUNGc̣ KỸTHUÂṬ RNAi TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS 11 1.2.1 Cây thuốc vàbệnh virus thuốc 11 1.2.2 Cơ chế RNA interference (RNAi) 14 1.2.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo trồng chuyển gen kháng 16 virus 1.3 ỨNG DUNGc̣ KỸTHUÂṬ PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH CÂY 18 CHUYÊN GEN ̉ Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ́ 22 ́ 2.1 VÂṬ LIÊU,c̣ HÓA CHÂT VÀ THIÊT BI .c̣ 22 2.1.1 Vật liệu 22 2.1.2 Hóa chất 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv 2.1.3 Thiết bị 22 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens 23 2.2.2 Phân tích sự có mặt cấu trúc chuyển gen pK7GW/SMVBYMV-CPi phương pháp PCR………………………………… 26 2.2.3 Lây nhiễm nhân tạo SMV BYMV vào lácây thuốc …… 28 2.2.4 Phân tích số lượng virus thuốc chuyển gen chứa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) ky ̃thuâṭReal time RT- 29 PCR………………………………………………………………… Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 ́ ̉ ́ 3.1 KÊT QUẢ CHUYÊN CÂU TRÚC pK7GW/SMV-BYMV-CPi ́ VÀO THUÔC LÁ 30 3.1.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch A tumeffaciens cảm ứng tạo 30 cuṃ chồi 3.1.2 Tạo rễ phát triển chuyển gen hoàn chỉnh …………… ́ 33 ̉ 3.2 KÊT QUẢPHÂN TÍCH CÂY THUỐC LÁCHUYÊN GEN 35 3.2.1 Kết kiểm tra cấu trúc RNAi dòng thuốc chuyển gen 35 3.2.2 Phân tích khả kháng virus dòng chuyển gen CPi (SMV-BYMV) điều kiêṇ lây nhiêm ̃ nhân tạo 36 ́ ̀ KÊT LUẬN VÀ ĐÊ NGHI…………………………………… c̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 40 41 iv DANH MỤC CÁC TƯ VÀ CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP BGMV BYMV bp CP CTAB cs ĐC EDTA DNA GA3 GM hpRNA IhpRNA IAA IBA 6-Benzyl Amino Purine Bean Golden Mosaic Virus Bean yellow mosaic virus Base pair (cặp base) Coat protein (protein vỏ) Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Cộng sự Đối chứng Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid Deoxyribo Nucleic Acid Gibberellic acid Môi trường tạo chồi Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) Indoleacetic acid Indole-3butyric acid Kilo base Kb Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v LB Luria and Bertani MS Môi trường theo Murashige Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction RM Môi trường rễ RNAi RNA interference siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus T0, T6, T12 Các dòng thuốc chuyển gen TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Vir Virulence Region WT1, WT2, WT3 Cây thuốc khơng chủn gen Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần loại môi trường tái sinh in vitro………… 24 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số…………… 26 Bảng 2.3 Trình tư c̣nucleotide căpc̣ mồi PCR khuếch đaịđoaṇ Cpi 28 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen Cpi 28 Bảng 3.1 Kết cảm ứng chồi từ mảnh lá………………………… 31 Bảng 3.2 Kết tạo chồi từ mảnh lá……………………………… 33 Bảng 3.3 Kết quảtạo rễ tái sinh thuốc ở thí nghiệm đối chứng………………………………………………………………… 34 Bảng 3.4 Kết định lượng sự có mặt virus SMV thuốc chuyển gen………………………………………………… Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lá đậu tương bị nhiễm SMV Hình 1.2 Sơ đồcấu trúc hệ protein potyvirus Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) .11 Hình 1.4 Cây thuốc giống C9-1 11 Hình 1.5 Cơ chế hoạt động RNAi 15 Hinh̀ 3.1 Các mảnh được ngâm dung dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens tái tổhơpc̣ 31 Hình 3.2 Hinh̀ ảnh phát sinh cuṃ chồi 32 Hình 3.3 Hình ảnh tạo rễ mơi trường kháng sinh chọn lọc 34 Hinh̀ 3.4 Các dòng thuốc láchuyển gen ởthếhê T c̣ trồng châụ nhàlưới 35 Hình 3.5 Kết