Phân tích đa hình di truyền gen PIT1 của lợn đen định hóa bằng phương pháp PCR RFLP (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN PIT1 CỦA LỢN ĐEN ĐỊNH HĨA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP NGÀNH : CƠNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Bùi Văn Thắng TS Hà Bích Hồng Sinh viên thực : Nguyễn Thị Vân Anh Mã sinh viên : 1653070317 Lớp : K61A – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, suốt q trình thực em nhận quan tâm giúp đỡ, động viên quan, cấp lãnh đạo, thầy cô trường Đại học Lâm Nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Lâm Nghiệp, thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học truyền đạt kiến thức quý báu, giúp đỡ, quan tâm tạo điều kiện cho em phương diện q trình thực hiên khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô hướng dẫn: PGS.TS Bùi Văn Thắng, TS Hà Bích Hồng – người trực tiếp hướng dẫn khoa học ln dành thời gian, cơng sức tận tình giúp đỡ em phương hướng phương pháp nghiên cứu hồn thiện khóa luận Kinh phí thực đề tài hỗ trợ đề tài cấp Tỉnh “Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen Lợn đen huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên” Tuy có nhiều cố gắng, nghiên cứu khoa học không tránh khỏi thiếu sót Chúng em kính mong Q thầy cơ, chun gia, người quan tâm đến đề tài, đồng nghiệp, gia đình bạn bè tiếp tục có ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 15 tháng năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Thị Vân Anh i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Lợn đen Định Hóa 1.2 Tình hình nghiên cứu, bảo tồnvề gen quy định tính trạng sản xuất vật nuôi 1.2.1 Nghiên cứu giới 1.2.2.Nghiên cứu Việt Nam 1.4 Kỹ thuật PCR 15 1.5 Phương pháp PCR – RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) 17 CHƯƠNG MỤC TIÊU – NỘI DUNG – VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu 20 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 20 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 20 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20 2.1.4 Thời gian nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Vật liệu, hóa chất nghiên cứu 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu đa hình gen 21 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 21 2.4.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mô tai 21 ii 2.4.3 Phương pháp nhân bản đoạn gen PIT1 23 2.4.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 24 2.4.5 Giải trình tự nucleotide 25 2.4.6 Phương pháp PCR – RFLP 25 2.4.7 Kiểm tra sản phẩm phương pháp điện di gel agarose 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số 27 3.2 Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi PIT1_F/R 28 3.3 Kết nhân tinh đoạn gen PIT1 30 3.3.1 Kết quả nhân bản đoạn gen PIT1 phương pháp PCR 30 3.3.2 Kết quả tinh sản phẩm PCR phương pháp gel 32 3.4 Kết giải trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa 32 3.4.1 So sánh trình tự đoạn gen PIT1 với trình tự gen công bố ngân hàng gen quốc tế NCBI 34 3.4.2 Kết quả xây dựng quan hệ di truyền dựa trình tự đoạn gen PIT1 36 3.5 Kết phân tích đa hình di truyền đoạn gen PIT1 giống Lợn đen Định Hóa 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Tồn 40 4.3 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 iii DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP bp Nghĩa tiếng Anh Adenosin triphosphat Phân tử mang lượng Base pair Cặp base Cộng cs DNA (DNA) Deoxyribonucleic acid dNTP Nghĩa tiếng Việt Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphate Foward-Primer Mồi xuôi kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base µl Microlit F-Primer mRNA NAD(P)H NCBI PCR RFLP Messenger RNA ARN thông tin Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamide adenine phosphate dinucleotide phosphate National Center for Biotechnology Trung tâm Quốc gia Thông Information tin Công nghệ sinh học Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Restriction fragment length Phân tích đa hình trình tự DNA polymorphism RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome Room temperature Nhiệt độ phòng Reverse primer Mồi ngược TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển UV Untraviolet Tia cực tím V/p v/p Vòng / phút Qualified Teacher Learning and Skills locus RT R-Primer QLTs iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR để nhân đoạn gen PIT1 23 Bảng 3.1 Kết so sánh trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa với trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng đặc điểm Lợn đen Định Hóa Hình 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ mẫu mơ tai 27 Hình 3.2 Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi PIT1_F/R 29 Hình 3.3 Kết nhân đoạn gen PIT1 cá thể Lợn đen Định Hóa 31 Hình 3.4 Trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa 33 Hình 3.5 So sánh trình tự sai khác nucleotide đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa với 03 trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI 36 Hình 3.6 Kết quan hệ di truyền Lợn đen Định Hóa 03 loài ngân hàng gen quốc tế NCBI 37 Hình 3.7 Trình tự vị trí nhận biết củaenzym cắt giới hạn đoạn gen PIT1 39 v ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng Hiệu ngành chăn nuôi lợn phụ thuộc nhiều vào tốc độ tăng trọng, sản lượng thịt khả sinh sản Trước nhu cầu thị trường, nhà khoa học ý chọn lọc giống vật nuôi để nâng cao chất lượng thịt tỷ lệ nạc, độ mềm, màu sắc, độ thịt khả sinh sản Vì vậy, giống Lợn đen Định Hóa lồi quan tâm, giống lợn địa vùng Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên Ngày nay, với phát triển kỹ thuật đại nhà nghiên cứu chọn lọc giống vật nuôi dựa vào thị phân tử, tăng khả xác, rút ngắn thời gian nâng cao hiệu chọn lọc Trong đó, kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) công cụ quan trọng việc lập đồ gen, xác định nguy mắc bệnh thử nghiệm quan hệ huyết thống, marker có tính chất đồng trội cho phép phân biệt cá thể đồng hợp dị hợp Trong tương lai, nhiều nhà chọn giống cho kỹ thuật giữ vai trò chủ đạo công tác chọn giống vật nuôi Một số gen nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều gen PIT1, gen mã hóa nhân tố phiên mã chuyên biệt tuyến yên (pituitary-specific transcription factor), điều hòa phiên mã hormone tăng trưởng, prolactin thyrotropin subunit β Gen PIT1 nằm nhiễm sắc thể (NST) 13 củalợn, gen PIT1 có ảnh hưởng đến khả sinh trưởng lợn liên quan đến mức độ tuần hoàn hormone sinh trưởng (growth hormone, GH) máu, thông qua mối tương quan dương ý nghĩa PIT1-alpha mRNA nồng độ GH huyết tương Từ đó, thấy ảnh hưởng quan trọng gen PIT1 đến tốc độ sinh trưởng đặc tính thịt lợn, gen PIT1 