Đánh giá sự thay đổi tăng sinh và cấu trúc khung xương tế bào gốc trung mô cuống rốn người trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MÔ PHỎNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI TĂNG SINH VÀ CẤU TRÚC KHUNG XƯƠNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ CUỐNG RỐN NGƯỜI TRONG ĐIỀU KIỆN VI TRỌNG LỰC MƠ PHỎNG Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Hồng Nghĩa Sơn Tp Hồ Chí Minh – Năm 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ học vị Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc rõ ràng đƣợc phép cơng bố Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 04 năm 2021 Học viên thực Hồ Nguyễn Quỳnh Chi ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS Hồng Nghĩa Sơn, ngƣời ln tận tâm dẫn, tạo điều kiện cho học tập, nghiên cứu hoàn chỉnh đề tài Xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Xin chân thành cảm ơn đề tài: “Nghiên cứu đánh giá thay đổi cấu trúc khung tế bào thể sống điều kiện mô trạng thái vi trọng lực (simulated microgravity)”, thuộc Chƣơng trình Khoa học công nghệ vũ trụ, mã số: CNVT/16-20 hỗ trợ cho nghiên cứu Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thành Long, ngƣời hƣớng dẫn tận tình giúp tơi có hội đƣợc thực đề tài Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô, anh chị đồng nghiệp, bạn sinh viên nghiên cứu Viện Sinh học Nhiệt đới động viên giúp đỡ trình cơng tác nghiên cứu Con xin cảm ơn ba, mẹ, em bên con, động viên lúc khó khăn Tp HCM, ngày 19 tháng 04 năm 2021 Hồ Nguyễn Quỳnh Chi iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix TÓM TẮT xii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vai trị nghiên cứu sinh học khơng gian 1.2 Giới thiệu vi trọng lực vi trọng lực mô 1.2.1 Vi trọng lực 1.2.2 Vi trọng lực mô 1.3 Các hệ thống mô vi trọng lực 1.3.1 Clinostat 10 1.3.2 Buồng quay 13 1.3.3 Máy định vị ngẫu nhiên 14 1.4 Tế bào gốc trung mô cuống rốn 15 1.4.1 Khái niệm 15 1.4.2 Lợi ích tế bào gốc trung mô cuống rốn 16 1.5 Sự tăng sinh tế bào 17 1.5.1 Định nghĩa 17 1.5.2 Các yếu tố điều hòa chu kỳ tế bào 18 1.5.3 Các nghiên cứu ảnh hưởng vi trọng lực lên tăng sinh tế bào 19 1.6 Quá trình apoptosis 20 1.6.1 Khái niệm 20 1.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến apoptosis 22 1.6.3 Phương pháp đánh giá apoptosis 23 1.7 Nhân tế bào chất 26 iv 1.7.1 Định nghĩa vai trò nhân tế bào chất 26 1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thái nhân tế bào chất 26 1.8 Bộ khung xƣơng tế bào 27 1.8.1 Khái niệm 27 1.8.2 Cấu trúc khung xương tế bào 27 1.8.3 Các nghiên cứu ảnh hưởng vi trọng lực lên khung xương tế bào .29 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Vật liệu 31 2.1.1 Thiết bị dụng cụ cần thiết 31 2.1.2 Môi trường hóa chất sử dụng 32 2.1.3 Tế bào gốc trung mô 33 2.1.4 Hệ thống vi trọng lực mô (clinostat 3D) 33 2.2 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Nuôi cấy tế bào 36 2.2.1.1 Phương pháp giải đông 36 2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền 36 2.2.1.3 Phương pháp đông lạnh 36 2.2.2 Đánh giá thị marker tế bào gốc trung mô 37 2.2.3 Thử nghiệm vi trọng lực 38 2.2.4 Đánh giá tăng sinh tế bào 39 2.2.4.1 Đánh giá mật độ tế bào 39 2.2.4.2 Đánh giá chu kỳ tế bào 39 2.2.5 Đánh giá trình apoptosis 44 2.2.5.1 Thu hoạch tế bào 44 2.2.5.2 Đánh giá tỉ lệ apoptosis 44 2.2.5.3 Đánh giá biểu mức phiên mã gene liên quan đến apoptosis 45 2.2.6 Đánh giá thay đổi hình thái nhân tế bào chất 46 