quảđiện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyển gen 35 Hình 3.6 Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoaṇ CPi (SMV-BYMV) từ 21 dòng thuốc chuyển gen 36 Hinh̀ 3.7 Hinh̀ ảnh mơṭsốdịng thuốc láchủn gen vàđối chứng 37 Hình 3.8 Đồ thị khuếch đại đoaṇ cDNA từ mẫu thuốc phân tích Real time RT-PCR 38 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) loại trồng cạn có giá trị kinh tế hàm lượng dinh dưỡng cao Hạt đậu tương được dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc Ngoài sản phẩm khơ dầu đậu tương cịn được dùng làm mực in, sơn, xà phòng, chất dẻo, thuốc trừ sâu Hạt đậu tương được dùng nhiều y học, giúp tránh hiện tượng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già; hạn chế bệnh loãng xương ở phụ nữ; bệnh đái tháo đường, thấp khớp Ngoài đậu tương trồng ngắn ngày, thích hợp cho luân canh, xen canh gối vụ với nhiều loại khác cải tạo đất tốt [4] Việt Nam nước nông nghiệp, đậu tương trồng chủ đạo Mặc dù bắt đầu tiến hành sản xuất quy mô công nghiệp từ năm 2011 Việt Nam vẫn tiếp tục phải nhập phần lớn lượng bột đậu tương nhằm bù đắp sự thiếu hụt thực phẩm protein nước đáp ứng nhu cầu ngày tăng ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Năng suất sản lượng đậu tương nước ta ở mức thấp có thể nguyên nhân như: Nhiều giống hiện trồng suất tính ổn định chưa cao, sức biến động lớn miền, vùng; Khả kháng virus sâu bệnh giống đậu tương trồng thấp; Chưa có dự báo thời vụ gieo trồng thích hợp cho vùng Đậu tương số trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, ví dụ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng ở đậu tương (Soybean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn lá, bệnh gỉ sắt hại đậu tương nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ nấm Rhizoctonia solani Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 33 Bảng 3.2 Kết tạo chồi từ mảnh Cấu trúc RNAi pK7GW-CPi (SMV- BYMV) ĐC0 ĐC1 Bảng 3.2 cho thấy 95% mảnh lô đối chứng ĐC1 không chuyển gen thu được chồi, với tỉ lệ trung bình 2,7 chồi/mảnh Số lượng mẫu tạo chồi trung bình ở lơ chủn gen 25 số chồi trung bình 2,62 chồi/mảnh Như vậy, có sự khác số lượng mảnh có cảm ứng mơi trường chọn lọc, tỉ lệ tạo chồi khác không đáng kể lô chuyển gen lô không chuyển gen 3.1.2 Tạo rễ phát triển chuyển gen hoàn chỉnh Tạo rễ khâu cuối nuôi cấy in vitro có ý nghĩa quan trọng đối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật Những nghiên cứu tái sinh chuyển gen thuốc ghi nhận IBA, NAA IAA hormone sinh trưởng được lựa chọn nghiên cứu tạo rễ bổ sung IBA 0,0001g/l Nồng độ chất điều khiển sinh trưởng dao động khoảng 0,1 mg/l Cụm chồi tuần tuổi có chiều cao 1cm được tách nhỏ chuyển sang môi trường tạo rễ Sau 4-5 tuần, quan sát thấy rễ xuất hiện ở hầu hết chồi (Hình 3.3 Bảng 3.3) Các chồi phát triển xanh tốt tạo nhiều mới Quan sát thấy chồi không chủn gen mơi trường đối chứng có q trình tạo rễ tương tự Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 34 Hình 3.3 Hình ảnh tạo rễ môi trường kháng sinh chọn lọc Bảng 3.3 Kết quảtạo rễ tái sinh thuốc ở thí nghiệm đối chứng Cấu trúc RNA pK7GW-CPi (SM BYMV) ĐC0 ĐC1 Bảng 3.3 cho thấy với tổng số chồi ở lô thi ń ghiêṃ thu đươcc̣ 40 sống sót vàcó35 rê; ̃ bầu 25 vàđem trồng taịnhàlưới Ở lô đối chứng có87 sống, 80 rê, ̃ cho bầu 40 vàđem trồng 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 35 Những thuốc láchuyển gen trồng ởnhàlưới biểu hiện xanh tốt, mập mạp (Hiǹ h 3.4) Hinh̀ 3.4 Các dòng thuốc láchuyển gen ởthếhê T c̣ trồng châụ nhàlưới ́ ́ ̉ 3.2 KÊT QUẢ PHÂN TÍCH CÂY THUÔC LÁ CHUYÊN GEN 3.2.1 Kết quả kiểm tra cấu trúc RNAi dòng thuốc chuyển