Nghiên cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ bằng kỹ thuật realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật tt

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc phát DNA phôi thai tự lưu hành tuần hoàn thai phụ mở hướng chẩn đốn trước sinh kỹ thuật không xâm lấn Các nghiên cứu cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ tăng tương ứng với tuổi thai, tăng cao bất thường liên quan đến biến chứng thai kỳ (tiền sản giật, đẻ non, ) thải trừ nhanh chóng sau đẻ Nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ tăng cao có ý nghĩa lần từ tuần thai thứ 17 lần thứ vào thời điểm tuần trước có triệu chứng lâm sàng tiền sản giật Điều gợi ý khả ứng dụng kỹ thuật định lượng DNA phôi thai tự để sàng lọc phát sớm thai phụ có nguy tiền sản giật Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA thai từ tuần thứ thai kỳ sở kỹ thuật áp dụng vào chẩn đốn trước sinh khơng xâm lấn cách xác hiệu việc theo dõi, dự đoán nguy mẹ thai nhi trình thai nghén Ở Việt Nam, chẩn đoán tiền sản giật dựa vào triệu chứng bệnh: tăng huyết áp, protein niệu, bên cạnh việc theo dõi phát tiền sản giật dựa vào triệu chứng bệnh nhân phát tự đến khám: phù, nhức đầu,… Các xét nghiệm sàng lọc định lượng dấu ấn αFP, uE3 tính đặc hiệu, chẩn đốn theo dõi dọc khơng cao Với mục đích nghiên cứu vai trị DNA phơi thai tự tiền sản giật để giúp thầy thuốc lâm sàng có thêm dấu ấn sinh học dự báo sớm, theo dõi tiên lượng tiền sản giật nhằm nâng cao chất lượng sống, tiến hành đề tài "Nghiên cứu DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ kỹ thuật Realtime PCR nhằm dự báo sớm tiền sản giật" với mục tiêu sau: Hoàn chỉnh xây dựng đường chuẩn kỹ thuật Realtime PCR để định lượng DNA phôi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ Đánh giá nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ bình thường thai phụ tiền sản giật NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN Cơng trình nước nghiên cứu xây dựng hoàn chỉnh đường chuẩn kỹ thuật Realtime PCR để định lượng nồng độ DNA phôi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ bình thường thai phụ tiền sản giật thu số kết định Đây cơng trình nghiên cứu thay đổi nồng độ DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ bình thường thai phụ tiền sản giật Với kết thu nghiên cứu giúp bác sỹ lâm sàng có thêm phương pháp chẩn đốn trước sinh không xâm lấn, dự báo sớm tiền sản giật đại với độ tin cậy cao BỐ CỤC LUẬN ÁN Luận án bao gồm: 105 trang; Đặt vấn đề (2 trang); Chương 1: Tổng quan (35 trang); Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (21 trang); Chương 4: Bàn luận (29 trang) Kết luận (1 trang) Kiến nghị (1 trang) Trong luận án có: 26 bảng, biểu đồ, 16 hình Luận án có 163 tài liệu tham khảo, bao gồm: 16 tiếng Việt, 147 tiếng Anh Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan DNA phôi thai tự lưu hành huyết tương thai phụ Để phát có mặt kích thước DNA phôi thai tự huyết tương thai phụ, nghiên cứu sử dụng cặp mồi gen SRY (Sexdetermining region of Y gene) (gen đặc hiệu NST Y) 1.1.1 Nguồn gốc DNA phôi thai tự Mặc dù DNA phôi thai huyết tương thai phụ biết đến với nhiều ứng dụng chế sinh học lại nhiều điều chưa sáng tỏ Có nhiều giả thuyết nguồn gốc DNA phơi thai tự lưu hành tuần hồn thai phụ, có khả năng: 1.1.1.1 Nguồn gốc DNA phôi thai tự từ tế bào thai có nhân lưu hành tuần hồn mẹ 1.1.1.2 Nguồn gốc DNA phôi thai tự từ rau thai 1.1.1.3 Nguồn gốc từ trao đổi trực tiếp phân tử DNA phôi thai tự mẹ thai 1.1.2 Kích thước DNA phơi thai tự Nghiên cứu Chan KC CS (2004): 57% DNA người mẹ có kích thước > 201bp; hầu hết kích thước DNA phơi thai tự ngắn ≤193bp, 20% kích thước > 193bp, 0% kích thước > 313bp ngắn DNA có nguồn gốc từ mẹ Nghiên