Nghiên cứu thu cao chiết methanol, định danh thành phần hóa học dịch chiết hexane và phân lập chất tinh khiết của cây giảo cổ lam ở núi ngọc linh, tỉnh quảng nam

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HĨA HỌC  KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP (bản tóm tắt) NGHIÊN CỨU THU CAO CHIẾT METHANOL, ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC DỊCH CHIẾT HEXANE VÀ PHÂN LẬP CHẤT TINH KHIẾT CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM Ở NÚI NGỌC LINH, TỈNH QUẢNG NAM Sinh viên thực : Nguyễn Như Quỳnh Chuyên ngành : Hóa học MSSV : 314054161144 Lớp : 16CHDE Người hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường ĐÀ NẴNG, NĂM 2020 Tóm tắt Bài tóm tắt trình bày kết nghiên cứu độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại nặng, xây dựng quy trình chiết tách, định danh xác định cấu trúc hóa học hợp chất có Giảo cổ lam Đặt vấn đề Ngày nay, việc tìm kiếm hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc xu nhà khoa học quan tâm Nhiều dược liệu sử dụng để chiết tách hoạt chất làm thuốc ứng dụng rộng rãi việc phòng, chữa bệnh Nam Trà My tỉnh Quảng Nam vùng đất có khoảng 300 lồi dược liệu khác nhau, có nhiều dược liệu Giảo cổ lam chiếm diện tích khoảng 20 ha, phổ biến khu vực rừng nguyên sinh, có độ che phủ từ 50% trở lên, hầu hết từ độ cao từ 1.000m trở lên so với mặt nước biển Cây Giảo cổ lam thảo dược dân gian sử dụng nhiều việc bồi bổ sức khỏe, chống lão hóa, chữa trị bệnh đái tháo đường, lipid máu cao, hỗ trợ điều trị tim mạch, ung thư,… Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bảo tồn phát triển Giảo cổ lam nhằm tạo nguồn nguyên liệu dược phục vụ lĩnh vực y học, thực phẩm mỹ phẩm vấn đề cần thiết Cho đến có số đề tài nghiên cứu giảo cổ lam giới Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học, tính chất, khả ứng dụng hợp chất có Giảo cổ lam núi Ngọc Linh Bài báo cáo bước đầu khảo sát quy trình chiết tách, định danh, phân lập xác định cấu trúc hợp chất Giảo cổ lam Tổng quan tình hình nghiên cứu nước giới Năm 1997, GS.TS Phạm Thanh Kỳ cộng phát giảo cổ lam núi Phanxipang, xác định loại Gynostemma pentaphyllum tiến hành nghiên cứu Nhóm nghiên cứu tìm số hoạt chất cơng dụng chất Từ đó, mở đường cho nghiên cứu nuôi trồng Giảo cổ lam hiệu Trên giới, Trung Quốc Nhật Bản bắt đầu nghiên cứu GCL từ sớm phát thành phần hóa học hoạt tính sinh học quan trọng GS Tan H., Liu Z.L.,Liu MJ Chứng minh giảo cổ lam có tác dụng kìm hãm tích tụ tiểu cầu, làm tan cục máu đông, chống huyết khối, tăng cường lưu thông máu lên não Lin, J.M., cộng chứng minh giảo cổ lam có tác dụng chống viêm gan, chứng cao huyết áp chống ung thư Có tác dụng chống viêm mạnh Indomethacin Wang cộng chứng minh Giảo cổ lam có tác dụng chống u rõ rệt, tăng cường miễn dịch Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu quy trình chiết tách hợp chất dung môi Methanol từ Giảo cổ lam - Xác định số vật lý Giảo cổ lam - Định danh, xác định thành phần hóa học hợp chất chiết tách - Phân lập chất tinh khiết xác định cấu trúc Tổng quan Giảo cổ lam Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) Tên thường gọi Giảo cổ lam hay gọi cam trà vạn, long đởm, cổ yếm, thư tràng năm lá, dây lõa