gen Các dòng thuốc chuyển gen sau trồng nhà lưới được khoảng 3-4 tuần tiến hành thu tách chiết DNA tổng sốvàthực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt đoaṇ gen chuyển CPi Từ mẫu non 21 dòng thuốc chuyển gen ở hệ T trồng nhà lưới sau - tuần DNA tổng số được tách chiết điện di gel agarose 0,8%, kết quảđươcc̣ thểhiêṇ ởhinh̀ 3.5 12 10 1112 1314 1516171819 2021 Hình 3.5 Kết quảđiện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyển gen (1-21: Băng DNA của 21 dòng thuốc chuyển gen) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 36 PCR đươcc̣ thưcc̣ hiêṇ với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R vàkết điện di sản phẩm PCR gel agarose hình 3.6 cho thấy, tất 21 dịng dương tính với phản ứng PCR, băng điện di sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 500 bp, tương tự kết ở mẫu đối chứng dương Kích thước hồn tồn phù hợp với ki ć h thước cấu trúc CPi (SMV-BYMV) Vì vậy, có thể khẳng định cấu trúc CPi (SMV-BYMV) được chuyển thành công vào thuốc giống C9-1 (+) (-)M1 500 bp Hình 3.6 Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoaṇ CPi (SMVBYMV) từ 21 dòng thuốc chuyển gen 1-21: 21 dòng thuốc chuyển gen; (+) Đối chứng dương plasmid pK7GW-CPi (SMV-BYMV); (-) Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ thuốc không chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) 3.2.2 Phân tích khả kháng virus dòng chuyển gen CPi (SMV-BYMV) điều kiêṇ lây nhiễm nhân taọ Để kiểm tra tính kháng virus khảm lá, 21 dịng thuốc chuyển gen dương tính với PCR 10 dòng đối chứng không chuyển gen được lây nhiễm dicḥ chứa SMV vàBYMV qua ba lần, lần cách 15 ngày Sau lần lây nhiễm, dòng thuốc được quan sát sự biểu hiện bênḥ khảm Kết quảđãxác đinḥ đươcc̣ dòng thuốc lákháng bênh,c̣ dòng nhiêm ̃ bênḥ vàcác đối chứng không chuyển gen Những đối chứng dòng chuyển gen nhiêm ̃ bệnh nhiễm hai loài SMV Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 37 BYMV biểu hiêṇ có bị khảm vàxoăn, cịi cọc sinh trưởng Trong đó, dịng kháng hồn tồn vẫn sinh trưởng phát triển bình thường, xanh tốt (Hình 3.7) Như vậy, phương pháp lây nhiễm nhân taọ SMV vàBYMV nguồn nhiễm bệnh khảm có thể áp dụng tốt để đánh giá khả kháng cho dòng thuốc chuyển cấu trúc CPi (SMVBYMV) T05 WT1 T012 WT2 T019 WT3 Hinh̀ 3.7 Hình ảnh mơṭsốdịng thuốc láchủn gen vàđối chứng T05, T012, T019- Dòng thuốc chuyển gen; WT1, WT2, WT3- Cây thuốc không chuyển gen Số lượng virus SMV dòng thuốc chuyển gen chứa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) không chuyển gen (WT) đươcc̣ kiểm tra phản ứng Real time RT- PCR Sử dungc̣ dòng thuốc chủn gen khơng có triệu chứng bệnh làT 05, T012; T019 thuốc không chuyển gen có triệu chứng bệnh nặng làWT1, WT2, WT3 ở lần lây nhiễm nhân tạo thứ làm vật liệu cho phản ứng Real time RT-PCR Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 38 RNA tổng số được tách từ 1g thuốc lá, sau sử dụng µg RNA tổng số cho phản ứng tổng hợp cDNA Đường chuẩn được xây dựng từ phản ứng có số lượng tế bào E coli mang vector pBT-SMV tái tổ hợp được xác định buồng đếm tế bào Hàm lượng DNA mẫu chuẩn có hàm lượng tương ứng là: 1000, 100 10 DNA/µl (1 tế bào tương ứng với sao) Phương trình đường chuẩn được dựng dựa phản ứng Real time RT- PCR với cặp mồi SMVqF/SMVqR, phương trình đường chuẩn tuyến tính để xác định số DNA theo chu kỳ ngưỡng được lập có dạng: Y= -168,15x + 4202,7 R2 = 0,898 Hình 3.8 Đồ thị khuếch đại đoaṇ cDNA từ mẫu thuốc phân tích Real time RT-PCR Từ kết ở hình 3.8, số liệu chu kỳ ngưỡng phát hiện virus SMV lượng sao/1 g thuốc được trinh̀ bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4 cho thấy, virus