Mục đích của nghiên cứu là khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn thích hợp giữa enzyme (E) và chế phẩm vi sinh vật có ích (EM), tỉ lệ nước bổ sung, nhiệt độ ủ, thời gian ủ tới quá trình thủy phân bã men bia bằng chế phẩm enzyme alcalase.
No.17_Aug 2020|Số 17 – Tháng năm 2020|p.54-60 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN BĨN DẠNG LỎNG TỪ BÃ MEN BIA SỬ DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME ALCALASE THƯƠNG MẠI Đinh Thị Kim Hoa1*, Lưu Hồng Sơn1, Tạ Thị Lượng1,2, Lê Minh Châu 1, Dương Ngọc Dương1, Trần Văn Chí1, Vi Đại Lâm1, Nguyễn Thị Tình1, Nguyễn Văn Duy1, Ngơ Xn Bình1 Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên * Đại học Queensland Email: Dinhthikimhoa@tuaf.edu.vn Thông tin viết Ngày nhận bài: 11/5/2020 Ngày duyệt đăng: 12/8/2020 Từ khóa: Enzyme Alcalase, phân bón, bã men, tối ưu, BoxBehnken Tóm tắt Mục đích nghiên cứu khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn thích hợp enzyme (E) chế phẩm vi sinh vật có ích (EM), tỉ lệ nước bổ sung, nhiệt độ ủ, thời gian ủ tới trình thủy phân bã men bia chế phẩm enzyme alcalase Các thí nghiệm đơn nhân tố thu kết tỉ lệ enzyme chế phẩm EM bổ sung EM 2% + E 1,5%, tỉ lệ nguyên liệu/nước 1/3, nhiệt độ thủy phân 45ºC thời gian 8h Trên sở khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện thủy phân, cho thấy thông số tỷ lệ phối trộn enzyme EM, tỷ lệ nước bổ sung, nhiệt độ thời gian thủy phân yếu tố ảnh hưởng mạnh đến trình thủy phân Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box- Behnken tìm điều kiện tối ưu trình thủy bã men bia tỷ lệ phối trộn enzyme EM EM 2% + E 1,5%, tỉ lệ nước bổ sung: 1/3, nhiệt độ thủy phân 45ºC thời gian Kết thực nghiệm cho kết có độ tương thích cao với mơ hình MỞ ĐẦU Quá trình sản xuất bia thải nhiều loại phế trung chủ yếu lớp không gian chứa tế bào nấm liệu: Phế liệu hạt, mầm malt, bã malt, cặn protein, nấm men [3], [4] Ở Việt Nam nói chung nhà máy sản men bia CO2 Ngoài CO2 nguồn phế liệu xuất bia Thái Nguyên nới riêng, bã men bia chưa tái sử dụng để tăng chất lượng bia bã malt, mầm sử dụng cách có hiệu mà thải mơi malt nấm men bia nguồn phế liệu có ý nghĩa trường bên ngồi, điều gây nhiễm mơi trường quan trọng thực phẩm thức ăn gia súc chất thải men bia có hàm lượng COD cao Việc đưa số lượng giá trị dinh dưỡng Bã nấm men bia dạng phân bón dạng lỏng từ thủy phân bã men bia có phế phẩm sản xuất, nằm lại thùng ý nghĩa lớn Việc thủy phân bã men bia chịu ảnh lên men hầm chứa sau lên men lên hưởng tỉ lệ phối trộn EM + E thích hợp, tỉ lệ nước men phụ Men bia có giá trị dinh dưỡng cao chữa bổ sung, nhiệt độ ủ thời gian thủy phân Vì mục bệnh tốt Bã men bia (hay cịn gọi nấm men bia) đích nghiên cứu nhằm tối ưu hóa q trình thủy thuộc lồi Saccharomyces cerviside, có hoạt tính phân protein hịa tan từ bã men bia trường Đại học enzyme invertase (EC 1.2.4) Enzyme thường tập Nông Lâm Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên D.T.K.Hoa et al/ No.17_Aug 2020|p.54-60 