Etude et analyse de conopeptides de venins issus de cônes malacophages du vietnam

D ’HISTOIRE NATURELLE MUSEUM NATIONAL E cole Doctoraie Sciences de la Nature et de 1’Homme - ED 227 Année 2015 N°attribué par la bibliothèque THESE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DU MUSEUM NATIONAL DTIISTOIRE NATURELLE Spécialité : M ilieux et peuplement aquatiques-Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Présentée et soutenue publiquem ?nt par Bao NGUYÊN Le 24 janvier 2015 Etude et analyse de conopeptides de venins issus de cônes malaeophages du Yietnam Sous la direction de : M onsieur MOLGO, Jordi, Directeur de Recherche - CNRS JURY: Mme BOURGƯET-KONDRACKI, Marie-Lise Directeur de Recherche, Muséum naíional d’histoire naturelle Présidení M MOLGO, Jordi Dírecíeur de Recherche - CNRS, Directeur de Thèse M SERVENT, Denis Chef d’équipe - CEA Examinateur M TYTGAT, Jan Professeur, Universìté de Louvain, Belgique Rapporteur M POUCHUS, Yves-Fran£ois Professeur, Université de Nantes Rapporteur M TOUBOUL, David Chargé de Recherche - CNRS Examinateur Ce travail a été réaỉisé dans le Laboratoire de Neurobiologie et Déveioppement, UPR 3294 du CNRS Gif~sur-Yvette, dirigé par Monsieur le Docteur Philippe VERNIER Je tiens en premier lieu remercier Monsieur le Docteur Jordi MOLGO (Equipe Transíerts loniques et Pharmacologie du Système Neuromusculaire) pour m’avoir accueilli au sein de son équipe et pour m ’avoir formé la recherche scientiíique Je le remercie d’avoir dirigé mes recherches Dans ces quelques lignes, je tiens lui exprimer toute ma gratitude Je tiens remercier particulièrement les membres de mon jury : Madame le Docteur Marie-Lise BOURGUET-KONDRACKI, Directeur de Recherche CNRS (Molécules de Communication et Adaptation des Micro-organismes, UMR 7245, CNRS/Muséum National d’Histoire Naturelle, Paris) d’avoir accepté de participer au jury de cette thèse Monsieur le Docteur Jan TYTGAT (Professeur la Faculté de Sciences Pharmaceutiques de 1’Université de Louvain, KU Leuven, Belgique) et Monsieur le Docteur Yves-Franẹois POUCHUS (Proíesseur la Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Nantes, Nantes) qui m ’ont fait 1’honneur d’être rapporteurs de ce mémoire Je les remercie d’avoir consacré une partie de leur temps juger mon travail Monsieur le Docteur Denis SERVENT (Institut de Biologie et de Technologies de Saclay (iBiTec-S) / Service dTngénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO) / Laboratoire de Toxinologie Moléculaire et Biotechnologies (LTMB)/ Equipe Toxines, Récepteurs et Canaux Ioniques) et M onsieur le Docteur David TOUBOUL (Institut de Chimie des Substances Naturelles du CNRS UPR 2301, Biochimie et Chimie Structurale des Substances Naturelles) qui m ’ont fait Phonneur d’être examinateurs de cette thèse Je tiens également exprimer toute ma reconnaissance Madame le Docteur Evelyne BENOIT pour son soutien et ses conseils au sein de 1’équipe qui ont été essentiels pour effectuer ce travail de recherche dans les meilleures conditions Merci pour cette íameuse mise niveau en électrophysiologie qui était plus que nécessaire pour que je puisse continuer et qui ont fait que j ’ai aimé travailler dans ce laboratoire et particulièrement dans cette équipe Je tiens remercier Monsieur le Docteur Romulo ARAOZ pour ses judicieux conseils scientifiques et aussi sa collaboration importante pendant ma thèse