SMV có mặt ở mẫu thuốc chuyển gen không chuyển gen sau lây nhiễm virus nhân tạo Trong không chuyển gen số lượng SMV trung bình 810 cao 1,93 lần so với chuyển gen (trung bình 418,67 sao) Do sự hoạt động cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) có mặt hệ gen SMV bị phân Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39 hủy theo RNAi số lượng SMV thuốc chuyển gen thấp Tuy nhiên, chuyển gen số lượng SMV khác nhau, dịng T 01 có386 sao, T 02 lên tới 466 sao, T03 có 404 Như vậy, mức độ biểu hiêṇ tính kháng bệnh ởcác dịng chủn gen có sự khác Kết quảphân ti ́ch Real time PCR đa ̃ cho thấy cấu trúc RNAi CPi(SMV-BYMV) đa ̃ biểu hiêṇ tăng cường tiń h kháng SMV ởcác dòng thuốc láchuyển gen Bảng 3.4 Kết định lượng sự có mặt virus SMV thuốc chuyển gen Tên mẫu (-) WT1 WT2 WT3 T01 T02 T03 1x 10x 100x Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 40 ́ KÊT LUẬN VÀĐỀ NGHI P̣ Kết luâṇ 1.2 Cấu trúc RNAi pK7GW-SMV-BYMV-CPi đa ̃đươcc̣ chuyển thành công vào mô lácây thuốc lágiống C9-1 thông qua lây nhiễm A tumefaciens 1.3 Phân tích dịng thuốc láchủn gen đa ̃xác đinḥ đươcc̣ 21/21 dòng thuốc chuyển gen ởthếhê T c̣ dương tinh́ với phản ứng PCR 1.4 Các dòng thuốc chuyển gen vàcây WT đa ̃đươcc̣ lây nhiêm ̃ nhân taọ virus khảm, kỹthuâṭReal time RT-PCR đa ̃ xác đinḥ đươcc̣ WT số lượng SMV cao 1,93 lần so với chuyển gen Như cấu trúc CPi (SMV-BYMV) biểu hiện tăng cường tinh ́ kháng SMV ở dòng thuốc láchuyển gen Đềnghi P̣ Tiếp tucc̣ theo dõi, phân tić h vàđánh giátiń h kháng với SMV dòng thuốc chuyển gen ở c̣sau Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Vũ Thị Bản, Đào Đức Thức, Chu Hoàng Hà Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) Báo cáo khoa học 2007 Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ Nguyễn Liên Chi, Nguyễn Hữu Hồ, Nguyễn Văn Uyển, 1989 Chuyển gen kháng kanamycin vào mô thuốc (N.tabacum) mô của cà úc vi khuẩn A.tumefaciens Tạp chí di truyền 1/1989 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Trần Quốc Dung, Nguyễn Hồng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Cơng nghệ chuyển gen, Nxb Đại học Sư phạm, Huế Chu Hồng Hà, Đỗ Xn Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011), Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004), Đánh giá tính đa dạng dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam thơng qua tách dịng, xác định so sánh trình tự gen mã hố protein vỏ (CP)”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(4):451-459 Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật, Nxb Nơng nghiệp VũTriệu Mân (2007), Giáo trình Bệnh chuyên khoa Đại học Nông Nghiệp Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 10 Chu Hồng Mậu, Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên năm 2008 11 Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn bệnh virus hại trồng, Nxb Giáo dục 12 Nguyễn Đức Thành (2008), Chuyển gen thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên Cơng nghệ Lị Thị Mai Thu, Hồng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Đặc điểm đoạn gen ma ̃ hóa coat protein phân lâpc̣ từ 13 Soybean Mosaic Virus Tap ̣ chiś inh hoc ̣ 36 (1se), tr 283-292 14 Lò Thị Mai Thu, Lê Hồng Trang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Nghiên cứu taọ đậu tương chuyển gen kháng soybean mosaic virus vàbean yellow mosaic virus Tạp chí khoa học & Công nghê- ̣ Đaị hoc ̣ Thái Nguyên, 115 (02), tr 111-115 15 Lê Đình Thụy, Phạm Kiến Nghiệp, 1996 Trồng chế biên thuốc NXB T/p Hơ Chí Minh 16 Đỗ Năng Vịnh (2007) Cơng nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(3): 265275 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 