hùng, trường sinh (trường sinh thảo), cỏ thần kỳ, bổ đắng, sâm phương nam thất diệp đảm, ngũ diệp sâm Cây hàng năm, thân thảo mảnh, leo nhờ tua đơn nách Có đực riêng biệt, với kép hình chân vịt, mép cưa với lông trắng Cụm hoa hình chùy mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, cánh hoa xịe hình Phần mặt đất có dạng dây leo Thân hình trụ, có góc cạnh, dài 0.3 m đến m, phân đốt, khoảng cách đốt từ cm đến 10 cm, mang tua mọc phía cuống Lá kép hỉnh chân chim có đến chét, chét thường lớn chét bên, cuống dài cm đến cm Phiến màu lục hay vàng nâu, mép có cưa trịn Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị phương pháp nghiên cứu 5.1 Nguyên liệu Cây giảo cổ lam thu hái núi Ngọc Linh, tỉnh Quảng Nam, rửa sạch, phơi khô cắt đoạn ngắn 2cm – cm phơi, sấy khô nhiệt độ 50 – 60°C nghiền nhỏ Sau đó, chiết hồi lưu dung mơi methanol chiết trích ly với dung mơi hexane 5.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu Bảng Các hóa chất sử dụng đề tài Khối lượng Độ tinh Tên hóa Cơng thức chất phân tử Methanol CH3OH 32.04 99.50% 64 Trung Hexane C6H14 86.18 97.00% 69 Quốc STT phân tử M (g/mol) khiết tos (0C) Xuất xứ Thiết bị cô quay chân không; tủ sấy, lò nung; cột sắc ký; máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS; máy đo sắc kí khí ghép khối phổ;đèn tử ngoại; máy đo phổ IR, NMR, UV-VIS 5.3 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp xác định độ ẩm, hàm lượng tro, hàm lượng kim loại nặng; - Phương pháp chiết mẫu: chưng ninh, chiết phân bố; - Phương pháp định danh thành phần hóa học dịch chiết: GC – MS; - Phương pháp phân lập chất: Sắc kí mỏng (TLC), sắc kí cột (CC); Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất: Kết hợp phương pháp phổ IR, UV – VIS, 1H – NMR, 13C – NMR 6 Kết thảo luận 6.1 Xác định số số vật lý 6.1.1 Độ ẩm Bảng Kết khảo sát độ ẩm mẫu bột nguyên liệu khô STT m1 (g) m2 (g) m3 (g) W (%) 36.330 3.015 39.055 9.628 36.850 3.020 36.968 9.609 37.211 3.003 37.336 9.580 Wtb (%) 9.605 Nhận xét: Độ ẩm trung bình bột nguyên liệu khoảng 9.605% Với độ ẩm này, nguyên liệu bảo quản suốt trình làm thực nghiệm không bị nấm mốc, hư hại nằm khoảng cho phép độ ẩm an toàn dược liệu ≤13% 6.1.2 Hàm lượng tro Bảng Kết khảo sát hàm lượng tro mẫu bột thí nghiệm Hàm lượng tro STT m1 (g) m2(g) m4 (g) 36.360 3.012 36.400 1.328 37.830 3.018 37.878 1.590 37.271 3.005 37.314 1.430 Hàm lượng tro trung bình (%) (%) 1.449 Nhận xét: Vậy hàm lượng tro trung bình mẫu bột giảo cổ lam khoảng 1.449% Hàm lượng có giá trị gần với loại dược liệu dây, thân hay dùng dân gian, an toàn cho người sử dụng 6.1.3 Hàm lượng kim loại Bảng Kết khảo sát hàm lượng số kim loại nặng mẫu bột thí nghiệm Kim loại As Cd Hg Pb Hàm lượng (ppm) 0.0216 0.0264 0.0137 0.2548 1.0 1.0 0.5 2.0 Tiêu chuẩn Việt Nam (ppm) Nhận xét: Căn vào tiêu chuẩn quy định Thông tư số 02/2011/TT-BYT ngày 13/01/2011 Bộ Y tế ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia giới hạn nhiễm hóa học thực phẩm, hàm lượng kim loại nặng có giảo cổ lam nhiều so với hàm lượng tối đa cho phép dược liệu 6.1.4 Khảo sát điều kiện chiết hồi lưu với dung môi Methanol Bảng Kết khảo sát rắn - lỏng m giảo cổ Lần lam (gam) Vmethanol Thời gian t (mL) (phút) Nhiệt độ (0C) m1 