cứu Li Y CS (2004): kích thước DNA phơi thai tự < 300bp cịn DNA có nguồn gốc từ mẹ có kích thước phân tử >1kb Nghiên cứu Fan HC CS (2010): kích thước DNA phơi thai tự khoảng 130 - 150bp, không dài 250bp 1.1.3 Thời gian bán hủy t/2 DNA phôi thai tự DNA phôi thai tự chiếm khoảng 11 - 13% tổng số DNA lưu hành tuần hoàn thai phụ Thời gian xuất DNA phôi thai tự lưu hành tuần hoàn thai phụ thời điểm thai - tuần nồng độ DNA phôi thai tự tăng dần theo tuổi thai Nghiên cứu Lo CS (1999) thời gian bán hủy t/2 DNA phôi thai tự khoảng 16,3 phút (từ 4–30 phút) Nghiên cứu Smid CS (2003), Tsui CS (2012) nồng độ DNA thai sau sjnh thấp không phát DNA thai sau sinh ngày Stephanie CS (2013) thấy rằng: tốc độ giải phóng DNA phơi thai tự vào tuần hoàn thai phụ sau sinh xảy gồm: giai đoạn ban đầu nhanh với thời gian bán hủy t/2 khoảng 1h, giai đoạn chậm với thời gian bán hủy t/2 khoảng 13h, nhiên sau sinh 1-2 ngày không phát DNA phôi thai tự 1.1.4 Tình hình nghiên cứu DNA phơi thai tự nước Việt Nam 1.2 Tổng quan tiền sản giật 1.2.1 Khái niệm tiền sản giật Tiền sản giật (TSG) tình trạng bệnh lý thai nghén gây nửa sau thai kỳ tuần thứ 20 trình mang thai, biểu hội chứng gồm triệu chứng tăng huyết áp, protein niệu phù 1.2.2 Yếu tố nguy chế bệnh sinh tiền sản giật 1.2.2.1 Các yếu tố nguy Bảng 1.1 Một số yếu tố nguy tiền sản giật Yếu tố nguy OR RR (95%CI) Hội chứng kháng phospholipid 9.7 (4.3–21.7) Bệnh thận 7.8 (2.2–28.2) Tiền sử TSG 7.2 (5.8–8.8) Bệnh lupus ban đỏ hệ thống 5.7 (2.0–16.2) Sinh lần đầu 5.4 (2.8–10.3) Tăng huyết áp mạn tính 3.8 (3.4–4.3) Đái tháo đường 3.6 (2.5–5.0) Sống vùng núi cao so với mặt nước biển 3.6 (1.1–11.9) Tiền sử gia đình mắc bệnh lý tim mạch 3.2 (1.4–7.7) (bệnh tim đột quị người thân trở lên) Béo phì 2.5 (1.7–3.7) Tiền sử gia đình (mẹ chị/em gái bị TSG) 2.3–2.6 (1.8–3.6) Tuổi thai phụ > 40 1.68 (1.23–2.29) (chưa sinh lần nào) 1.96 (1.34–2.87) (Đa thai) 1.2.2.2 Cơ chế bệnh sinh Mặc dù chế gây bệnh xác chưa hiểu rõ có chứng cho thấy TSG xảy có diện rau thai Theo nghiên cứu Sargent CS (2006); Gammill Roberts (2007), chế bệnh sinh TSG cho mơ hình rối loạn gồm: giai đoạn 1- rau thai bị giảm tưới máu giai đoạn - biểu đa hệ thống mẹ rau thai không tưới máu đầy đủ 1.2.3 Một số triệu chứng điển hình tiền sản giật 1.2.3.1 Triệu chứng lâm sàng 1.2.3.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 1.2.4 Phân loại chẩn đoán tiền sản giật 1.2.5 Tiên lượng 1.2.6 Các biến chứng tiền sản giật 1.2.6.1 Biến chứng với mẹ 1.2.6.2 Biến chứng với 1.2.7 Một số dấu ấn sinh học sử dụng chẩn đoán theo dõi tiền sản giật Hiện nay, dấu ấn sinh học DNA phơi thai tự cịn số dấu ấn sinh học khác nghiên cứu ứng dụng lâm sàng để giúp dự báo sớm, chẩn đoán theo dõi TSG 1.2.7.1 PlGF sFlt1 1.2.7.2 PAPP-A 1.2.7.3 sEng 1.2.7.4 PP-13 1.3 Kỹ thuật Realtime PCR định lượng DNA 1.3.1 Nguyên tắc kỹ thuật Realtime PCR Chất huỳnh quang thêm vào hỗn hợp phản ứng PCR chèn vào sợi đôi DNA bắt cặp bổ sung với trình tự đặc hiệu DNA đích, ống phản ứng có diện sản phẩm khuếch đại PCR từ DNA đích nhân đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phát huỳnh quang nhận nguồn sáng kích thích khơng thể phát huỳnh quang khơng có sản phẩm khuếch đại ống Nếu ống phản ứng số lượng DNA đích nhiều cần chu kỳ nhiệt để đạt đến số lượng đủ để ống phản ứng cho tín hiệu huỳnh quang mà máy ghi nhận được, số lượng DNA đích cần nhiều chu kỳ nhiệt Tính tốn số copy DNA đích ban đầu có ống phản ứng phải dựa vào đường biểu diễn chuẩn, xác định mối quan hệ chu kỳ ngưỡng với số lượng copy DNA đích ban đầu có ống phản ứng 1.3.2 Biểu đồ chuẩn kỹ thuật Realtime PCR Là đường thẳng tuyến tính qua điểm tọa độ xác định số lượng DNA đích ban đầu mẫu chuẩn chu kỳ ngưỡng tương ứng 1.3.3 