17 Afanasiev M M., Morris H E (1952), “Bean Virus (yellow) on Great Northern bean in Montana”, Phytopathology, 42, pp 101-104 18 Atreya, C.D., Raccah, B., and Pirone, T.P 1990 A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus Virology 178: 161-165 19 Atreya, P.L., Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1991 Amino acid substitution in the coat protein result in loss of insect transmissibility of a plant virus Proc Natl Acad Sci USA 88:7887-7891 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 20 Atreya, P.L., Lopez-Moya, J J., Chu, M Atreya, C.D., and Pirone, T.P 1995 Mutational analysis of the coat protein N-terminal amino acids involved in potyvirus transmis sion J Gen Virol 76:265-270 21 Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall, l.,Arya N., Patel H.R.H 2005 Basic principles of real – time quantitative PCR Expert Rev Mol Diagn.,5:1-11 22 23 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431(7006) : 356-63 Bubner B., Gase K., Baldwin I T (2004), “Two - fold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by real time PCR”, BMC Biotechnology, 4, pp 4-14 24 Bustin S.A., Nolan T.2004 Pìfalls of quantitative real – time Reverse- transcription Polymerase Chain Reaction Joiurnal of Biomolecular Techniques 15:155-166 25 Brunt A A., Crabtree K., Dallwitz M J., Gibbs A J., Watson L., Zurcher E J (2003), Plant Viruses Online, Descriptions and Lists from the VIDE Database Version: 20th August 1996 26 Chicas., Macino, 2001 Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing EMBO (11): 992-6 27 Dahmer M L., Hildebrand D F., Collin, G B (1992), “Comparative protein accumulation patterns in soybean somatic and zygotic embryos”, In Vitro Cell Dev Biol, 28, pp 106–114 28 DeCleene M., DeLey J (1976), “The host range of crown gall”, Bot Rev pp 389–466 29 Di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA- mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res 14(6): 989-94 coat protein, partial cds, isolate: OK2”, Plant Virology 30 Gal-On, A., Antignus, Y., Rosner, A., Raccah, B 1992 A zucchini yellow mosaic virus coat protein gene mutations restores aphid Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 44 transmissibilty but has no effect on multiplication J Gen Virol 73:21832187 31 Gibbs A., Harrison B.(1976), Plant virology the principles, Edward Amold 32 Gough K H., Shukla D D (1992), “Major sequence variations in the N - terminal region of the capsid protein of a severe strain of passion fruit woodiness potyvirus”, Arch Virol., 124, pp 389-396 33 Hartman G L., Sinclair J B., Rupe J C (1999), “Compendium of Soybean Diseases, Fourth Edition”, The American Phytopathological Society Press, Minnesota, USA 34 Hartman G L., West E D., Herman, T K (2011), “Crops that feed the World Soybean-worldwide production, use and constraints caused by pathogens and pests”, Food Sec., 3, pp 5–17 35 Hill J., Bailey T B., Benner H I., Tachibana H., Durand D P (1987), “Soybean mosaic virus: Effects of primary disease incidence on yield and seed quality”, Plant Disease, 71, pp 237-239 36 Hill J H (1999), Soybean mosaic virus In Compendium of Soybean Diseases, 4th edn, pp 70–71, Edited by G L Hartman J B Sinclair & J C Rupe St Paul, MN: American Phytopathological Society 37 Hunt M.Real-time PCR Microbiology and Immunology On-line 38 Jayaram, Ch., Hill, J.H., and Miller, W.A 1992 Complete nucleotide sequences of two soybean mosaic virus strains differentiated by response of soybean containing the Rsv resistance gene J Gen Virol 73:2067-2077 39 Jayaram, Ch., Hill, J.H., Miller, W.A 