dùng marker việc chọn giống Chính thế, việc nghiên cứu: “Phân tích đa hình di truyền gen PIT1 của Lợn đen Định Hóa bằng phương pháp PCR-RFLP” thực hiện, nhằm mục đích xác định kiểu gen PIT1 cá thể lợn giống, tìm liên quan kiểu gen PIT1 với khảnăng sinh trưởng chất lượng thịt bảo tồn nguồn gen quý hiếm, dần bị tuyệt chủng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Lợn đen Định Hóa Nguồn gốc Định Hóa huyện miền núi thuộc tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam, sở hữu nguồn gen vật nuôi địa quý giống Lợn đen Giống Lợn đen Định Hóa có nguồn gốc từ giống lợn địa phương vùng núi Định Hóa Do điều kiện địa lý, đồi núi cao hiểm trở, việc thơng thương có nhiều hạn chế, người dân ni lợn vùng núi huyện Định Hóa, Tỉnh Thái Nguyên giao dịch mua bán lợn quanh huyện nên việc pha tạp với giống lợn nhập ngoại lợn nội khác vùng đồng khơng thể thực Chính vậy, giống Lợn đen Định Hóa đến giữ độ chủng định Lý giống Lợn đen Định Hóa chưa bị tuyệt chủng chúng dễ nuôi, phàm ăn, ăn khỏe, ăn loại thức ăn kể thức ăn khơng có chất dinh dưỡng, chống chịu bệnh tật tốt: không bị mắc bệnh kể nuôi điều kiện hoang vu sơ đẳng, vệ sinh dân trí hiểu biết chăn ni lợn cịn lạc hậu, khơng có xâm nhập giống lợn khác đặc biệt chất lượng thịt thơm ngon, thực trở thành thịt lợn đặc sản nên giá bán đắt, dẫn đến hiệu cao Với ưu điểm đó, giống Lợn đen Định Hóa nguồn cung cấp thịt lợn chủ yếu cho vùng núi cao hiểm trở nên Lợn đen Định Hóa trì ni chưa bị tuyệt chủng Đặc điểm nhận dạng Lợn đen Định Hóa giống lợn địa thuộc vùng núi Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên đa phần có màu lơng đen tuyền, lưng võng, bụng sệ, mõm dài, bốn chân trắng Đặc điểm lông da lợn đen Định Hóa đồng nhất, xương nhỏ, thể trạng rắn chắc, thích nghi với điều kiện địa hình ni thả rơng rừng núi Hình 1.1 Hình dạng đặc điểm Lợn đen Định Hóa Phân loại khoa học: Giới (regnum) : Animalia Ngành (phylum) : Chordata Lớp (class) : Mammalia Bộ (ordo) : Artiodactyla Họ (familia) : Suidae Chi (genus) : Sus Loài (species) : Sus domesticus Danh pháp ba phần : S.scrofa x S.domesticus (Linnaeus, 1758) Đặc điểm cấu tạo Lợn có tính chịu đựng kham khổ cao, có khả chịu đựng bệnh tật tốt Thức ăn chủ yếu tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp, loại thức ăn thơ xanh (mía cây, bẹ chuối, chuối, thân ngô non, rau muống, bèo tây, loại cỏ, loại xanh…), thức ăn nghèo dinh dưỡng tính chống chịu bệnh tật nhiệt đới tốt, phù hợp với phương thức chăn nuôi vùng kinh tế khó khăn Năng suất sản xuất thịt mức trung bình, chất lượng thịt thơm ngon người dân ưa chuộng Sinh sản Lợn đen Định Hóa có khả sinh sản mức trung bình, đẻ sinh trưởng chậm Chính người dân địa phương để tình trạng giống Lợn đen Định Hóa, giao phối cận thân dẫn đến tình trạng Lợn đen Định Hóa bị cận huyết cao, dần có nguy bị tuyệt chủng Họ không nuôi lợn đực giống Tất nái đến kỳ động dục người chăn nuôi mượn lợn đực nuôi thương phẩm, chưa bị thiến, kích cỡ khoảng 20 - 25 kg làm giống Chính mà tượng giao phối cận huyết phổ biến nên chất lượng Lợn đen Định Hóa nhiều khơng ổn định, có nguy xuống Giá trị: Lợn có ngoại hình nhỏ, hướng sản xuất mỡ nạc, thịt nạc có màu đỏ, thịt mỡ có màu trắng, da dầy giịn, thịt có mùi thơm ngon Lợi ích đến sức khỏe người Chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết Hàm lượng protein thịt