Je tiens aussi remercier Monsieur Hung LAMTHANH pour le temps qu’il m’a consacré lors de mon initiation la HPLC et des nombreuses discussions concemant les sụịets biochimiques Je remercie également Messieurs les Docteurs Jean-Pierre LE CAER et Paul MILLARES et 1’équipe avec qui j ’ai eu le plaisir de collaborer pendant ma thèse et aussi pour le temps qu’ils m ’ont consacré lors de mon initiation la spectrométrie de masse rinstitut de Chimie des Substances Naturelles de Gif-sur-Yvette Je tiens remercier Messieurs les Docteurs Gilles MOUR1ER et Robert THAI de 1’lnstitut de Biologie et de Technologies de Saclay pour leur disponibilité, leurs enseignements et pour m'avoir permis de suivre de près le travail de synthèse peptidique et de dégradation d’Edman qui s’est fait Saclay Je remercie Madame KHUC Thi An et M onsieur le Docteur NGO Dang N ghĩa qui m’ont aidé de collecter les spécimens précieux dans cette étude Je tiens remercier Monsieur Jean-Francois GALLARD et Bogdan IORGA qui ont fait les structures RMN et la modélisation des molécules, rin stitu t de Chimie des Substances Naturelles de Gif-sur-Yvette Je ne voudrais pas oublier Madame Patricia VILLENEƯVE pour tout son soutien technique au cours de ma thèse et pour tous les nombreux détails au cours de mon séjour au laboratoire Je tiens également remercier toutes les personnes avec qui j ’ai collaboré et qui nỳont permis d’élargir mon champ de Vision Merci Aurélie Couesnon pour les moments de dégustation d ’excellents gâteaux, et Aren Borgdorff et Adile Bakayan pour leurs conseils et leur écoute Eln très grand merci Aurélien Drouard, Valérie Lavallée, Simon Agostini et Morgane Roulot pour m ’avoir aidé au niveau de Eélevage des souris, poissons et patelles EAnimalerie du CNRS de Gif-sur-Yvette Merci Patrick Parra et Jean-Yves Tiercelin de Eatelier de mécanique pour leur aide toụịours efficace (1’installation et la maintenance du lyophilisateur, la construction des supports pour les tests de bio-activité des patelles ) Merci Bernard Martin etN ordine Benakcha pour leur aide iníbrmatique Je tiens aussi remercier Sabine De La Porte, Sara Vianello et Sandrine Picaud pour leur disponibilité et pour nTavoir permis d ’utiliser tout le matériel dont j ’avais besoin Un grand merci Pascal ABBAS, Odile LECQUYER, Cindy MARTIN et Dominique SOUCHU pour leur gentillesse et leur aide quotidiennes Je remercie tous mes amis (Binh, Hoa, Hong, Mai Anh, Tuan) qui n ro n t toujours aidé avec beaucoup d ’enthousiasme malgré les difficultés Je remercie EAmbassade de France Hanoi (Vietnam) et le CNRS Gif-sur-Yvette pour le Tmancement de ma thèse Enfin, un grand merci ma famille pour son soutien inconditionnel Au cours de 1’évolution, certains animaux ont développé un appareil venimeux leur permettant d’attraper une proie, de concurrencer une autre espèce ou de se défendre contre un prédateur Certains animaux (serpents, scorpions, araignées, cônes marins) possèdent un appareil venimeux dont le rôle consiste injecter le venin dans 1’organisme de la proie géneralement par morsure, piqure ou griffure Leur venin est le reflet d’une grande biodiversité et plusieurs des molecules contenues dans ces venins se sont revélées très intéressantes comme outils pharmacologiques pour mieux comprendre notamment la physiologie des récepteurs de neurotransmetteurs et la grande diversité des canaux ioniques De plus, leur