1991 Nucleotide sequences of the coat protein genes of two aphid-transmissible strains of soybean mosaic virus J Gen Virol 72:1001-1003 40 Jimenez V M (2001), “Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on the role of endogenous hormones”, Rev, Bras Fisiol Veg., 13, pp 196-223 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 41 Kirichenko A N (2013), “The characterization of bean yellow mosaic virus isolated from soybean”, Mikrobiol Z., 75 (3), pp 68-73 42 Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2014) Designing an RNA interference structure aims at creating transgenic soybean plants resistant to both Soybean Mosaic Virus (SMV) and Bean Yellow Mosaic Virus (BYMV) in Vietnam International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (3), pp 43 Pradeep K., Satya V K., Selvapriya M., Vijayasamundeeswari A., Ladhalakshmi D., Paranidharan V., Rabindran R., Samiyappan R., Balasubramanian P., Velazhahan R (2012), “Engineering resistance against Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA interference”, Biologia Plantarum, 56 (4), pp 735-741 44 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W., (1984), “Ribosomal DNA spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp 8014-8018 45 Selvaraj T., Nisha M C., Rajeshkumar S (2009), “Effect of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi on some growth parameters and phytochemical constituents of Pogostemon patchouli Pellet”, Maejo international journal of science and technology, (1), pp 222-234 46 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM(2000)Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature, 407, pp 319-323 47 Shukla D D., Ward C W (1988), “Amino acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group”, J Gen Virol., 69, pp 2703-2710 48 Shukla D D., Ward C W., Brunt, A A (1994), The Potyviridae, CAB International, University Press, Cambridge, UK Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46 49 Somers D.A., Samac D.A., Olhoft P.M., (2003), “Recent advances in legume transformation”, Plant Physiol, 131, pp 892-899 50 Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection Appl Biochem Biotechnol Epub ahead of print 51 Topping JF (1998) Tobacco transformation, Methods of Mol Biol, 81: 365 – 372 52 Vanderveken J J., Harris K F.,Maramorosch K (1977), Oils and other inhibitors of nonpersistent virus transmission, In Aphids as Virus Vectors Academic Press, London, pp 435-454 53 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64 54 Won S L, Yul H K., Kook H K (2003), “Complete Genome Sequences of the Genomic RNA of Soybean mosaic virus Strains G7H and G5”, Plant Pathol., 19 (3), pp 171-176 55 Yan P Q., Bai X Q., Wan X Q., Guo Z K., Li L J., Gong H Y., Chu C C (2007), “Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection”, Yi Chuan, 29 (8), pp 1018-22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... c̣Mai Thu vàcs (2014) đa ̃thành công phân lâpc̣ gen CP từ c? ?gen SMV [13], thiết kếvector mang cấu trúc RNAi kháng SMV v? ?kháng đồng thời c? ?SMV v? ?BYMV, chuyển thành công cấu trúc RNAi vào đâụ... tiêu nghiên cứu Tạo được dòng chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng virus gây bênḥ khảm từ giống thuốc C9-1 Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu tạo thuốc chuyển gen ky ̃ thuâṭbiến nạp cấu. .. thuật RNAi Xuất phát từ sở lựa chọn tiến hành Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn đề tài: ? ?Nghiên cứu tạo dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV BYMV? ??
Ngày đăng: 09/06/2021, 06:45
Xem thêm: