Để tăng cường sự tham gia của hợp tác xã cần đẩy mạnh công tác tuyên truyền, đào tạo, tập huấn, tư vấn, hỗ trợ các hợp tác xã nâng cấp, hoàn thiện sản phẩm theo tiêu chuẩn sản phẩm OCOP, hướng dẫn, thực hiện các hoạt động xúc tiến thương mại nâng cao giá trị sản phẩm OCOP. Các cơ quan cấp trung ương và các địa phương tiếp tục ban hành các cơ chế chính sách cụ thể để thực hiện những giải pháp nhằm tạo ra được các sản phẩm hàng hóa có giá trị. Mời các bạn tham khảo!
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 01(122)/2021 HOẠT ĐỘNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens B894 VỚI VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Lê Lưu Phương Hạnh*1, Nguyễn Hoàng Chi Mai2, Trần Ngọc Phương Linh3, Lê Văn Hậu1, Nguyễn Đăng Quân1, Ngô Huỳnh Phương hảo1 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, ba thành phần khác dịch nuôi cấy vi khuẩn (gồm: toàn sản phẩm tế bào whole cell product (WCP), sản phẩm nội bào - intracellular product (ICP) sản phẩm ngoại bào - extracellular product (ECP) Bacillus amyloliqeufaciens B894 kiểm tra hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila Ngoại trừ ICP, WCP ECP đối kháng với vi khuẩn gây bệnh môi trường theo thời gian Dịch ni cấy WCP có hiệu việc ức chế phát triển vi khuẩn gây bệnh môi trường thạch lỏng Kết khảo sát môi trường thạch cho thấy đường kính vịng vơ khuẩn đạt 16,3 ± 0,6 mm (A hydrophila) 29,7 ± 0,6 mm (E ictaluri) Khi đồng nuôi cấy B amyloliquefaciens B894 vi khuẩn gây bệnh với nồng độ lớn 10 lần B amyloliquefaciens B894 kìm hãm hồn tồn phát triển E ictaluri sau 15 A hydrophila sau 36 Dịch ECP B amyloliquefaciens B894 thể hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh bổ sung trực tiếp vào môi trường ni cấy lỏng Sau 24 ni cấy khơng cịn thấy diện vi khuẩn gây bệnh môi trường Đây sở cho nghiên cứu để ứng dụng B amyloliquefaciens B894 ni trồng thủy sản Từ khóa: hành phần tế bào, hoạt tính đối kháng, Bacillus amyloliquefaciens, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila I ĐẶT VẤN ĐỀ Phương pháp phòng trị bệnh truyền thống trước cá tra lạm dụng thuốc kháng sinh hóa chất diệt khuẩn, dẫn đến việc gia tăng vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh Kiểm soát sinh học cách sử dụng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng kỳ vọng trở thành phương pháp thay để phòng ngừa kiểm soát bệnh vi khuẩn (Afrin, 2019) Trong mối quan hệ đối kháng, số vi sinh vật gián tiếp ức chế tác nhân gây bệnh làm giảm phát triển chúng cách thay đổi pH, áp suất thẩm thấu sức căng bề mặt Một số vi sinh vật khác lại trực tiếp hạn chế phát triển vi sinh vật khác thông qua sản xuất bacteriocin, kháng sinh, hợp chất gây độc hợp chất kháng khuẩn (Afrin, 2019) Các nhà khoa học phân lập nhiều chủng vi sinh vật có lợi thuộc chi Bacillus B subtilis (Das et al., 2005), B circulans (Ghosh et al., 2014), B atrophaeus (Shelar, 2012) … có khả ức chế tác nhân gây bệnh thủy sản, có B amyloliquefaciens (Afrin, 2019) B amyloliquefaciens vi khuẩn khơng gây bệnh, có quan hệ di truyền gần với B subtilis Lồi có khả tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp với hoạt tính kháng khuẩn (Afrin, 2019) Nghiên cứu Haipeng Cao (2011), chứng minh sản phẩm ngoại bào chủng B amyloliquefaciens G1 có khả kháng A hydrophila gây bệnh lươn Dịch ngoại bào ECP ngăn cản phát triển A hydrophia, tạo rõ vòng vô khuẩn đĩa nuôi cấy (Haipeng Cao, 2011) Das cộng tác viên (2005) khảo sát tác động đối kháng thành phần tế bào từ vi khuẩn P luorescens, P aeruginosa, P putida chủng A hydrophila thấy dịch ni cấy gồm tồn sản phẩm tế bào (WCP), sản phẩm tế bào bị giết nhiệt (HK WCP), dịch ngoại bào (ECP) dịch nội bào (ICP) vi khuẩn ức chế phát triển A hydrophila Nghiên cứu cho thấy mức độ kháng lại A hydrophila thành phần cao so với kháng sinh (như acid nalidixic, chloramphenicol, oxytetracyline, gentamycin …) Năm 2017, nghiên cứu đặc tính chế đối kháng chủng B pumilus H2 vi khuẩn Vibrio gây bệnh cá, Xi-Yan cộng tác viên xác định chất kháng Vibrio nằm dịch ngoại bào, với nồng độ ức chế tối thiểu dao động từ 0,5 đến 64 µg/ml (Xi-Yan, 2017) Phịng Cơng nghệ sinh học hủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh học hành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên hành phố phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Tơn Đức hắng hành phố Hồ Chí Minh 113 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 01(122)/2021 Ở nghiên cứu này, sử dụng vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 phân lập Phú Thứ, tỉnh Cần Thơ, vi khuẩn đối kháng với tác nhân gây bệnh E ictaluri A hydrophila Khảo sát phương pháp giếng khuếch tán cho thấy vịng vơ khuẩn đo 29 mm (đối với E ictaluri) 15 mm (đối với A hydrophila) Nghiên cứu đưa thơng tin chi tiết hoạt tính, mức độ, thời gian đối kháng chủng B amyloliquefaciens B894 II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên ću Chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 có hoạt tính đối kháng phân lập từ mẫu bùn Cần hơ Chủng vi khuẩn gây bệnh E ictaluri 5H A hydrophila AG1 có độc lực mạnh lưu trữ phòng CNSH hủy sản, Trung tâm CNSH thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Phương pháp nghiên ću 2.2.1 Chuẩn bị thành phần tế bào Ba thành phần tế bào khác chuẩn bị dựa theo mô tả Das cộng tác viên từ chủng B amyloliquefaciens B894, gồm: WCP, ICP ECP Chủng B amyloliquefaciens B894 nuôi cấy 150 mL môi trường Brain heart infusion (BHI), 37oC, 24 Sinh khối chia thành ống 50 mL, sử dụng để thu nhận thành phần tế bào (Das, 2005) - Thu nhận WCP: Sinh khối vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 thu nhận sau 24 nuôi cấy, ly tâm 2500 xg 20 phút 4oC, rửa lần với PBS 1X pH 7,2 (gồm: g NaCl, 200 mg KCl, 1,44 g Na2HPO4 245 g KH2PO4) và huyền phù lại với PBS theo 1/2 thể tích ban đầu Dịch huyền phù sử dụng cho thí nghiệm - hu nhận ECP: Đối với thí nghiệm đĩa thạch, thu nhận phần dịch vi khuẩn sau 24 nuôi cấy cách ly tâm lọc qua màng lọc 0,45 µm để loại bỏ hồn tồn phần cặn vi khuẩn cịn sót lại sau ly tâm Dịch sử dụng để khảo sát hoạt tính đối kháng với tác nhân gây bệnh đĩa thạch mơi trường lỏng 114 Đối với thí nghiệm khảo sát hoạt tính ECP vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 theo thời gian, ECP thu theo mốc thời gian 0h, 4h, 8h, 12h, 16h, 20h 24h (kí hiệu ECP0, ECP4, ECP8, ECP12, ECP16, ECP20, ECP24) lọc qua màng lọc 0,45 µm - hu nhận ICP Sau 24 nuôi cấy, sinh khối vi khuẩn thu nhận cách ly tâm rửa lần với PBS 1X (pH 7,2) huyền phù PBS (2% so với thể tích ban đầu) Sau đó, dịch khuẩn phá vỡ tế bào sóng siêu âm với tần số 50Hz 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm để sử dụng cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính đối kháng 2.2.2 Khảo sát hoạt tính đối kháng thành phần tế bào vi khuẩn