2.2.6.1 Thu hoạch cố định tế bào 46 2.2.6.2 Đánh giá thay đổi hình thái nhân 46 2.2.6.3 Đánh giá thay đổi hình thái tế bào chất 46 2.2.7 Đánh giá thay đổi cấu trúc khung xương tế bào 47 2.2.7.1 Thu hoạch tế bào 47 v 2.2.7.2 Đánh giá biểu mức phiên mã gene mã hóa vi ống, vi sợi 47 2.2.7.3 Đánh giá biểu mức dịch mã gene mã hóa vi ống, vi sợi 48 2.2.7.4 Đánh giá tái cấu trúc khung vi ống, vi sợi tế bào 49 2.2.8 Phương pháp thống kê 50 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Đánh giá thị marker tế bào gốc trung mô 51 3.2 Đánh giá tăng sinh tế bào 52 3.2.1 Sự thay đổi mật độ tế bào 52 3.2.2 Sự thay đổi chu kỳ tế bào 53 3.2.2.1 Tỉ lệ pha chu kỳ tế bào 53 3.2.2.2 Biểu mức độ phiên mã gene điều hịa chu kì tế bào .54 3.2.2.3 Biểu mức độ dịch mã gene điều hịa chu kì tế bào .55 3.3 Đánh giá trình apoptosis 58 3.3.1 Tỉ apoptosis 58 3.3.2 Biểu mức phiên mã gene liên quan đến apoptosis 58 3.4 Đánh giá thay đổi hình thái tế bào 59 3.4.1 Sự thay đổi hình thái nhân 59 3.4.2 Sự thay đổi hình thái tế bào chất 63 3.5 Đánh giá cấu trúc khung xƣơng tế bào 66 3.5.1 Biểu mức phiên mã gene mã hóa vi ống, vi sợi 66 3.5.2 Biểu mức dịch mã gene mã hóa vi ống, vi sợi 67 3.5.3 Đánh giá tái cấu trúc khung vi ống, vi sợi tế bào 67 3.6 Tóm tắt ảnh hƣởng vi trọng lực mơ lên tế bào hucMSC phƣơng thức ức chế tăng sinh tế bào môi trƣờng vi trọng lực mô .73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC vi DANH MỤC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt 7-AAD ATP Bax Bcl-2 bmMSC CDKs DMEM DNA FBS GVHD hucMSC ISCT LSCM mRNA MSC NASA OD PBS Pen/Strep PI PS PVDF vii qRT-PCR RNA RPM RWV SDS-PAGE SMG TEM TUNEL ucMSC viii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Một số thiết bị sử dụng đề tài 31 Bảng 2.2 Một số dụng cụ sử dụng đề tài 31 Bảng 2.3 Mơi trƣờng, hóa chất sử dụng đề tài 32 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng Realtime qRT-PCR cho gene điều hịa chu kì tế bào 42 Bảng 2.5 Trình tự mồi gene điều hịa chu kì tế bào 42 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng Realtime qRT-PCR cho gene liên quan đến apoptosis 45 Bảng 2.7 Trình tự mồi gene liên quan đến apoptosis 45 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng Realtime qRT-PCR cho gene mã hóa khung xƣơng tế bào 47 Bảng 2.9 Trình tự mồi gene mã hóa khung xƣơng tế bào 47 4711361 4579514 5639019 4876384 4642704 5280856 4983839 4950982 4789320 4958659 5036434 4928598 5083427 5028796 5788806 5172228 5567903 4671271 4532800 4301353 5572078 3968738 4528407 4687530 4426709 4757241 5024521 5430433 5349097 4843595 5269077 4325406 5116210 4909219 6089717 5253017 5417923 5696058 4899342 4854731 4900598 5305433 6314869 6032096 5275700 5978232 6304854 6367312 6771441 6835564 6891962 7832824 7137134 7563397 5530597 7871321 5826752 6614534 6811059 5398971 6595622 6135521 7114141 6029930 6441848 7472823 6177207 6276301 6094149 6808106 6668025 6284580 7210943 8410019 7546138 6021553 7379599 5945992 6262300 5458884 5953284 5842324 6314029 7255340 5506184 5882475 5850739 7521839 6012867 6752270 5688491 5966760 6587548 5630874 6875994 6513252 7088354 5225289 6620175 6751053 5580352 6677507 7649458 6222112 7448676 5498092 6379853 5907578 6425111 4534175 One Way Analysis of Variance Data source: Data in Notebook1 Normality Test: Equal Variance Test: Group Name Col Col N 784 815 Source of Variation Between Groups Residual Total The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P =