Nghiên cứu giám định và phân tích đa dạng di truyền loài xá xị (cinnamomum parthenoxylon (jack) meisn) tại vườn quốc gia tam đảo bằng phương pháp DNA mã vạch (khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI XÁ XỊ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) TẠI VƯỜN QUỐC GIA TAM ĐẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP DNA MÃ VẠCH NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Hà Bích Hồng Sinh viên thực : Nguyễn Tiến Thành Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tạo điều kiện sở vật chất, trang thiết bị, máy móc q trình thực đề tài nghiên cứu Trong suốt thời gian thực đề tài em nhận giúp đỡ tận tình thầy cơ, giúp em hồn thành báo cáo khóa luận tốt nghiệp đặc biệt TS Hà Bích Hồng hướng dẫn tận tình cho em thời gian thực đề tài “Ngiên cứu giám định phân tích đa dạng di truyền lồi Xá xị vườn Quốc gia Tam Đảo DNA mã vạch” Bằng nhiệt huyếtvà kinh nghiê ̣m truyền đạt kiến thức để em nắm rõ tất nội dung trình nghiên cứu để có báo cáo hơm Cuối , em xin kính chúc thầy , Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp có sức khỏe dồi thành công công việc để tiếp tục truyền đạt cho khóa sinh viên Kinh phí thực hiê ̣n đề tài đươ ̣c hỗ trơ ̣ bởi đề tài cấ p Nhà nước “Khai thác phát triển nguồn gen Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) số tỉnh miền Bắc” Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Tiến Thành i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BANG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiêụ chung về Xá xi ̣ 1.1.1 Đặc điểm hình thái của Xá xi ̣ 1.1.2 Đă ̣c điể m sinh học sinh thái của Xá xi ̣ 1.1.3 Giá trị sử dụng xá xị 1.2 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.3 Tổng quan DNA mã vạch (DNA barcode) 1.3.1 Giới thiệu DNA mã vạch 1.3.2 Các đă ̣c điể m bản của trình tự DNA barcode 1.3.3 Các DNA mã vạch thường sử dụng 10 1.3.4 Ứng du ̣ng của DNA barcode thực vâ ̣t 13 1.3.5 Mô ̣t số nghiên cứu về DNA mã va ̣ch thực vâ ̣t 16 CHƯƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.1.1.Mục tiêu chung 19 2.1.2.Mục tiêu cụ thể 19 2.2.Đối tượng phạm vi nghiên cứu 19 2.3.Nội dung nghiên cứu 19 2.4.Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 20 2.4.1.Vật liệu nghiên cứu 20 ii 2.4.2.Hóa chất 20 2.5.Phương pháp nghiên cứu 21 2.5.1.Phương pháp thu nhận mẫu 21 2.5.2.Phương pháp tách chiết DNA tổng số 21 2.5.3.Kiểm tra sản phẩm DNA sau tách chiết 22 2.5.4.Phương pháp PCR với că ̣p mồi đặc hiệu 23 2.5.5.Phương pháp tinh sản phẩm PCR 25 2.5.6.Phương pháp phân tích số liệu 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1.Kết tách chiết DNA tổng số 26 3.2.Kết nhân trình tự DNA mã va ̣ch phương pháp PCR 26 3.2.1.Kết nhân đoạn trình tự matK 27 3.2.2.Kết nhân đoạn trình tự rbcL 28 3.2.3.Kết đoạn gen trnH-psbA 29 3.3.Kết phân tích trình tự các đoa ̣n DNA mã va ̣ch ở loài Xá xi 30 ̣ 3.3.1.Kết phân tić h và so sánh trình tự đoa ̣n gen matK 30 3.3.2.Kết phân tić h và so sánh trình tự gen rbcL 35 3.3.3.Kết phân tić h và so sánh trình tự đoa ̣n gen trnH-psbA 39 CHƯƠNG 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 4.1.Kế t luâ ̣n 45 4.2.Kiế n nghi 45 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP bp cpDNA CTAB Cytb DNA (DNA) Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Adenosin triphosphat Base pair Chloroplast DNA Cytochrome b Adenosin triphosphat Cặp base gen lục lạp Cetyl trimethylammonium bromide Cytochrome b Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Cetyl trimethylammonium bromide dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EBA EBB Extraction Buffer A Extraction Buffer B Deoxyribonucleotid triphosphate Đệm tách A Đệm tách B EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine tetraacetic F-Primer Foward-Primer Mồi xuôi R-Primer Reverse primer Mồi ngược NCBI National Center for Biotechnology Trung tâm Quốc gia Thông Information tin Công nghệ sinh học PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction fragment polymorphism RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic rRNA Ribosomal RNA ARN ribosome kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA tRNA Transfer RNA ARN vận chuyển UV Untraviolet Tia cực tím V/p v/p Vòng / phút Phản ứng chuỗi polymerase length iv Phân tích đa hình trình tự DNA DANH MỤC BANG Bảng 2.1 Thành phần nồng độ chất sử dụng phản ứng PCR 23 Bảng 2.2 Trình tự thông tin cặp mồi 24 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt độ cho phản ứng PCR mồi matK RbcL, trnH - psbA 24 Bảng 3.1 Một số lồi có trình tự đoa ̣n gen matK tương đồng với trình tự gen matK mẫu VP01 ngân hàng gen NCBI 32 Bảng 3.2 Một số lồi có trình tự gen matK tương đồng với trình tự gen rbcL mẫu VP01 ngân hàng gen NCBI 36 Bảng 3.3 Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen rbcL 38 Bảng 3.4 Các vị trí sai khác 07 mẫu nghiên cứu Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc 41 Bảng 3.5 Một số lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng với trình tự gen trnH-psbA 07 mẫu Xá xị ngân hàng gen NCBI 42 v DANH MỤC HÌNH Hình 0.1: Cành mang hoa Xá xị Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Hình 1.2: Cây Xá Xị Hình 3.1: Kết nhân bản đoa ̣n triǹ h tự MatK của 07 mẫu Xá xi ̣ta ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc 27 Hình 3.2: Kết nhân bản đoa ̣n trình tự rbcL của 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc 28 Hình 3.3: Kết nhân đoạn gen trnH-psbA 29 Hình 3.4: Trin ̀ h tự nucleotide của đoa ̣n gen MatK đươ ̣c nhân bản ở 07 mẫu Xá xi ta ̣ ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc 31 Hình 3.5: So sánh trin ̀ h tự nucleotide của đoa ̣n gen matK giữa mẫu VP01 với 06 triǹ h tự tương đồ ng ngân hàng gen 33 Hình 3.6: Cây quan ̣ di truyề n giữa mẫu VP01 và 06 loài ngân hàng gen dựa triǹ h tự đoa ̣n gen MatK 34 Hình 3.7: Trình tự nucleotide của đoa ̣n gen rbcL đươ ̣c nhân bản ở 07 mẫu Xá xi ̣ ta ̣i Tam Đảo, Viñ h Phúc 35 Hình 3.8: So sánh triǹ h tự nucleotide của mẫu VP01 với 06 trình tự tương đồ ng ngân hàng gen 37 Hình 3.9: Cây quan ̣ di truyề n giữa mẫu VP01 và 06 loài ngân hàng gen dựa triǹ h tự đoa ̣n gen rbcL 39 Hình 3.10: So sánh trình tự nucleotide của đoa ̣n gen trnH-psbA ở 07 mẫu Xá xi ̣ 40 Hình 3.11: Cây qua hệ di truyền 07 mẫu nghiên cứu 07 loài NCBI… 43 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Xá xị loài đa tác dụng có phân bố số tỉnh miền Bắc Việt Nam Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, tỉnh Vĩnh Phúc, v.v Ngoài giá trị cho gỗ dùng xây dựng, làm tà vẹt đóng đồ, phận cịn chưng cất tinh dầu dùng cơng nghiệp y dược Xá xị cho gỗ tốt, có vân đẹp, khơ bị nứt nẻ hay biến dạng, không bị mối mọt, chịu nước, dễ gia công chế biến Quả dùng chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà Tinh dầu Xá xị sử dụng rộng rãi cơng nghệ hố mỹ phẩm, thực phẩm dược phẩm Tinh dầu cịn dùng làm thuốc xoa bóp, chữa thấp khớp, đau nhức Lá dùng làm thuốc cầm