Các phương pháp nghiên cứu thực điều chỉnh dựa theo mô tả Sabina (2016) a) Phương pháp giếng khuếch tán môi trừng thạch Vi khuẩn E ictaluri 5H A hydrophila AG1 nuôi cấy môi trường BHI lỏng, sau 24 thu nhận trãi đĩa petri chứa môi trường MHA với mật độ khoảng 105 CFU/mL Tạo giếng với đường kính mm mặt thạch Hút 30 ul thành phần tế bào WCP, ECP ICP chuẩn bị cho vào giếng sử dụng dịch vi khuẩn không qua ly tâm (bao gồm dịch sinh khối tế bào) vào giếng đối chứng Quan sát kết vòng đối kháng sau 24 A hydrophila 48 E ictaluri b) Phương pháp đồng nuôi cấy môi trừng lỏng Lần lượt chuẩn bị môi trường BHI lỏng để đồng nuôi cấy thành phần tế bào B amyloliquefaciens B894 với tác nhân gây bệnh Dịch ICP ECP bổ sung vào môi trường nuôi cấy theo tỷ lệ 3(ICP) : 7(BHI) 1(ECP) : 1(BHI) Trong đó, WCP bổ sung vào môi trường BHI lỏng với nồng độ ban đầu khoảng 105 CFU/mL Sau đó, vi khuẩn E ictaluri 5H A hydrophila AG1 bổ sung vào môi trường với mật độ ban đầu khoảng 105 CFU/mL Sau 24 giờ, mật độ vi khuẩn E ictaluri A hydrophila môi trường kiểm tra phương pháp trải đĩa đếm khuẩn lạc Dịch vi khuẩn pha loãng theo hệ số 10 trải mơi trường BHI có bổ sung chloramphenicol (50 µg/mL) mơi trường Rimler-Shotts (RS) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 01(122)/2021 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian thu nhận ECP vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 đến hoạt tính đối kháng Ở thí nghiệm này, ECP B amyloliquefaciens B894 thu nhận mốc thời gian 0, 4, 8, 12, 16, 20 24 trình bày mục 2.2.2 bổ sung vào môi trường BHI lỏng theo tỷ lệ 1(ECP) : 1(BHI) Sử dụng mơi trường có bổ sung ECP để nuôi cấy dịch vi khuẩn E ictaluri A hydrophila mật độ ban đầu khoảng 105 CFU/mL Sau 24 giờ, mật độ E ictaluri A hydrophila kiểm tra phương pháp trải đĩa đếm khuẩn lạc 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng mật độ B amyloliquefaciens B894 đến hoạt tính đối kháng Các mốc thời gian khảo sát thí nghiệm thực dựa theo kết nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu (kết khơng trình bày báo này) a) Ảnh hưởng mật độ B amyloliquefaciens B894 đến hoạt tính đối kháng với E ictaluri hí nghiệm với E ictaluri 5H chia thành nghiệm thức, có nghiệm thức đồng ni cấy B amyloliquefaciens B894 với E ictaluri 5H nghiệm thức đối chứng Mật độ E ictaluri sử dụng thí nghiệm 105 CFU/mL Dịch vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 bổ sung vào môi trường BHI lỏng với mật độ từ 103 CFU/mL đến 106 CFU/mL Mật độ sử dụng cụ thể mô tả theo nghiệm thức sau: TNE1: 103 CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL E ictaluri 5H; TNE2: 104 CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL E ictaluri 5H; TNE3: 105 CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL E ictaluri 5H; TNE4: 106 CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL E ictaluri 5H; ĐCB1: 103 CFU/mL B amyloliquefaciens 894; ĐCB2: 104 CFU/mL B amyloliquefaciens 894; ĐCB3: 105 CFU/mL B amyloliquefaciens 894; ĐCB 4: 10 CFU/mL B amyloliquefaciens 894; ĐCE: 105 CFU/mL E ictaluri 5H Dựa vào hình thái khuẩn lạc đặc trưng, mật độ vi khuẩn E ictaluri 5H B amyloliquefaciens 894 kiểm tra theo mốc thời gian 0, 5, 10, 15, 20 25 mơi trường BHI (50 µg/mL chloramphenicol) Tryptone Soya agar (TSA) b) Ảnh hưởng mật độ B amyloliquefaciens B894 đến hoạt tính đối kháng với A hydrophila hí nghiệm với A hydrophila AG1 chia