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU có nồng độ mg/ml Sau pha lỗng dung dịch gốc nước cất với nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 2.1 Vật liệu nghiên cứu 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn Lấy Bã men bia (hay cịn gọi nấm men bia) thuộc xác 0,5ml dung dịch BSA nồng độ pha loãng loài Saccharomyces cervisiae, lấy nhà máy cho vào ống nghiệm, thêm vào ống 2ml bia Vicoba, 158 Minh Cầu, Thành phố Thái Nguyên, dung dịch C (là hỗ hợp Dung dịch A: 4g NaOH tỉnh Thái Nguyên Nguyên liệu phân loại sau (0,1M) 20g Na2CO3 (2%) pha 1000ml nước đem sấy nhiệt độ 80ºC đến độ ẩm < 10%, tiến cất dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha hành bảo quản túi nhựa polyetylen (PE) đặt dung dịch Natri Xitrat (1%) dung hộp nhựa kín, lưu trữ nhiệt độ phịng, tránh dịch Natri, Kali Tactơrat 1% theo tỉ lệ theo tỉ lệ 49:1) ánh sáng ẩm để nhiệt độ phịng 10 phút, sau cho 0,25ml thuốc Dung mơi sử dụng nghiên cứu nước cất (dạng tinh khiết - Việt Nam) thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống 2.2 Bố trí thí nghiệm nghiệm, thêm vào 2ml dung dịch C bước Protein hòa tan thủy phân từ bã men bia tiến hành mẫu thí nghiệm việc bổ sung nước với tỷ lệ nguyên liệu/nước 1/2, Qua lần lặp lại thí nghiệm xây dựng 1/3, 1/4; tỉ lệ phối trộn EM E 1% - 1,5%; 1,5% - đường hồi quy Kết xử lý theo phương pháp 1,5%; 2% -1,5%; 1,5% - 1%; 1,5% - 2%; nhiệt độ ủ thống kê thông thường Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn 35ºC, 45ºC, 55ºC; thời gian thủy phân lần phụ thuộc OD với hàm lượng protein lượt giờ, giờ, Sau tiến hành khảo sát Mẫu thí nghiệm: lấy xác 0,5ml dịch chứa đơn nhân tố, lựa chọn yếu yếu protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống nghiệm, tố ảnh hưởng lớn đến việc thủy phân bã men bia thêm vào 2ml dung dịch C, lắc để yên 10 để đánh giá khả ảnh hưởng chúng, chúng tơi phút Sau thêm vào hỗn hợp ống nghiệm sử dụng phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí 0,25ml thuốc thử Folin pha loãng lần, lắc nghiệm Box - Behnken với yếu tố, cấp độ để yên 30 phút, màu vàng hỗn hợp chuyển Xác định hàm lượng protein hòa tan sang màu xanh da trời đạt đến cường độ màu cực Hàm lượng protein hòa tan dịch thủy phân đại Đem so màu hỗn hợp máy đo quang xác định phương pháp Lowry [6] Phương bước sóng 660 nm Xác định trị số mật độ quang pháp dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn học (OD) dung dịch nghiên cứu Đo máy hợp photphomolipden - photphovonphramat (thuốc lần lặp lại lấy trị số trung bình Dựa vào đồ thị thử Folin - ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời chuẩn, xác định hàm lượng protein có độ hấp thụ cực đại bước sóng 660nm Cường độ mẫu nghiên cứu màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ 2.3 Phương pháp xử lý số liệu protein phạm vi định Dựa vào mức độ Số liệu xử lý, phân tích phương sai nhân hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu Xây dựng đường đồ thị chuẩn Sử dụng albumin huyết bò (BSA) làm chất tố (One - way ANOVA) dùng phần mềm SPSS 20.