étude a permis de mettre en évidence leur grand potentiel thérapeutique La famille des Conidae, mollusques vivant principalement dans les mers tropicales, passionne non seulement depuis toụịours les collectionneurs par la beauté de leur coquille, mais aussi les scientiíiques depuis une quarantaine d’années par leur venin De nombreuses toxines extraites de leur venin, nommées conotoxines ou conopeptides, se sont révélées très utiles dans les domaines de la pharmacologie et de la neurobiologie Leur puissance et Ieur sélectivité d’action physiologique font de ces toxines des agents potentiellement utilisables dans le traitement de pathologies très diverses En 2004, un produit, nommée Prialt®, a été commercialisé sur le marché comme agent analgésique et a été utilisé pour 1'amélioration de la douleur sévère et chronique Récement, certaines de ces conotoxines sont en phase.s d’études cliniques Dans ce travail de recherche, nous nous sommes intéressés deux cônes marins malacophages, le Conus bandanus et le Conus marmoreus Le venin de c bandanus n’avait pas encore fait Lobjet d’une étude protéique apprịndie Donc, l’objectif Principal de notre recherche a été Lisolement et la caractérisation des nouvelles conotoxines de ce venin ainsi que ridentifícation de leurs modes d’actions Cette thèse comporte quatre parties La partie "Introduction", présente le genre Conus, une description générale des venins de cônes marins ainsi que les principales familles de conotoxines, leurs cibles moléculaires et leurs effets pharmacologiques Dans la partie "Matériel et Méthodes", nous décrivons toutes les méthodes (puriíication, tests de bioactivité, spectrométrie de masse, dégradation d’Edman, synthèse peptidique, modèles pharmacologiques) permettant de caractériser et de définir la spéciíicité des conotoxines étudiées A la suite de la partie "Matériel et Méthodes", nous présentons un troisième chapitre contenant la partie "Résultats et Discussion" Cette partie traite des principaux résultats obtenus (i) lors de la comparaison de conopeptides détectables dans les venins de Comis bandanus et de Conus marmoreus d'une même région du Vietnam (Article 1) (ii) lors de la caractérisation d’un nouveau conopeptide du venin de Comts bamỉamis, appartenant la superíamille M et contenant trois modiíications post-traductionnelles (Article 2) et (iii) lors de risolement, purifícation et caractérisation biochimique d'une alpha-conotoxine (BnlA ) du venin de Conus bandanus (Article 3) ainsi que d'autres conopeptides en cours d'études Finalement, un quatrième chapitre est consacré aux "Conclusions et Perspectives" et résume dans son ensemble les résultats obtenus ainsi que les développements de reeherches íutures possibles dans ce domaine SOMMAIRE Abréviations Introduction Biologie des cônes marins .5 1.1 Classiíìcation .5 1.2 Morphologie 1.3 Distribution géographique et bathymétrique 1.4 Comportement alimentaire des cônes 1.5 Appareil venimeux .7 1.6 Stratégies d’envenimation Venin des cônes marins 10 2.1 Techniques de récupération du venin 10 2.2 Composants du venin 11 Les conopeptides et les conotoxines 13 3.1 Nomenclature et classiíication desconotoxines 13 3.2 D’un gène la petite protéine ma tu re 17 Familles pharmacologiques des conotoxines ou conopeptides .19 4.1 Conotoxines agissant sur des canaux ioniques activés par des neurotransmetteurs ou des ligands 19 