làm nghiệm thức, với nghiệm thức đồng nuôi cấy B amyloliquefaciens B894 nghiệm thức đối chứng Mật độ A hydrophila sử dụng 105 CFU/mL Dịch vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 bổ sung vào môi trường BHI lỏng với mật độ từ 104 CFU/mL đến 106 CFU/mL Mật độ sử dụng mô tả cụ thể theo nghiệm thức sau: TNA1: 104 CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL A hydrophila AG1; TNA2: 105CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL A hyT6phila AG1; TNA3: 106 CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL A hydrophila AG1; ĐCB1: 104 CFU/mL B amyloliquefaciens 894; ĐCB2: 105 CFU/mL B amyloliquefaciens 894; ĐCB3: 106 CFU/mL B amyloliquefaciens 894; ĐCA: 10 CFU/mL A hydrophila AG1 Dựa vào hình thái khuẩn lạc đặc trưng, mật độ vi khuẩn A hydrophila AG1 B amyloliquefaciens B894 kiểm tra theo mốc thời gian 0, 12, 24, 36 48 môi trường RS TSA 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu mật độ vi khuẩn thu nội dung thí nghiệm tính trung bình vẽ đồ thị chương trình Excel Số liệu xử lý thống kê phần mên GraphPad Prism với thuật toán ANOVA 2.3 hời gian địa điểm nghiên ću - hời gian nghiên cứu: Từ tháng 01 đến tháng 12 năm 2020 - Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm thực phòng CNSH hủy Sản, Trung tâm Cơng nghệ sinh học hành phố Hồ Chí Minh III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hoạt tính đối kháng thành phần tế bào vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 với E ictaluri A hydrophila Kết khảo sát hoạt tính đối kháng thành phần tế bào WCP, ECP ICP với E ictaluri 5H A hydrophila AG1 phương pháp giếng khuếch tán cho thấy có WCP tạo vịng vơ khuẩn Kích thước vịng vơ khuẩn với E ictaluri 29,7 ± 0,6 mm A hydrophila 16,3 ± 0,6 mm (Hình 1) 115 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 01(122)/2021 Hình Hoạt tính đối kháng B amyloliquefaciens B894 với E ictaluri (A) A hydrophila (B) phương pháp giếng khuếch tán Tuy nhiên, sử dụng phương pháp nuôi cấy lỏng, việc bổ sung ECP vào môi trường nuôi ảnh hưởng đến mật độ vi khuẩn gây bệnh Mật độ vi khuẩn E ictaluri 5H A hydrophila AG1 thay đổi so với nuôi cấy môi trường đối chứng (Hình 2) Hình Đồ thị thay đổi mật độ A hydrophila E ictaluri nuôi cấy mơi trường có bổ sung ICP ECP vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 Ghi chú: ICP-E, ICP-A: mật độ E ictaluri 5H, A hydrophila AG1 mơi trừng có ICP; ECP-E, ECP-A: mật độ E ictaluri 5H, mơi trừng có ECP; WCP-E, WCP-A: mật độ E ictaluri 5H, A hydrophila AG1 môi trừng có WCP; ĐCE, ĐCA: mật độ E ictaluri, A hydrophila AG1 môi trừng BHI đối chứng Từ nồng độ ban đầu E ictaluri 5H 9,5 105 CFU/mL A hydrophila AG1 4,25 105 CFU/mL, sau 24 ni cấy khơng cịn thấy xuất vi khuẩn E ictaluri A hydrophila môi trường dinh dưỡng có bổ sung ECP B amyloliquefaciens B894 Quan sát cho thấy, dịch nuôi cấy E ictaluri A hydrophila mơi trường có ECP sau 24 suốt, khơng thấy có phát triển vi khuẩn mơi trường (Hình 3) Hình Dịch nuôi cấy vi khuẩn E ictaluri A hydrophila mơi trường BHI có bổ sung WCP, ICP ECP B amyloliquefaciens B894 Ghi chú: Ô1, Ô2: vi khuẩn E ictaluri A hydrophila mơi trừng có WCP; Ô3, Ô4: vi khuẩn E ictaluri A hydrophila mơi trừng có ICP; Ơ5, Ơ6: vi khuẩn E ictaluri A hydrophila mơi trừng có ECP 116 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 01(122)/2021 Riêng với ICP, không thấy thể hoạt tính đối kháng với hai tác