nạc, nấu chín khoảng 26% trọng lượng tươi Khi khô, hàm lượng protein thịt lợn nạc lên tới 89% làm cho trở thành nguồn protein giàu dinh dưỡng Thực phẩm chứa tất chín axit amin thiết yếu cần thiết cho tăng trưởng phát triển thể bạn Vì vậy, ăn thịt lợn hoặc loại thịt khác đặc biệt có lợi cho người sau phẫu thuật, vận động viên, người tập thể hình hoặc người cần phát triển bắp Thịt lợn nguồn thức ăn phong phú có chứa nhiều vitamin chất khống bao gồm thiamine Khơng giống loại thịt đỏ khác, chẳng hạn thịt bị, thịt trâu, thịt lợn đặc biệt chứa nhiều thiamine – nhóm chất vitamin B có vai trị thiết yếu thể Chứa nhiều vitamin khoáng chất Trong thịt lợn có chứa nguồn phong phú nhiều vitamin khống chất, bao gồm: Hình 3.3 Kết nhân đoạn gen PIT1 cá thể Lợn đen Định Hóa (A): M: ADN marker 1kbp, đ/c: mẫu đối chứng âm ADN thay H2O, giếng – tương ứng với mẫu ADN từ T1 đến T6; (B): giếng 1: tinh sản phẩm PCR từ mẫu T5, M: ADN marker 1kb Kết thu 06/06 mẫu thu thập gen PIT1 Tất mẫu nhân gen có kích thước gần 1745bp, phù hợp với kích thước tham khảo Từ Hình 3.3.A thấy kết điện di 06 giếng cho băng ADNrõ nét, khơng xuất băng phụ băng có kích thước tương đồng, giếng số T1, T2, T5, T6 cho băng sáng, rõ nét cho thấy nồng độ ADN mẫu cao Từ thấy, mồi sử dụng đặc hiệu nhiệt độ bắt mồi tối ưu hóa thu nồng độ ADN cao Kích thước đoạn ADN khuếch đại sử dụng cặp mồi PIT_F/R nhiệt độ 63oC thu từ mẫu tai tương đồng với kích thước tham khảo Qua cho thấy: sản phẩm PCR nhân đoạn gen PIT1 (tham khảo cặp mồi Yu cộng (1994) có kích thước 1745bp) 06 cá thể Lợn đen Định Hóa 31 nghiên cứu cho kích thước sản phẩm PCR phù hợp với kích thước tham khảo, lấy 06 mẫu tai từ T1, T2, T3, T4, T5, T6 nhân đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu PIT1_F/R để gửi giải trình tự nucleotide 3.3.2 Kết tinh sản phẩm PCR bằng phương pháp gel Sau nhân thành công đoạn gen PIT1 06 mẫu tai Lợn đen Định Hóa (Hình 3.3.A), dựa vào kết thu nhận thấy mẫu T5 cho băng to, sáng rõ nét chọn để tinh Sản phẩm PCR nhân đoạn gen PIT1 từ mẫu tai T5 tinh sử dụng kit PCR Purification Kit InTRON Hàn Quốc theo phương pháp mục 2.4.4 Sau tinh sạch, sản phẩm PCR kiểm tra cách điện di gel agarose 1,0% Kết cho thấy sản phấm PCR sau tinh có chất lượng tốt thể gel băng ADN nhất, sáng rõ nét, không bị đứt gãy, không xuất sản phẩm phụ (Hình 3.3.B) Sản phẩm PCR sau tinh đủ điều kiện để gửi giải trình tự nucleotide 3.4 Kết giải trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa Dựa vào kết nhân đoạn gen PIT1 hình 3.3 A tơi lựa chọn mẫu T5 để tiến hành giải trình tự nucleotide Sản phẩm PCR mẫu T5 tinh gửi giải trình tự nucleotide Kết giải trình tự đoạn gen PIT1 mẫu Lợn đen Định Hóa thể hình 3.4 Mục đích việc giải trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 để xác định mối quan hệ di truyền giống Lợn đen Định Hóa với giống Lợn khác cơng bố ngân hàng gen quốc tế tìm enzym giới hạn thích hợp cho nghiên cứu đa hình đoạn gen phương pháp PCR – RFLP So sánh kích thước tham khảo cặp mồi (Yu cs, 1994) với phân tích trình tự gen thực tế công cụ BioEdit thu đoạn gen PIT1 với kích thước 1745bp 32 Từ đó, tơi tiến hành so sánh trình tự PIT1 với trình tự cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI xây dựng quan hệ di truyền Hình 3.4 Trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa 33 3.4.1 So sánh trình tự đoạn gen PIT1 với trình tự gen cơng bố ngân hàng gen quốc tế NCBI Trình tự đoạn gen PIT1 BLAST ngân hàng gen quốc tế NCBI để xác định trình tự tương đồng Kết cho thấy có 100 trình tự tương đồng với đoạn gen PIT1 mẫu T5 Do đó, tơi chọn 03 trình tự có độ tương đồng cao với trình tự PIT1 để so sánh xây dựng quan hệ di truyền thể bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết so sánh trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa với trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI Tỷ lệ STT Tên lồi Kí hiệu tương đồng Sus scrofa breed Min POU1F1 gene, exons 5, DQ485155.1 100% Sus scrofa POU1F1 gene AH015830.2 99.14% Sus scrofa POU – domain protein (PIT1) gene U00793.1 98.46% Bảng 3.1 cho thấy trình tự đoạn gen PIT1 giống Lợn đen Định Hóa có tỷ lệ tương đồng cao với trình tự đoạn gen PIT1 (Sus scrofa breed Min POU1F1 gene, exons 5, 6) có mã số DQ485155.1 NCBI (100%) Trung Quốc, trình tự đoạn gen (Sus scrofa POU1F1 gene) có mã số AH015830.2 NCBI (99.14%) Trung Quốc, trình tự đoạn gen (Sus scrofa POU – domain protein (PIT1) gene) có mã số U00793.1 NCBI (98.46%) Mỹ Kết khẳng định nhân thành công đoạn gen PIT1 giống Lợn đen Định Hóa trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa tương đồng cao với giống lợn có xuất xứ Trung Quốc Mỹ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Sự sai khác trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa so với 03 trình tự ngân hàng gen quốc tế thể hình 3.5 Nguyên nhân sai khác trình tự nucleotide ảnh hưởng mơi trường, vùng điều kiện khí hậu khác nhau, trình sinh trưởng 34 phát triển, trình tiến hóa, xuất sai khác hay vài vị trí nucleotide dẫn đến sai khác nhỏ tỷ lệ tương đồng bảng 3.1 35 Hình 3.5 So sánh trình tự sai khác nucleotide đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa với 03 trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI 3.4.2 Kết xây dựng quan hệ di truyền dựa trình tự đoạn gen PIT1 Dựa kết so sánh trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa với 03 trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI (bảng 3.1), tiến hành xây dựng quan hệ di truyền 04 trình tự dựa kiểu phân nhóm Neibourjoining NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/treeview.cgi) Các mẫu có hệ số tương đồng di truyền cao xếp thành nhóm, nhóm có liên hệ với Kết xây dựng quan hệ di truyền thể hình 3.6 36 Hình 3.6 Kết quan hệ di truyền Lợn đen Định Hóa 03 lồi ngân hàng gen quốc tế NCBI Từ hình 3.6 cho thấy, 04 mẫu chia thành nhóm chính, trình tự đoạn gen PIT1_T5 Lợn đen Định Hóacùng nhóm với 02 trình tự Sus scrofa breed Min POU1F1 gene, exons 5, Sus scrofa POU1F1 gene; cịn trình tự Sus scrofa POU – domain protein (PIT1) gene nằm riêng nhóm Qua đó, chúng tơi nhận thấy trình tự đoạn gen PIT1 Lợn đen Định Hóa có tương đồng 100% với trình tự đoạn gen PIT1(Sus scrofa breed Min POU1F1 gene, exons 5, 6) Lợn đen Trung Quốc Điều cho thấy giống Lợn đen Định Hóa Lợn đen Trung Quốc có nguồn gốc trình tự đoạn gen PIT1 Lợn tương đối bảo thủ, xảy biến đổi trình tự nucleotide 3.5 Kết phân tích đa hình di truyền đoạn gen PIT1 giống Lợn đen Định Hóa Sau PCR, sản phẩm PCR nhân đoạn gen PIT1 06 cá thể Lợn đen Định Hóa cắt enzyme giới hạn để nghiên cứu đa hình di truyền gen cá thể quần thể Dựa vào kết giải trình tự nucleotide đoạn gen PIT1, kết so sánh đoạn