4.1.1 Conotoxines actives sur les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine 19 4.1.1.1 Récepteurs nicotiniques de racétylcholine 19 4.1.1.2 a-conotoxines 22 4.1.2 Inhỉbiteurs des récepteurs de la sérotonine (5-HT3): les ơ-conotoxines 28 4.1.3 Conopeptides agissant sur les récepteurs de 1'acide a-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) 28 1.4 Inhibiteurs des récepteurs N-m éthyl-D-aspartate (NMDA): les "conantokines" 29 4.2 Inhibiteurs des canaux calcium dépendants du potentiel : les (D-conotoxines 31 4.2.1 Les canaux calciu m 31 4.2 co-conotoxines 33 4.3 Les conotoxines agissant sur les canaux sodium dépendants du potentiel 36 4.3.1 Les canaux sodium 36 4.3.2 Inhibiteurs des canaux sodium dépendants du potentiel 37 4.3.2.1 Les p-conotoxines 40 4.3.2.2 Les pO-conotoxines 40 4.3.2.3 Autres conotoxines inhibant les canaux sodium dépendants du potentiel 41 4.3.3 Activateurs des canaux sodium dépendants du potentiel : les 5-conotoxines 42 4.3.4 Activateurs des canaux sodium dépendants du potentiel : les 1-conotoxines (iota) 43 4.4 K-conotoxines agissant sur les canaux p o ta ssiu m .43 4.4.1 Les canaux potassium 43 4.4.2 K-conotoxines 45 4.4.2.1 KA-conotoxines 45 4.4.2.2 KO-conotoxine 45 4.4.2.2 KM-conotoxines 47 4.4.2.3 Kj-conotoxine 47 4.4.2.4 Kl2-conotoxines 48 4.4.2.5 Contryphan-Vn 48 4.4.2.Ó Conkunitzin-S1 48 4.5 Les conotoxines agissant sur les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et les transporteurs de neurotransmetteurs 48 4.6 Applications thérapeutiques 49 La jonction neuromusculaire et la contraction des m uscles 51 5.1 Potentiel membranaire 52 5.2 Potentiel de repos et potentiel d’action 53 5.3 Libération d’acétylcholine et transmission neuromusculaire squelettique .53 5.4 Les différents canaux ioniques au niveau des terminaisons nerveuses de vertébrés 54 But de la Thèse 56 Matériels et Méthodes .58 Préparation de deux venins et puriíication de conopeptides 60 1.1 Collection de cơnes au Vietnam .60 1.2 Fractionnement du venin brut et puriíĩcation par HPLCR P ", 60 1.3 Préparation et comparaison des venins bruts de c bandanus et c.marmoreus 60 Tests de bio-activités préliminaires et identiíìcation des fractions actives 62 2.1 Injection intramusculaire chez le poisson 62 2.2 Injection intramusculaire chez la patelle 62 2.3 La jonction neuromusculaire de souris 63 2.3.1 Préparations neuromusculaires 63 2.3.2 Enregistrements mécanỉques de la íorce contractỉle 64 Spectrométrie de masse 65 3.1 Réduction et alkylation des íractions et des venins bruts .65 3.2 Détermination de la connectivité des ponts disulíures de conotoxines par la technique de "réduction partielle" .66 3.3 Digestion enzymatique des conopeptides 67 3.4 Analyse par M ALDI-TOF/TOF-M S et M S /M S 68 3.4.1 Noiĩienclature pour la fragm entation des peptides68 3.4.2 Analyse de la íraction purifiée par M ALDITOF/TOF-MS et M S/M S ' 69 3.5 Analyse "ESI-MS et/ou MS/MS" et "nanoLC-ESI-M S et M S/M S" 70 3.5.1 Analyse ”ESI-MS et/ou M S /M S " 70 3.5.2 Analyse MnanoLC-ESI-M S et M S/M S” 70 3.6 Production de base de données de la p ro téin e .71 3.7 Identiíícation de conopeptides en MS et M S/M S 71 3.8 Analyse des données MS et M S /M S 72 3.8 Inventaire des conopeptides natiĩs par M S 72 3.8 Détermination du nombre de cystéin e 72 Quantiílcation de peptid es 72 4.1 Peptides contenant du tryptophane ou de la tyrosine .72 