Hàm lượng (gam) (%) 10.01 100 90 75 1.24 12.3 10.02 125 90 75 1.32 13.2 10.01 150 90 75 1.57 15.5 10.04 175 90 75 1.59 15.9 10.02 200 90 75 1.55 15.5 Bảng Kết khảo sát thời gian chiết Lần m giảo cổ lam Vmethanol Thời gian t Nhiệt độ m1 Hàm lượng (gam) (mL) (phút) (0C) (gam) (%) 10.02 150 30 75 1.32 13.2 10.01 150 60 75 1.41 14.1 10.01 150 90 75 15.9 15.9 10.02 150 120 75 1.68 16.8 10,01 150 150 75 1.54 15.4 Dựa vào bảng mô tả 3.4 3.5, giá trị điều kiện thích hợp để thu lượng cao methanol tốt phương pháp chiết hồi lưu là: + Nhiệt độ 750C (Nhiệt độ nội cách thủy methanol sôi); + mgiảo cổ lam (gam) / Vmethanol (mL) 1/1.5; + Thời gian chiết t = 120 phút 6.1.5 Kết định danh thành số phần hóa học giảo cổ lam cao chiết hexane Bảng Một số thành phần hóa học cao chiết hexane Thời STT Tên hợp chất gian %diện lưu tích (phút) Dihydroactinidiolide 20.558 0.37 Cơng thức cấu tạo Dodecanoic acid 21.227 0.21 Tetradecanoic acid 25.790 1.02 Pentadecanone,6,10,1 27.697 0.50 24 4-trimethyl Pentadecanone acid Hexadecanoic acid, methyl ester 28.259 0.67 29.055 1.09 Isophytol 29.314 0.19 n-Hexadecanoic acid 30.380 26.0 30.688 0.69 30.821 0.50 30.879 0.46 10 11 9,17-Octadecadienal, (Z)- Heptadecanoic acid Methyl 10-trans,12cis-octadecadienoate 9,12,1512 Octadecatrienoic acid, methyl ester, 30.954 1.32 (z,z,z)- 13 Phytol 31.083 1.07 14 Methyl stearate 31.160 0.22 Octadecatrienoic acid 31.792 28.83 9,12,1515 (z,z,z)- 16 Eicosanoic acid 32.953 1.33 17 Docosanoic 34.041 0.63 18 Squalene 35.334 2.43 19 alpha.-Tocospiro B 35.481 0.50 20 gamma.-Tocopherol 36.371 0.37 21 Vitamin E 36.736 0.29 22 Stigmasterol 37.846 2.16 38.155 0.22 38.285 0.32 Stigmasta-7,25-dien23 3-ol, (3.beta.,5.alpha.)- 24 Lanosterol Nhận xét: Từ kết Bảng cho thấy phương pháp GC-MS định danh 24 cấu tử cao chiết hexane giảo cổ lam Trong số 24 cấu tử định danh có số cấu tử có hàm lượng lớn 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (z,z,z)-28.83%, n-Hexadecanoic acid 26.00%, Squalene 2.43%, Stigmasterol 2.16% Trong đó, 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (z,z,z)- ngăn ngừa rối loạn nhịp tim, giảm nguy huyết khối, n-Hexadecanoic chống viêm, Stigmasterol làm giảm cholesterol, Tocopherol có khả quét gốc tự chống oxy hóa 6.1.6 Xác định công thức cấu tạo hợp chất tinh khiết GP1 Hợp chất GP1 tách dạng dầu, màu cam, tan tốt methanol (Hình 1) Phổ UV-Vis (MeOH) cho đỉnh hấp phụ cực đại λmax 412, 315, 300 285 nm ➢ Các số liệu phổ:  Phổ FT – IR (Xem Hình 2) Phổ IR dải hấp thụ νmax 3443 (OH), 3013, 2963, 2930, 2855 (CH), 1708 (C=O), 1641 (CH=CH), 1460, 1283, 933 718 cm-1 Hình Phổ hồng ngoại (FT – IR) hợp chất GP1  Phổ 1H-NMR (Xem Hình 3) Hình Phổ 1H-NMR (CDCl3, 125 MHz) hợp chất GP1 Phổ 1H-NMR hợp chất GP1 gợi ý diện liên kết đơi với proton olefin δH 5.36 Ngồi cụm tín hiệu chập vùng trường cao nhóm methylene [δH 2.83 (4H), 2.30 (2H), 2.11 (4H), 1.62 (2H), 1.36 (8H)], nhóm methyl triplet [δH1,00 (3H)] đề nghị có mặt mạch hydrocarbon khơng phân nhánh Thiếu tín hiệu H nhóm OH COOH, H nhóm có độ chuyển dịch hóa học khoảng >10ppm trao đổi proton nhanh nhóm COOH nên trường hợp khơng thu tín hiệu phổ proton Phổ 13C-NMR (Xem Hình 3.4) Trên phổ 13C-NMR có 18 tín hiệu tương ứng với 18 