trình tự gen PIT1 Lợn đen Định Hóa với trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế, lựa chọn 03 enzym giới hạn NdeI, BamHI, XbaI để nghiên cứu đa hình di truyền đoạn gen PIT1 Hình 3.7 thể vị trí trình tự nhận biết 03 enzyme giới hạn lựa chọn để nghiên cứu đa hình di truyền gen PIT1 Đây 03 enzyme thương mại phổ biến, với trình tự nhận biết cụ thể sau: 37 Enzym NdeI có trình tự nhận biết CATA*TG cắt đoạn gen PIT1 vị trí nucleotide số 510 Enzym BamHI có trình tự nhận biết GGATC*C cắt đoạn gen PIT1 vị trí nucleotide số 670 Enzym XbaI có trình tự nhận biết TCTA*GA cắt đoạn gen PIT1 vị trí nucleotide số 910 Tuy nhiên, lý khách quan nên không đặt enzyme giới hạn kịp thời gian hoàn thành nghiên cứu Do đó, kết cắt enzyme giới hạn đoạn gen PIT1 tiếp tục thực thời gian tới 38 Hình 3.7 Trình tự và vị trí nhận biết củaenzym cắt giới hạn đoạn gen PIT1 39 CHƯƠNG KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Tách chiết tinh 06 mẫu ADN tổng số từ mẫu tai giống Lợn đen Định Hóa Nhân thành cơng đoạn gen PIT1 kỹ thuật PCR 06/06 mẫu ADN tổng số 06 cá thể giống Lợn đen Định Hóa, Thái Ngun Giải trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 giống Lợn đen Định Hóa phục vụ đăng ký quyền lên ngân hàng gen quốc tế Bước đầu phục vụ cho việc đánh giá đa hình di truyền gen PIT1 giống Lợn đen Định Hóa để phục vụ xác định tần số alen tần số kiểu gen quần thể 4.2 Tồn Do thời gian kinh phí thực đề tài cịn hạn chế nên đề tài chưa phân tích số lượng lớn cá thể Lợn đen Định Hóa 4.3 Kiến nghị Tiến hành cơng bố trình tự đoạn gen PIT1 lên ngân hàng gen quốc tế để phục vụ đăng ký quyền địa phương Tiếp tục phân tích đa hình di truyền đoạn gen PIT1 số lượng lớn cá thể để phục vụ xác định tần số kiểu gen tần số alen đoạn gen PIT1 (từ 30 cá thể trở lên) Lựa chọn thêm vài enzym giới hạn phù hợp để nghiên cứu đa hình đoạn gen PIT1 quần thể Lợn đen Định Hóa 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Chung Anh Dũng, Lương Thị Thu Thảo, Bùi Phú Nam Anh, Hồ Quế Anh, Nguyễn Đắc Thành, Hoàng Ngọc Anh (2014), “Xác định kiểu gen PIT1 heo từ mẫu lông ảnh hưởng lên khả sinh trưởng, chất lượng thịt heo” Dương Văn Cường, Nguyễn Huy Thuần (2017), “Giáo trình Nguyên lý kỹ thuật di truyền”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội tr 19 Khuất Hữu Thanh (2012), “Cơ sở di truyền Sinh học phân tử Kỹ thuật Gen”, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Phương Lam (2017), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học di truyền Lợn rừng Tây Nguyên”, tr – 10 Nguyễn Nghĩa Duyệt (2006), “Nghiên cứu mức Protein tỷ lệ lysine/ lượng phần Lợn nái Móng Cái ni số tỉnh miền Trung”, Luận án Tiến sĩ Nông Nghiệp, Đại học Huế, tr 34 – 76 Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thu Thủy, Nguyễn Văn Cường, A.W.Kuss, H Gelderman (2010), “Đa hình di truyền gen hormone kích thích bao nỗn (FSH) số giống lợn Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn Nuôi, số 11, tr.23 – 26 Nguyễn Thị Nha Trang (2007) “Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo”, Luận văn tốt nghiệp đại đọc, Đại học Nông Lâm TP.HCM Lê Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Lệ Hằng, Lê Thị Thanh Tâm, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Nguyễn Thị Thu (2013), “Ảnh hưởng đa hình gen PIT1 đến tính trạng suất gà tàu vàng” Trần Huê Viên (2005), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh trưởng sinh sản Lợn đen nuôi Ba Bể, Pác Nặm, tỉnh Bắc Kạn”, tạp chí Nơng nghieejo phát triển nơng thơn, kì 1, tháng 12, tr 48 – 52 10 Trần Văn Phùng, Trần Xuân Hoàn, Nguyễn Văn Nơi (2010), “Nghiên cứu đa hình số gen quy định sinh trưởng khả sản xuất thịt Lợn Lai (Đực rừng Thái Lan Nái địa phương Pác Nặm)”, luận án Tiến sĩ, Đại học Nông Lâm, Thái Nguyên TIẾNG ANH 11 A Jalil-Sarghale, M Moradi Shahrbabak, H Moradi Sharbabak, M Sadeghi, M C Mura, (2014) “Association of pituitary specific transcription factor-1 (POU1F1) gene polymorphism with growth and biometric traits and blood metabolites in Iranian Zel and Lori-Bakhtiari sheep” 12 Brunsch C., Sternstein I., Reincecke P., Bieniek J (2002) “Analysis of associations of PIT1 genotypes with growth, meat quality and carcass composition traits in pigs”, J appl genet 43: 85 – 91 13 Christa BRUNSCH, Ina STERNSTEIN, Peter REINECKE, Józef BIENIEK, 2002 “Analysis of associations of PIT1 genotypes with growth, meat quality and carcass composition traits in pigs” 14 Cheng – Yi Song., Bo Gao., Shang – Hui Ten., Xiao – Yang Wang., Fei Xie., Guo – Hong Chen., Zhi – Yue Wang., Rong – bin Jing., Jin – De Mao., 2007 “Polymorphisms in intron of the porcine POU1F1 gen” 15 Cohen LE, Wondisford FE, Radovick S, 1996, “Role of PIT1 in the gene expression of growth hormone, prolactin, and thyrotropin” 16 Franco M.M., Antunes R.C., Silva H.D., Goulart L.R., (2005), “Association of PIT1, GH and GHRH polymorphisms with performance and carcass traits in Landrace pigs”, tr.195 – 200 17 Gye-Woong Kim, Jae-Young Yoo and Hack-Youn Kim, (2012), “Association of genotype of POU1F1 intron with carcass characteristics in crossbred pigs” 18 Jiang R., Li J., Qu L., Li., Yang N., (2004), “A new single nucleotide polymorphism in the chicken pituitary – specific transcription factor (POU1F1) gen associated with growth rate” 19 Kim GW., (2012) “Analysis of carcass quality grades according to gender, backfat thickness and carcass weight in pigs” J Anim Sci Technol, 54:29–33 20 Mauricio M Franco, Robson C Antunes, Katiana Mello de Oliveira, Cicero Donizete Pereira, Fernando Henrique Biase, Francis de Morais Franco Nunes and Luiz Ricardo Goulart, (2004) “Association of a PIT1 gene polymorphism with growth hormone mRNA levels in pig pituitary glands” 21 Mauricio M Franco, Robson C Antunes, Heyder D Silva, Luiz R Goulart, (2005) “Association of PIT1, GH and GHRH polymorphisms with performance and carcass traits in Landrace pigs” 22 Maria Consuelo Mura, Cinzia Daga, Marta Paludo, Sebastiano Luridiana, Michele Pazzola, Sara Bodano, Maria Luisa Dettori, Giuseppe Massimo Vacca, Vincenzo Carcangiu, (2012) “Analysis of polymorphism within POU1F1 gene in relation to milk production traits in dairy Sarda sheep breed” 23 Muhammad Ihsan Andi Dagong, Lellah Rahim, Sri Rachma Aprilita Bugiwati, Kusumandari Indah Prahesti, (2016) “Genetic Polymorphisms of Pituitary-Specific Transcription Factor-1 (Pit-1) Gene from Indonesian Local Goat Population Reared in South Sulawesi Province” 24 Nie Q.H., Fang M.X., Xie L., Zhou M., Liang Z.M., Luo Z.P., Wang G.H., Bi W.S., Liang C.J., Zhang W., Zhang X.Q (2008), “The PIT1 gene polymorphisms were associated with chiken growth traits” 25 Pierzchala M., Blicharski T and Kuryl J (2003), “Growth rate and carcass quality in pigs as related to genotype at loci POU1F1/RsaI (PIT1/RsaI) and GHRH/AluI”, tr.159 – 166 26 Renaville R., Gengler N., Parmentier I et al (1997) “PIT – gene HinfI RFLP and growth traits in double – muscled Belgian Blue cattle” 27 Renaville R, Gengler N, Vrech E, Prandi A, Massart S, Corradini C, Bertozzi C, Mortiaux F, Burny A, Portetelle D, (1997).