4.2 Peptide sans tryptophane et/ou tyrosin e 73 Dégradation d ’Edman (Séquenẹage en N -term inal) 73 5.1 Séquenẹage d’E d m an 73 5.2 Fonctionnement du séquenẹage autom atique 74 5.3 Préparation de Péchantỉllon et mise en place dans la cartouche 74 5.4 Obtention des chromatogrammes et traitem ent 75 La synthèse des conopeptides en phase solide (méthode F m oc) 76 6.1 Principe 76 6.2 Protocole de synthèse pep tid iq u e 78 L'enregistrement électrophysiologique dans les ovocytes de X en o p u s 78 7.1 Expression de récepteurs nicotinique Ct7 sur 1’ovocyte 78 7.2 Technique du potentiel imposé double m icroélectrode 79 82 Résultats et Discussion .82 Comparaison de conopeptides détectables dans Ies venins de Conus bandanus et de Conus marmoreus d’une même région du Vietnam 84 1.1 Position du problème 84 1.2 Résumé des résultats obtenus et discussion 84 1.3 Conclusion 86 1.4 Article 87 Caractérisation d’un nouveau conopeptide du venin de Conus bandanus, appartenant la superíamille M et contenant trois modifications post-traductionnelles 100 2.1 Position du problème 100 2.2 Résumé des résultats obtenus et discussion 100 2.3 Conclusion 102 2.4 Article II 103 Isolement, purification et caractérisation biochimique d’une alphaconotoxine (BnlA) du venin de Conus bandanus 119 3.1 Position du problème .119 3.2 Résumé des résultats obtenus et discussion 119 3.3 Conclusion 121 3.4 Article III 121 Conclusions et Perspectives .140 Bibliographie 146 Annexe 168 Production scientiíìque 170 Communications des congrès ou des symposiums 170 Bibliographie 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 K auícrstein, s.; P orth, c ; K endel, Y.; W under, c ; N icke, A.; K ordis, D ; Eavreau, p.; K oua D.; Stocklin, R.; M ebs, D (2011) V enom ic study on cone snails (C onus spp.) from South Africa Toxicon : offiàaljournal of the International Society on Toxinoỉogy, 57, 28-34 Luo, s.; Z hangsun, D ; W u, Y.; Z hu, X.; H u, Y.; M clntyre, M.; C hristensen, s.; A kcan, M.; Craik D.J.; M clntosh, J.M (2013) C haracterization o f a novel alpha-conotoxin from conus textile that selecdvely targets alpha6/alpha3beta2beta3 nicotinic acetylcholine receptors TheỊournal of biological chemistry, 288, 894-902 Sandall, D w ; Satkunanathan, N ; Keavs, D.A.; Polidano, M.A.; Liping, X.; P ham , V.; D ow n, J.G ; Khalil, z ; Livett, B.G ; Gayler, K.R (2003) A novel alpha-conotoxin id en d d ed by gene sequencm g is active in suppressm g the vascular response to selective stim ulation o f sensorv nerves in vivo Biochemistry, 42, 6904-6911 Safavi-Hemami, H.; Siero, W A.; Kuang, z.; W illiam son, N.A.; K aras, J.A ; Page, L.R.; MacMillan, D.; Callaghan, B.; K om pella, S.N.; A dam s, D.J.; N o rto n , R.S.; Purcell, A w (2011) Em brỵonic toxin expression in the cone snail C onus victoriae: p rim ed to kill or divergent function? TheỊoumal of biological chemistry, 286, 22546-22557 Inserra, M.C.; Kom pella, S.N.; V etter, I.; Brust, A.; Daly, N.L.; Cuny, H ; Craik, D.J.; Alewood, P.F.; Adam s, D.J.; Lewis, R.J (2013) Isoladon and characterizadon o f alphaconotoxin LsIA with p o ten t acdvity at nicodnic acetylcholine receptors Biochemicaỉ pharmacology Jacobsen, R.; Yoshikami, D ; Ellison, M.; M artinez, J.; Gray, W R.; Cartier, G E ; Shon, K.].; G roebe, D.R.; A bram son, S.N.; Olivera, B.M.; M clntosh, J.M (1997) D ifferendal targeting o f nicodnic acetylcholine receptors