C Trên phổ 1H-NMR hợp chất GP1 khơng xuất nhóm COOH phổ 13 C-NMR có xuất độ chuyển dịch hóa học 178ppm (có tín hiệu nhú lên nhỏ đo CDCl3 xuất peak proton nhóm COOH) Phổ 13C-NMR hợp chất thể tín hiệu carbon carboxyl (δC  178 ), carbon olefin (δC 132.72, 131.07, 129.21, 129.18, 128.84, 128.23), 10 carbon methylene (δC21.47–35.09) carbon methyl (δC 14.64) (Bảng 3.7) Các kiện phổ 1D-NMR gợi ý hợp chất GP1 acid béo không no, mạch không phân nhánh Hình Phổ 13C-NMR (MeOD-C13CPD) hợp chất GP1 Bảng Số liệu phổ NMR hợp chất GP1 chất tham khảo Vị trí C δC# δCa, b δHa, c (J, Hz) 180.43 178 – 34.13 35.09 2.30 t (7.0) 24.69 26.13 1.62 quin (7.0) 29.62, 29.21, 30.67, 30.29, 29.13, 29.09 30.23, 30.19 27.23 28.15 4–7 1.36 m 2.11 m 131.85, 9, 10, 12, 13, 15, 16 130.14, 132.72, 131.07, 128.26, 129.21, 129.18, 128.22, 128.84, 128.23 5.36 m 127.80, 127.16 11, 14 25.65, 25.56 26.52, 26.41 2.83 t (6.0) 17 20.56 21.47 2.11 m 18 14.26 14.64 1.00 t (7.5) Tín hiệu proton δH 2.83 (4H, t, J = 6.0 Hz) cho thấy độ chuyển hóa học dịch 2.83 đặc trưng nhóm methylene vị trí bis-allylic Mặt khác, vị trí xuất tín hiệu triplet, nhóm CH2 bị kẹp hai nhóm CH nên gán cho nhóm methylene vị trí bis-allylic (xen kẽ liên kết đơi) Tín hiệu δH 2.11 (4H, m) gán cho nhóm methylene vị trí allylic (vị trí  so với liên kết đơi) Các kiện gợi ý diện cấu trúc 1,4,7 - triene mạch hydrocarbon Việc so sánh giá trị δC 28.15 carbon allylic (C-8) với giá trị tương ứng dạng cấu hình [(Z): δC 27–28; (E): δC 32–33] cho phép gán cấu hình Z cho liên kết đơi Kết hợp so sánh với liệu phổ chất tham khảo, hợp chất GP1 kết luận (9Z,12Z,15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid, gọi α-linolenic acid Hình Cấu trúc hóa học hợp chất GP1 Hợp chất GP1: α-linolenic acid có hoạt tính sinh học chế hoạt động sau: - Hoạt tính sinh học: Alpha Linolenic Acid (ALA) axit béo không no đa carbon (18 carbon với ba liên kết đơi) Nó gọi axit béo omega – 3, cần thiết cho tất động vật có vú Lượng axit alpha-linolenic (hoặc axit béo omega – 3) làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch (ngăn ngừa rối loạn nhịp tim dẫn đến tử vong tim đột ngột, giảm nguy huyết khối hình thành cục máu đơng dẫn đến đau tim đột quỵ, làm giảm nồng độ triglyceride huyết thanh, làm chậm phát triển mảng xơ vữa động mạch, cải thiện chức nội mô mạch máu, giảm huyết áp nhẹ giảm viêm Sự thiếu hụt ALA dẫn đến vấn đề thị giác bệnh lý thần kinh cảm giác, viêm da xuất huyết có vảy viêm da đầu phát triển - Cơ chế hoạt động: ALA coi axit béo thiết yếu cần thiết cho sức khỏe người, người tổng hợp Nó thực axit béo có nguồn gốc từ thực vật Con người tổng hợp axit béo omega – khác từ ALA, bao gồm axit eicosapentaenoic (EPA) axit docosahexaenoic (DHA) EPA tiền thân loại tiền giả loạt 3, leukotrien loạt thromboxan loạt Những eicosanoids có đặc tính chống viêm chống xơ vữa Các chất chuyển hóa ALA ức chế sản xuất eicosanoids tiền viêm, tuyến tiền liệt E2 (PGE2) leukotriene B4 (LTB4), cytokine gây viêm, yếu tố hoại tử khối u (TNFalpha) (IL-1 beta) Các axit béo omega-3 ALA sản phẩm phụ điều chỉnh biểu số gen, bao gồm gen liên quan đến chuyển hóa axit béo viêm Chúng điều chỉnh biểu gen thông qua tác động chúng hoạt động yếu tố phiên