“PIT1 gene polymorphism, milk yield and conformation traits for Italian HolsteinFriesian bulls” J Dairy Sci 80:3431–3438 28 R Misriantia, C Sumantria, A Farajallahb, (2010) “Polymorphism Identifi cation of Pit1 Gene in Indonesian Buff aloes (Bubalus bubalis) and Holstein-Friesian Cows” 29 Stancekova K, Vasicek D, Peskovicova D, Bulla J, Kubek A (1999) “Effect of genetic variability of the porcinepituitary-specific transcription factor (PIT-1) oncarcas traits in pigs” 30 Song C.Y., Gao B., Teng Y., Wang X.Y., et al (2005) “MspI polymorphisms in the 3rd intron of the swine POU1F1 gene and their associations with growth performance”, J Appl Genet 46: 285 – 289 31 Sang-Hyun Han, In-Cheol Cho, Moon-Suck Ko, Ha-Yeon Jeong, Hong-Shik Oh, Sung-Soo Lee, (2010) “Effects of POU1F1 and GH1 genotypes on carcass traits in Hanwoo cattle” 32 Sihua Jin, Tingting He, Lei Yang, Yucui Tong, Xingyong Chen, and Zhaoyu Geng, (2018) “Association of polymorphisms in Pit-1 gene with growth and feed efficiency in meat-type chickens” 33 Yu T.P., Rothschild M.F., Tuggle C.K., (1993) “A MspI re-striction fragment length polymorphism at the swine POU1F1 locus” J Anim Sci 71: 2275 34 Yu T.P., Schmitz C.B., Rothschild M.F and Tuggle C.K., (1994) “Expression pattern, genomic cloning and RFLP analyses of the swine PIT – gene” Anim Genet 25: 229 – 233 35 Yu T.P., Tuggle C.K., Schmitz C.B & Rothschild M.F (1995) “Association of PIT1 Polymorphisms with Growth and Carcass Traits in pigs” J Anim Sci 73: 1282 – 1288 36 Yu T.P., Rothschild M.F., Tuggle C.K., Haley C., Archibald A., Marklund L., et al (1996) “PIT – genotypes are associated with birth weight in three unrelated pig resource families” J Anim Sci 74: 122 37 Yu T.P., Wang L., Tuggle C.K., Rothschild M.F., (1999) “Mapping genes for fatness and growth on pig chro – mosome 13: a search for the region close to the pig PIT1 gene” J Anim Breed Genet 116: 269 – 280 38 Yu T.P., Sun H.S., Wahls S., Sanchez – Serrano I., Rothschild M.F and Tuggle C.K., (2001) “Cloning of the full length pig PIT1 (POU1F1) CDNA anh a novel alternative PIT1 transcript, and func – tional studies of their encoded proteins” Anim Biotechnol 12: – 19 INTERNET 39 https:// vi.wikipedia.org/wiki/gen_PIT1 40.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/397325 ... đoạn gen PIT1 Lợn tương đối bảo thủ, xảy biến đổi trình tự nucleotide 3.5 Kết phân tích đa hình di truyền đoạn gen PIT1 giống Lợn đen Định Hóa Sau PCR, sản phẩm PCR nhân đoạn gen PIT1 06 cá thể Lợn. .. thành công nhiều phương pháp khác ứng dụng di truyền phân tử dựa nguyên tắc PCR Những phương pháp di truyền dựa nguyên tắc PCR số chưa có giới hạn Phương pháp PCR – RFLP: phương pháp nghiên cứu đa. .. gen PIT1 mẫu Lợn đen Định Hóa thể hình 3.4 Mục đích việc giải trình tự nucleotide đoạn gen PIT1 để xác định mối quan hệ di truyền giống Lợn đen Định Hóa với giống Lợn khác cơng bố ngân hàng gen