by novel alphaA -conotoxins The ]oumal of biological chemistry, 272, 22531-22537 Teichert, R w ; Lopez-V era, E.; Gulyas, J.; W atkins, M.; Rivier, J.; O ltvera, B.M (2006) D ed nition and characterization o f the short alphaA -conotoxins: a single residue determ ines dissociation kinetics from the fetal m uscle nicotinic acetylcholine receptor Biochemistry, 45, 1304-1312 H opkins, c ; Grilleỵ, M.; Miller, c ; Shon, K j.; Cruz, L.j.; C ray, W R.; D vkert, J.; Rivier, J.; Yoshikami, D.; Olivera, B.M (1995) A new family o f C onus p epddes targeted to the nicotinic acetvlcholine receptor TheỊoumal o/biologicaỉ chemistry, 270, 22361-22367 Shon, K.J.; Grilley, M.; Jacobsen, R.; Cartìer, G E ; H opkins, c ; C ray, W R.; W atkins, M.; Hillỵard, D.R.; Rivier, J.; T orres, J.; Yoshikam i, D ; O livera, B.M (1997) A noncom petitive peptide inhibitor o f the nicotinic acetylcholine recep to r fro m Conus purpurascens venom Biochemistry, 36, 9581-9587 Van W agoner, R.M.; Jacobsen, R.B.; Olivera, B.M.; Ireland, C.M (2003) C h aractenzadon and three-dim ensional structure determ inatìon o f psi-conotoxtn P iiif a novel noncom petitive antagonist o f nicodnic acetylcholine receptors Biochemistry, 42, 63536362 Lluisma, A.O.; Lopez-V era, E.; Bulaị, G.; W atkins, M.; O ltvera, B.M (2008) Characterization o f a novel psi-conotoxin from C onus partus Reeve Toxicon : oỹìciaỉ joum al of the International Society on Toxinology 51 174-180 Loughnan, M.; Nicke, A.; Jo n es, A.; Schroeder, C.I.; N evin, S.T.; A dam s, D Ị.; Alevvood, P.E.; Lewis, R.J (2006) Idendíĩcation o f a novel class o f nicotinic recep to r antagonists: dim enc conotoxins V xX IIA , V xX IIB , and V xX IIC from C onus vexillum The Ịonrnaì oị biological chemistrp.281, 24745-24755 Teichert, R w ; Jim enez, E.C.; O hvera, B.M (2005) A lpha S -conotoxin R V IIIA : a structurally untque conotoxin that broadlv targets nicotinic acetvlcholtne receptors Biochemistry, 44, 7897-7902 Hoyer, D.; Clarke, D E ; Fozard, J.R.; H ardg, P.R.; M artin, G.R.; M ylecharane, E.J.; Saxena, P.R.; H um phrey, p p (1994) International U nion o f Pharm acologv classidcarion o f receptors for 5-hydroxT tr\y)tam ine (Serotom n) Tharmacological revỉetvs, 46, 157-203 157 Bỉbliographie 159 Kamovskỵ, A.M.; Goto\v, L.F.; McKinley, D.D.; Piechan, J.L.; Ruble C.L.- Mills r ) • Schellm, K.A.; Slightom, J.L.; Fitzgerald, L.R.; Benịamin, CAY'.; Roberds S.L (°()()3) \ cluster o f novel serotonin receptor 3-like genes on human chromosome (iene 319 137148 160 Niesler, B.; Frank, B.; Kapeller, J.; Rappold, G.A (2003) Cloning, physical mappmg and expression analỵsis o f the human 5-HT3 serotonin receptor-like genes HTR3C 1ITR3D andFỈTR 3E Gene, 310, 101-111 161 Walker, C.S.; Jensen, s.; Ellison, M.; Matta, J.A.; Lee, W.Y.; Impenal, J.s.; Duclos N.Brockie, P.J.; Madsen, D.M.; Isaac, J.T.; Olivếra, B.; Mancq, A.v (2009) A novel cịnùs’ snail polypeptíde causes excitotoxicity by blocking desensitization o f AMPA receptors Current biolũịy: CB, 19, 900-908 162 Dingledine, R.; Borges, K.; Bowie, D.; Traỵnelis, S.F (1999) The glutamate receptor ion channels PharmacoloỊÍcai’reviem, 51, 7-61 163 Chen, P.E.; Wyllie, D.J (2006) Pharmacological insights obtained Rom structure-function studies o fionotropic glutamate receptors Britishjournal opphamacolọĩy, 147, 839-853 164 Twede, V.D.; Teichert, R.w.; Walker, C.S.; Gruszczynslu, p.; I