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ phối trộn EM enzyme chuẩn để xây dựng đường chuẩn thể mối quan hệ Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ phối độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 660 nm nồng trộn enzyme Alcalase chế phẩm EM BESTOT độ protein Cân 0,01g (10 mg - albumin huyết N02 tới chất lượng phân bón dạng nước thể bị) hồ tan 10ml nước, ta dung dịch gốc bảng D.T.K.Hoa et al/ No.17_Aug 2020|p.54-60 Bảng Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ phối trộn enzyme EM Hàm lượng pro hòa tan (mg/ml) CT Tỷ lệ phối trộn (%) 1% +1,5% 71,55a 1,5% +1,5% 77,30c 2% + 1,5% 82,11e 1,5% + 1% 77,41d 1,5% + 2% 74,41b Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 Bảng cho thấy việc phối trộn enzyme EM ảnh CT3 (EM 2% + 1,5% E) thích hợp so với hưởng rõ rệt tới hiệu thủy phân bã men bia công thức phối trộn khác Từ tất nhận xét tới tiêu chất rắn hòa tan dưa lưới AB Việc phối trộn hai loại enzyme EM cho thấy lựa chọn công thức phối trộn EM 2% + 1,5% E để cố định cho thí nghiệm hàm lượng protein hòa tan thu cao hẳn so với việc dùng yếu tố xúc tác đơn lẻ Ta dễ thấy 3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ nước bổ sung Sau lựa chọn loại tỉ lệ sử dụng với CT3 kết đạt vượt trội so với bốn cơng thức cịn lại (81,11mg/ml) Ngược lại CT1 cho enzyme chế phẩm sinh học EM cho mục đích thủy phân bã men bia thành, ta tiến hành nghiên cứu tìm tỉ kết thấp CT (71,55mg/ml) Điều lệ nước bổ sung thích hợp thơng qua hàm lượng cho ta thấy tỉ lệ phối trộn chế phẩm EM enzyme protein hòa tan Kết thể bảng Bảng Kết ảnh hưởng tỉ lệ nước bổ sung CT Tỉ lệ nước mbmb Hàm lượng pro hòa tan (mg/ml) 1:2 78,87b 1:3 82,59c 1:4 77,22a Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thơng kê mức α = 0,05 Dựa vào kết bảng 2, thay đổi tỉ lệ nước bổ sung hiệu thủy phân enzyme chế phẩm EM thay đổi khác 3.3 Ảnh hưởng thời gian ủ Bã men bia tiến hành thủy phân với thông số tỉ lệ phối trộn enzyme EM, tỉ lệ nước công thức nghiên cứu Hàm lượng protein hòa tan thu cao CT 82,59 (mg/ml) thấp bổ sung tối ưu thí nghiệm khoảng thời gian 7h, 8h, 9h Sau tiến hành phân với CT3 77,22 (mg/ml) Từ kết nghiên cứu trên, tích hàm lượng protein hòa tan Kết thu thể ta lựa chọn CT2, với tỉ lệ bổ sung nguyên liệu/nước 1/3 để xây dựng quy trình sản xuất phân bón dạng bảng nước từ nguồn nguyên liệu bã men bia Bảng Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian ủ CT Thời gian (giờ) Hàm lượng pro hòa tan (mg/ml) 79,17a 83,41b 83,09b Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 Qua bảng 3, thời gian thủy phân có ảnh hưởng tới hàm lượng protein hịa tan Nhìn chung tăng thời gian thủy phân, hàm lượng protein hòa tan thu tăng Hàm lượng protein hòa tan thu CT2 D.T.K.Hoa et al/ No.17_Aug 2020|p.54-60 CT3 cao so với CT1, CT2 CT3 lại khơng có khác biệt mức ý nghĩa α = 0,05, CT2 thời gian thủy phân dài CT3 Điều 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ Để xác định nhiệt độ ủ chế phẩm EM thủy phân bã men