máu, chữa đau dày, phong thấp, mẩn ngứa da Tinh dầu chứa hầu hết phận (lá, vỏ, thân rễ) Tinh dầu Xá xị có giá trị thương mại lớn thị trường Quốc tế Tình trạng khai thác bừa bãi Xá xị để cất tinh dầu thời gian qua nước ta làm cho loài đứng trước nguy tuyệt chủng Hiện nay, Xá xị xếp nhóm IIA thuộc Nghị định 06/2019/NĐ-CP Chính phủ năm 2019, nhóm CR nguy cấp Sách Đỏ Việt Nam năm 2007 Đồng thời với việc bảo tồn, cần nghiên cứu thử nghiệm gieo trồng đưa loài Xá xị vào đối tượng gây trồng chương trình trồng rừng nước ta Với mu ̣c đích xác đinh ̣ chính xác loài Xá xi ̣ và nghiên cứu tiń h đa hiǹ h di truyề n của loài này phu ̣c vu ̣ cho công tác bảo tồ n và phát triể n nguồ n gen, em thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu giám đinh ̣ và phân tích đa da ̣ng di truyề n loài Xá xi ̣ ( Cinnamomum parthenoxylon ( Jack) Meisn) ta ̣i vườn quố c gia Tam Đảo bằ ng phương pháp DNA mã va ̣ch” CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiêụ chung về Xá xi ̣ Xá Xị có tên khoa học: Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn Tên đồng nghĩa: Laurus parthenoxylon Jack, 1820; Laurus porrecte Roxb 1832; Sassafras parthenoxylon (Jack) Nees, 1836; Cinnamomum simondii Lecomte, 1913; Cinnamomum porrectum (Roxb.) Kosterm 1952 Tên khác: Co chấu, Re dầu, Re hương 1.1.1 Đặc điểm hình thái của Xá xi ̣ Cây gỗ, kích thước trung bình lớn; thân hình trụ thẳng, cao 20-25m, đường kính thân (40-70) cm; rụng nhiều hay ít; gốc phình to đơi có bạnh gốc Vỏ màu nâu, nâu xám đến xám đậm, thường nứt dọc bong mảng; thịt vỏ có màu nâu đỏ nhạt Cành non trịn, thơ, có cạnh, màu lục xám Lá đơn nguyên, mọc cách; phiến hình trứng hay hình bầu dục thn; kích thước 5-15 x 2,5-8cm; đầu có mũi nhọn, ngắn; gốc hình nêm hay nêm rộng; hai mặt nhẵn; gân bên 3-8 đôi; cuống dài 1,2-3cm Cụm hoa dạng chuỳ hay tán; mọc đầu cành hay nách lá; cụm mang khoảng 10 hoa Hoa lưỡng tính; bao hoa thuỳ, màu trắng vàng; nhị 9, bao phấn ơ, nhị có lơng, nhị vịng có tuyến mật; nhị lép Quả mọng, hình cầu, đường kính 0,6-1cm; đế hình chén, có khía răng, chín màu xanh vàng tím đen[1] (Phùng Văn Phê, 2019) Hình 1.1: Cành mang hoa Xá xị Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Hình 1.2: Cây Xá Xị 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái của Xá xi ̣ Mùa hoa tháng 3-6, mùa tháng 6-10 Mọc rừng rậm nhiệt đới thường xanh, ẩm núi đất hay núi đá vôi, độ cao 500-1.000m chí đến 3.000m Cây ưa tầng đất mặt sâu, dày, tơi xốp, nhiều mùn nước Khi cịn non ưa ẩm chịu bóng, trưởng thành lại ưa sáng Sinh trưởng tốt loại hình rừng có mật độ trung bình Tái sinh chồi khỏe[1],[5]  Giá trị nguồn gen tình trạng bảo tồn Nguồn gen Xá xị lồi đa tác dụng có phân bố số tỉnh phía Bắc Bắc Trung Việt Nam Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Tuyên Quang, tỉnh Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận Ngoài giá trị cho gỗ dùng xây dựng, ... khóa luận tốt nghiệp đặc biệt TS Hà Bích Hồng hướng dẫn tận tình cho em thời gian thực đề tài “Ngiên cứu giám định phân tích đa dạng di truyền lồi Xá xị vườn Quốc gia Tam Đảo DNA mã vạch? ?? Bằng. .. mẫu Xá xị Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc với để thấy rõ đa hình mẫu Xá xị, sử dụng công cụ BLAST để tìm kiếm lồi có trình tự tương đồng ngân hàng gen quốc tế NCBI từ xác định đa quan hệ di truyền loài. .. học Công nghệ (2007), sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), “Cơ sở di truyền học phân tử tế bào”, NXB Đại học Quốc Gia