nhân gây bệnh khảo sát phương pháp nuôi cấy môi trường lỏng môi trường thạch Sau 24 giờ, mật độ E ictaluri 5H mơi trường có bổ sung ICP tăng từ 105 CFU/mL lên 5,65 108 CFU/mL, A hydrophila tăng từ 4,2 105 CFU/mL lên 4,6 10 CFU/mL, tương đương với vi khuẩn ni mơi trường dinh dưỡng khơng có bổ sung ICP 3.2 Ảnh hưởng thời gian thu nhận ECP B amyloliquefaciens B894 đến hoạt tính đối kháng Dịch ECP B amyloliquefaciens B894 có tác động khác đến phát triển hai vi khuẩn gây bệnh tùy thuộc vào mốc thời gian thu nhận (Hình 4) Đối với A hydrophila AG1, dịch ECP8 thu mốc 8h bắt đầu có ảnh hưởng làm giảm mật độ A hydrophila AG1 từ 6,5 105 CFU/mL xuống 103 CFU/mL Với dịch ECP20 làm giảm mật độ vi khuẩn từ 8,5 105 CFU/mL xuống 101 CFU/mL Và bổ sung ECP24 vào môi trường ức chế hồn tồn phát triển A hydrophila AG1 sau thời gian nuôi cấy (p = 0,0013) (Hình 4A) Sự phát triển vi khuẩn E ictaluri 5H bị kiểm soát tương tự với A hydrophila AG1 ni mơi trường có bổ sung ECP B amyloliquefacines B894 thu mốc thời gian khác Dịch ECP4 thu mốc bắt đầu ức chế phát triển vi khuẩn E ictaluri 5H, mật độ vi khuẩn thu 2,85 105 CFU/mL, không tăng trưởng so với mật độ ban đầu 2,3 105 CFU/mL Khi sử dụng ECP20 bổ sung vào mơi trường ni cấy mật độ vi khuẩn giảm 1.0 101 CFU/mL với ECP24 phát triển vi khuẩn E ictaluri bị kìm hãm hồn tồn sau 24 (p < 0,0001) (Hình 4B) Hình Đồ thị thay đổi mật độ A hydrophila (A) E ictaluri (B) ni cấy mơi trường có bổ sung ECP vi khuẩn B amyloliquefaciens B894 theo thời gian 3.3 Ảnh hưởng mật độ B amyloliquefaciens B894 đến hoạt tính đối kháng với E ictaluri A hydrophila Khi thay đổi mật độ B amyloliquefaciens B894 hoạt tính đối kháng ảnh hưởng đến thời gian tốc độ phát triển E ictaluri 5H A hydrophila AG1, thể qua thay đổi mật độ vi khuẩntheo thời gian (Hình 6) Khi sử dụng B amyloliquefaciens B894 với mật độ dao động từ 103 đến 105 CFU/ mL môi trường đồng ni cấy mật độ E ictaluri 5H từ 105 CFU/mL có dấu hiệu giảm dần, ức chế hoàn toàn E ictaluri 5H sau 20 Khi tăng mật độ B amyloliquefaciens B894 lên 106 CFU/mL không thấy diện E ictaluri 5H sau 15 mơi trường (Hình 5A) Trong đó, chủng B amyloliquefaciens B894 sinh trường phát triển bình thường mơi trường đồng ni cấy Sau 25 khảo sát, nồng độ B894 đạt từ 5,7 108 đến 1,4 109 CFU/mL (Hình 5B) Tốc độ phát triển A hydrophila AG1 bị ức chế tương tự E ictaluri 5H đồng nuôi cấy với B amyloliquefaciens B894 nồng độ khác (Hình 6) Với nồng độ 104 CFU/mL, B amyloliquefaciens B894 không ảnh hưởng nhiều đến tốc độ sinh trưởng phát triển A hydrophila AG1 105 CFU/mL Sau 48 ni cấy, mật độ 117 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 01(122)/2021 A hydrophila AG1 tăng từ 2,5 105 CFU/mL lên 3,45 109 CFU/mL (Hình 6A), thấp lần so với đối chứng 1,4 1010 CFU/mL Ngược lại, nghiệm thức TNA1, mật độ vi khuẩn B amyloliquefaciens lại bị A hydrophila AG1 ức chế, sau 36 mật độ B amyloliquefaciens B894 giảm hoàn tồn (Hình 6B) Hình Đồ thị thay đổi mật độ E ictaluri (A) B amyloliquefaciens B894 (B) dịch đồng nuôi cấy Ghi chú: TNE1, TNE2, TNE3, TNE4: thí nghiệm 103, 104, 105, 106 CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL E ictaluri 5H; ĐCB1, ĐCB2, ĐCB3, ĐCB 4: đối chứng B amyloliquefaciens 894 103, 104, 105, 106 CFU/mL; ĐCE: đối chứng E ictaluri 5H 105 CFU/mL Hình Sự thay đổi mật độ A hydrophila (A) B amyloliquefaciens B894 (B) dịch đồng ni cấy Ghi chú: TNA1, TNA2, TNA3: thí nghiệm 104, 105, 106 CFU/mL B amyloliquefaciens 894 + 105 CFU/mL A hydrophila AG1; ĐCB1, ĐCB2, ĐCB3: đối chứng B amyloliquefaciens 894 104, 105, 106 CFU/mL; ĐCA: 105 CFU/mL A hydrophila AG1 Khi tăng nồng độ sử dụng B amyloliquefaciens B894 lên khoảng 2,3 105 CFU/mL, tương đương với nồng độ ban đầu A hydrophila 2.5 105 CFU/mL, nồng độ A hydrophila bắt đầu giảm dần theo thời gian Sau 48 giờ, nồng độ A hydrophila mơi trường đồng ni cấy giảm cịn 8.0 101 CFU/mL Và với nồng độ B amyloliquefaciens B894 2,9 106 CFU/mL cao 10 lần so với nồng độ A hydrophila ban đầu sau 36 khơng cịn thấy diện A hydrophia dịch nuôi cấy Đồ thị 4A) Nhiều nghiên cứu vi khuẩn Bacillus spp Trước đây, có nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn Bacillus tiết vào mơi trường hoạt chất có tính sát khuẩn kìm hãm vi khuẩn môi trường nuôi trồng thủy sản (Das, 2014) Hoạt tính đối kháng thành phần WCP ECP B amyloliquefaciens B894 118 xác định xuất vịng vơ khuẩn xung quanh giếng khuếch tán suy giảm mật độ vi khuẩn gây bệnh theo thời gian Một phương thức hoạt động phổ biến chủng vi khuẩn probiotic sản xuất hợp chất ức chế tác nhân gây bệnh Nghiên cứu trước B subtilis VSG1 cho thấy thành phần tế bào WCP, ICP ECP chủng thể hoạt tính đối kháng với chủng thuộc nhóm A hydrophila, cách tạo vịng vơ khuẩn xung quanh giếng thạch với đường kính lớn 40 mm (Giri, 2011) Hay chủng B subtilis AN11 cho thấy thành phần WCP vi khuẩn ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh thủy sản, có E tarda, bổ sung 30 µL WCP vào giếng khuếch tán Tuy nhiên, ECP B subtilis AN11 khơng thể hoạt tính đối kháng khảo sát hoạt tính phương pháp giếng khuếch tán (Das, 2014) hành Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 01(122)/2021 phần WCP ECP chủng B amyloliquefaciens cho thấy khả ức chế phát triển vi khuẩn S rubidaea cách tạo vòng vô khuẩn môi trường thạch (Afrin, 2019) Những kết cho thấy thành phần tế bào vi khuẩn Bacillus spp ức chế tác nhân gây bệnh, nhiên tùy thuộc vào vi khuẩn, nồng độ sử dụng mà thành phần tế bào có hoạt tính đối kháng IV KẾT LUẬN Chủng B amyloliquefaciens B894 có khả ức chế E ictaluri A hydrophila dạng thành phần tế bào ECP WCP Dịch ECP làm chậm phát triển E ictaluri A hydrophila sau thu nhận Dịch ECP thu nhận sau 24 ức chế hoàn toàn phát triển vi khuẩn gây bệnh thời gian ni cấy Trong đó, chủng B amyloliquefaciens B894 dạng WCP ức chế hoàn toàn phát triển E ictaluri (sau 15 giờ) A hydrophila (sau 36 giờ) sử dụng với nồng độ gấp 10 lần so với nồng độ tác nhân gây bệnh Những kết sở cho việc sử dụng chủng B amyloliquefaciens B894 để phát triển thành chế phẩm sinh học để kiểm soát bệnh gan thận mủ xuất huyết cho cá Tra q trình ni LỜI CẢM ƠN Các kết nghiên cứu báo thuộc nhiệm vụ khoa học công nghệ “Phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ xuất huyết cá tra đồng sông Cửu Long” Sở Khoa học Cơng nghệ Tp HCM cấp kinh phí TÀI LIỆU THAM KHẢO Afrin Sadia, Mohammad Nazrul Islam Bhuiyan, 2019 Antagonistic activity of Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens against multidrug resistant Serratia rubidaea BioRxiv the preprint server for biology [online] Das B.K.T., Samal, S.K., Samantaray, B.R., Sethi, S., Pattnaik, P and Mishra, B.K., 2005 Antagonistic activity of cellular components of Pseudomonas species against Aeromonas hydrophila Aquaculture, 253: 17-24 Das B K T, Neha Nidhi R.G., Pragyan