bia phù hợp, tiến hành thủy phân nguyên giải thích thời gian lượng liệu điều kiện cố định yếu tố công nghệ chất enzyme thủy phân triệt để Từ nhận xét trên, để giảm thời gian sản xuất, tiết kiệm chi xác định thí nghiệm 1,2 nhiệt độ khác là: 35oC, 45oC, 55oC Sau phí, ta lựa chọn thời gian thủy phân bã men bia để sản xuất phân bón dạng nước 8h tiến hành đo hàm lượng protein hòa tan, thu kết thể bảng Bảng Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ CT Thời gian (giờ) Hàm lượng pro hòa tan (mg/ml) 35 79,47a 45 83,46b 55 83,23b Ghi chú: Các chữ cột biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 Dựa vào kết bảng ta thấy nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng tới hiệu thủy phân enzyme EM Khi tăng nhiệt độ thủy phân từ 35oC 3.5 Tối ưu hóa q trình thủy phân Chúng tơi sử dụng phương pháp bề mặt tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box- Behnken với ba biến tới 45oC hàm lượng protein hòa tan thu tăng, nhiên tiếp tục tăng nhiệt độ lên tới 55oC ba cấp độ Các số liệu thu từ dịch thủy phân bã hàm lượng protein hòa tan thu thay đổi không (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA đáng kể, khơng có sai khác biệt với cơng thức nhiệt độ 55oC, hàm lượng protein hòa tan thu nằm khoảng 83 mg/ml Điều cho ta thấy, nhiệt độ tối ưu cho thủy phân enzyme Alcalase nằm khoảng 45 oC, kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Normah I cộng công men bia xử lý phần mềm Design- Expert 7.0 dùng để đánh giá kết thu Tiến hành giải toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi” Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định giá trị ba yếu tố mà hàm lượng protein hịa tan cao [5] Áp dụng bố năm 2005 [5] Từ kết trên, chúng tơi lựa chọn phương pháp phân tích hồi quy số liệu thực nhiệt độ tối ưu cho q trình thủy phân phân bón dạng nước từ nguồn nguyên liệu bã men bia 45 oC nghiệm, thu mơ hình đa thức bậc hai thể hàm lượng protein hòa tan: Y= + 83.44 + 0.15*A + 0.38* B + 0.74 * C - 1.08*A*B - 0.20*A*C - 0.30*B*C - 3.26 *A2 - 1.67 B2 - 0.85*C2 Trong Y hàm lượng protein hịa tan dịch thủy phân thu Bảng Ma trận thực nghiệm Box-Behken ba yếu tố thủy phân bã men bia TN 10 11 A (Tỷ lệ nước bổ sung) 4 4 3 Biến thực B (nhiệt độ) 35 35 55 55 45 45 45 45 35 55 35 C (thời gian) 8 8 7 9 7 Hàm lượng pro hòa tan (mg/ml) 77,64 79,17 80,02 77,22 77,83 79,47 79,59 80,45 79,17 81,09 81,36 D.T.K.Hoa et al/ No.17_Aug 2020|p.54-60 TN A (Tỷ lệ nước bổ sung) 3 3 3 12 13 14 15 16 17 Biến thực B (nhiệt độ) 55 45 45 45 45 45 C (thời gian) 8 8 Hàm lượng pro hòa tan (mg/ml) 82,18 83,35 83,47 83,45 83,46 83, 45 Để đánh giá mơ hình chúng tơi sử dụng phân tích ANOVA Kết phân tích ANOVA thể qua bảng sau: Bảng Phân tích phương sai ANOVA mơ hình thủy phân bã men bia Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p Model 75,18 8,35 24,28 0,0002 A 0,19 0,19 0,55 0,4825 B 1,16 1,16 3,38 0,1086 C 4,35 4,35 12,65 0,0093 AB 4,69 4,69 13,63 0,0077 AC 0,15 0,15 0,44 0,5274 BC 0,37 0,37 1,08 0,3329 A² 44,62 44,62 129,71