Một số kỹ thuật Realtime PCR thường sử dụng 1.3.4 Ưu điểm nhược điểm kỹ thuật Realtime PCR Ưu điểm: kỹ thuật định lượng, độ xác cao, thời gian phát sản phẩm nhanh, phân tích kết không cần bước điện di gel, tiến hành nhiều mẫu/ngày, hạn chế tạp nhiễm độ lặp lại cao lần thử nghiệm, phịng thí nghiệm khác 1.3.5 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Bao gồm nhóm: nhóm thai phụ bình thường nhóm thai phụ tiền sản giật Chất liệu nghiên cứu: 5ml máu tĩnh mạch lấy vào ống có chứa EDTA, ly tâm tách huyết tương bảo quản -800C đến sử dụng 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng nghiên cứu Nhóm thai phụ bình thường: Thai phụ khơng có tiền sử sảy thai, thai lưu, không nạo hút, tiền sử TSG, sản giật; khơng có ý định phá thai; q trình mang thai đến lúc sinh khơng xuất TSG; theo dõi sản phụ sinh sinh bình thường Nhóm thai phụ tiền sản giật: bao gồm thai phụ chẩn đoán TSG theo Hướng dẫn chẩn đoán Bộ Y tế (2015), có triệu chứng: tăng huyết áp HATT ≥ 140mmHg, HATTr ≥ 90mmHg protein niệu ≥ 0,5 g/l mẫu nước tiểu ngẫu nhiên 0,3 g/l mẫu nước tiểu 24h 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ Thai phụ có mắc bệnh từ trước, bao gồm: đa thai, đa ối, thai dị dạng; có bệnh mắc kèm: bệnh tim, bệnh thận, tăng huyết áp, đái tháo đường, bệnh Basedow, bệnh gan 2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu Nhóm thai phụ bình thường: 90 mẫu máu thai phụ bình thường (30 mẫu máu thai phụ có thai từ tuần 12-15 (quý 1); 30 mẫu máu thai phụ có thai từ tuần 16-25 (quý 2); 30 mẫu máu thai phụ có thai từ tuần 31-35 (quý 3)) Nhóm thai phụ TSG: 30 mẫu máu thai phụ chẩn đốn TSG có thai từ tuần 22 - 40 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang Kết hợp với đối chiếu với thực tế (biểu lâm sàng thai phụ, tình trạng trẻ sinh ra, ) 2.3.2 Các số cần xác định nghiên cứu Các số lâm sàng: tuổi thai phụ tuổi thai; huyết áp thai phụ; phù Các số cận lâm sàng: nhóm số huyết học bản; nhóm số hóa sinh máu bản, nồng độ DNA phơi thai tự 2.3.3 Kỹ thuật xác định số nghiên cứu: Tách chiết DNA, PCR, nested PCR (PCR lồng), Realtime PCR, điện di 2.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành tại: Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội; Phòng khám Vạn Phúc; Bệnh viện Phụ Sản Trung ương; Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch Trường Đại học Y Hà Nội; Phòng Viêm gan virus Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Thời gian nghiên cứu: Tháng 1/2013 đến tháng 06/2015 2.5 Trang thiết bị máy móc phục vụ nghiên cứu 2.6 Phương pháp phân tích số liệu Các số liệu thu thập nghiên cứu xử lý theo thuật toán thống kê Y học máy tính phần mềm SPSS 16.0 Sử dụng phần mềm CFX Manager™ chuyên dụng máy Realtime PCR (BioRad) tính tốn nồng độ DNA phơi thai tự Test kiểm định sử dụng: Mann-whitney, Chisquared, Fissher's exact Các phép kiểm định, so sánh có ý nghĩa thống kê p< 0,05 2.7 Đạo đức nghiên cứu Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Một số đặc điểm đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Đặc điểm tuổi huyết áp Bảng 3.1 Một số đặc điểm tuổi, huyết áp đối tượng nghiên cứu Nhóm thai phụ Bình thường Tiền sản giật p Đặc điểm (n = 101) (n = 50) Tuổi thai phụ 29,4 ± 5,0 30,8 ± 5,2 > 0,05 HATT (mmHg) 113,1 ± 8,4 157,4 ± 22,0 < 0,01 HATTr (mmHg) 69,9 ± 6,3 101,0 ± 14,7 < 0,01 Khơng có khác biệt độ tuổi nhóm thai phụ bình thường tiền sản giật với p > 0,05 Chỉ số huyết áp tâm thu huyết áp tâm trương nhóm thai phụ tiền sản giật tăng cao so với nhóm thai phụ bình thường, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 3.1.2 Đặc điểm tỷ lệ phù Bảng 3.2 Tình trạng phù đối tượng nghiên cứu Nhóm thai phụ Bình thường Tiền sản giật Triệu chứng p n % n % phù Có 0,0 37 74,0