Roy, A.K.Muduli, P.Swain, S.S.Mishra and P.Jayasankar, 2014 Antagonistic activity of cellular components of Bacillus subtilis AN11 against bacterial pathogens Int J Curr Microbiol App Sci, 3(5): 795-809 Haipeng Cao, Shan He, Ruopeng Wei, Marek Diong, and Liqun Lu., 2011 Bacillus amyloliquefaciens G1: A potential antagonistic bacterium against EelPathogenic Aeromonas hydrophila Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 1-6 Ghosh, S., Ringo, E., Selvam, A.D.G., Rahiman, K.MM., Sathyan, N., John, N and Hatha, A.A.M, 2014 Gut associated lactic acid bacteria isolated from the Estuarine ish Mugil cephalus: Molercular diversity and antibacterial activities against pathogens International journal of aquaculture, 4: 1-11 Sabina Fijan, 2016 Antimicrobial Efect of Probiotics against Common Pathogens, Probiotics and Prebiotics in Human Nutrition and Health, Chapter 10: 191-221 Shelar SS, Warang SS, Mane SP, Sutar RL, Ghosh JS, 2012 Characterization of bacteriocin produced by Bacillus atrophaeus strain JS-2, International Journal of Biological Chemistry, 6: 10-16 Xi-Yan Gao, Ying Liu, Li-Li Miao, Er-Wei Li, TingTing Hou and Zhi-Pei Liu., 2017 Mechanism of anti-Vibrio activity of marine probiotic strain Bacillus pumilus H2, and characterization of the active substance, AMB Express, 7: 23 Antagonistic activity of Bacillus amyloliquefaciens B894 against Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila Le Luu Phuong Hanh, Nguyen Hoang Chi Mai, Tran Ngoc Phuong Linh, Le Van Hau, Nguyen Đang Quan, Ngo Huynh Phuong hao Abstract In this study, three diferent cellular components (i e whole cell product-WCP, intracellular product-ICP and extracellular product-ECP) of B amyloliqeufaciens B894 were used to inhibit the growth of E ictaluri and A hydrophila Except for ICP, both WCP and ECP showed antagonistic ability against these two bacteria in the environment according to the time length of treatment WCP efectively inhibited the growth of two pathogens in agar medium with the inhibition zone diameter of 16.3 ± 0.6 mm (for A hydrophila) and 29.7 ± 0.6 mm (for E ictaluri) Both E ictaluri and A hydrophila were not found ater 15 hours and 36 hours, respectively, co-culturing in broth medium with B amyloliquefaciens B894, which were added at the same or ten-fold concentrations, compared to the pathogens Meanwhile, the antagonistic eicacies of the ECP from B amyloliquefaciens B894 against these two pathogens were only observed in broth medium ater 24 hours of co-culturing Keywords: Cellular component, antagonistic activity, Bacillus amyloliquefaciens, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila Ngày nhận bài: 04/01/2021 Ngày phản biện: 20/01/2021 Người phản biện: PGS TS Hồ Phú Hà Ngày duyệt đăng: 29/01/2021 119 ... chuẩn bị cho vào giếng sử dụng dịch vi khuẩn không qua ly tâm (bao gồm dịch sinh khối tế bào) vào giếng đối chứng Quan sát kết vòng đối kháng sau 24 A hydrophila 48 E ictaluri b) Phương pháp đồng... bào B amyloliquefaciens B894 với tác nhân gây bệnh Dịch ICP ECP bổ sung vào môi trường nuôi cấy theo tỷ lệ 3(ICP) : 7(BHI) 1(ECP) : 1(BHI) Trong đó, WCP bổ sung vào mơi trường BHI lỏng với nồng... từ 8,5 105 CFU/mL xuống 101 CFU/mL Và bổ sung ECP24 vào mơi trường ức chế hoàn toàn phát triển A hydrophila AG1 sau thời gian ni cấy (p = 0,0013) (Hình 4A) Sự phát triển vi khuẩn E ictaluri 5H