mã bao gồm NF-kappa B thành viên họ thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator-kích hoạt (PPAR) Sự kết hợp ALA chất chuyển hóa màng tế bào ảnh hưởng đến tính lưu động màng đóng vai trị hoạt động chống viêm, ức chế kết tập tiểu cầu hoạt động chống tăng sinh ALA ALA chuyển hóa delta6 desaturease thành axit steridonic Kết luận kiến nghị 7.1 Kết luận Trong trình triển khai nghiên cứu, đề tài đạt kết sau : ➢ Xây dựng quy trình chiết tách phương pháp chiết hồi lưu với dung môi methanol cô quay chân không nhằm thu cao Giảo cổ lam phù hợp với điều kiện - Tỉ lệ rắn – lỏng : 1/1.5 - Thời gian chiết tối ưu: ➢ Chỉ tiêu hóa lí Đã xác định thơng số hóa lý ngun liệu: độ ẩm bột nguyên liệu giảo cổ lam 9.605 %; hàm lượng tro 1.449 %, hàm lượng kim loại nặng As, Cd, Hg, Pb nằm khoảng cho phép theo quy định tiêu chuẩn hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép dược liệu ➢ Thành phần hóa học dịch chiết Bằng phương pháp GC-MS, định danh 31 cấu tử dịch chiết từ giảo cổ lam bao gồm ankane, cycloankane, acid hữu cơ, ether, ester, steroid, dẫn xuất phenol, triterpene, ancol, aldehyd acid, xetone vịng Trong đó, có số cấu tử có hàm lượng lớn 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (z,z,z)-28.83%, n-Hexadecanoic acid 26.00%, Squalene 2.43%, Stigmasterol 2.16% Trong đó, 9,12,15-Octadecatrienoic acid, (z,z,z) – ngăn ngừa rối loạn nhịp tim, giảm nguy huyết khối, n-Hexadecanoic chống viêm, Stigmasterol làm giảm cholesterol, Tocopherol có khả quét gốc tự chống oxy hóa Từ gam cao chiết n-hexane, phương pháp sắc ký cột silicagel lặp lại nhiều lần kết hợp với sắc ký mỏng, phân lập hợp chất GP1 tinh Việc kết hợp phương pháp phổ: phổ hồng ngoại FT- IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều 1H – NMR và13C – NMR cho phép xác định cấu trúc hợp chất phân lập Hợp chất GP1 α-linolenic acid hay (9Z,12Z,15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid (9,12,15-Octadecatrienoic acid (z,z,z)-), hợp chất có hoạt tính sinh học tốt Đây hợp chất có thành phần định danh tất cao chiết với hàm lượng cao 7.2 Kiến nghị - Tiếp tục phân lập phân đoạn lại cao chiết hexane kết hợp với phương pháp phổ để xác định thành phần hoá học - Tiếp tục nghiên cứu, đề xuất phương pháp chiết khác sử dụng dung môi khác để thu nhận cao chiết Giảo cổ lam với hàm lượng cao - Cần nghiên cứu phương pháp tinh chế loại bỏ tạp chất cao chiết để tránh ảnh hưởng đến chất lượng thành phần hóa học có - Khảo sát sâu thử nghiệm hoạt tính sinh học để ứng dụng làm hoạt chất cơng nghệ hóa dược, góp phần làm tăng giá trị sử dụng giá trị kinh tế Giảo cổ lam  ... miễn dịch Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu quy trình chiết tách hợp chất dung môi Methanol từ Giảo cổ lam - Xác định số vật lý Giảo cổ lam - Định danh, xác định thành phần hóa học hợp chất chiết. .. 1/1.5; + Thời gian chiết t = 120 phút 6.1.5 Kết định danh thành số phần hóa học giảo cổ lam cao chiết hexane Bảng Một số thành phần hóa học cao chiết hexane Thời STT Tên hợp chất gian %diện lưu... - Phân lập chất tinh khiết xác định cấu trúc Tổng quan Giảo cổ lam Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino thu? ??c họ Bầu bí (Cucurbitaceae) Tên thường gọi Giảo cổ lam