Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch polymer nhạy nhiệt và đánh giá các đặc tính hóa lý của hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin

Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG iv CHƢƠNG 1: THỰC NGHIỆM 1.1 THỰC NGHIỆM 1.1.1 Hóa chất 1.1.2 Thiết bị dụng cụ 1.1.3 Thực nghiệm CHƢƠNG 2: KẾT QUẢ 2.1 ĐẶC TÍNH NHẠY NHIỆT CỦA COPOLYMER GHÉP CHITOSAN- PLURONIC F127 2.2 KẾT QUẢ MANG, NHẢ NANOCURCUMIN CỦA HYDROGEL NHẠY NHIỆT CHITOSAN-PLURONIC F127 2.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA VẬT LIỆU LÊN KHẢ NĂNG TĂNG SINH NGUYÊN BÀO SỢI 2.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CHỮA LÀNH VẾT THƢƠNG CHƢƠNG 3: KẾT LUẬN 11 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page i Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa CST Critical Solution Temperature CS Chitosan Cur Curcumin DMF Dimethyleformamide DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium GPC Gel Permeation Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance IR Infrared ICP-AES Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy KLPT Khối lƣợng phân tử LCST Lower Critical Solution Temperature NMR Nuclear Magnetic Resonance PBS Phosphate-Buffered Saline PEO Poly(ethylene oxide) PEG Polyethylene glycol PPO poly(propylene oxide) PNIPAM Poly(N-isopropylacrylamide) SRB sulforhodamin B THF Tetrahydrofuran TEM Transmission Electron Microscope UCST Upper Critical Solution Temperature Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page ii Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin DANH MỤC HÌNH Hình 1: chuyển hóa sol-gel dung dịch chitosan-pluronic 10oC 37oC Hình 2: Giản đồ pha thể tƣơng quan nhiệt độ (25°C, 30°C, 37°C, 45°C 50°C) nồng độ mẫu copolyme từ F1-F8, hydrogel CP với lƣợng khác (wt/ wt) F127 lƣợng không đổi chitosan (CS) Hình 3: Đồ thị biểu diễn thay đổi G’ G’’ dao động nhiệt với tần số biên độ không đổi mẫu F7 nồng độ 15% wt/v Hình 4: Dạng sol-gel chitosan-F127 chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) Hình 5: Kết TEM hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) Hình 6: Khả giải phóng nanocurcumin (nCur) từ hidrogel chitosanFluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) môi trƣờng PBS Hình 7: Hình thái tăng sinh nguyên bào sợi với (a) mẫu đối chứng; (b) mẫu xử lý với CS-F127; (c) mẫu xử lý với nCur-CS-F127 Hình 8: Lƣợng nguyên bào sợi tăng sinh mẫu thử nghiệm khảo sát thời gian 24 Hình 9: Hình ảnh theo dõi trình chữa lành vết bỏng đồ thị đánh giá độ co vết thƣơng Hình 10: Kết nhuộm hóa mô Hematoxyline&Eosin của: a) Mô thƣờng, b) mô chữa với Biafine c) mô chữa với hydrogel composite 10 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page iii Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin DANH MỤC BẢNG Bảng Khảo sát nhiệt độ tạo gel copolymer ghép khả chuyển đổi từ gel sang dung dịch ngƣợc lại Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page iv Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin CHƢƠNG 1: THỰC NGHIỆM 1.1 THỰC NGHIỆM 1.1.1 Hóa chất Chitosan (CS, MW~300,000 g/mol, 95% axetyl hoá); Pluronic (F127), (Mw: 12.500 g/mol, Acros Organics); Curcumin (Cur; 1,7-bis (4-hydroxy-3methoxyphenyl)-1,6-hepadiene-3,5-dione); (NPC) (Mw: 201.56 p-nitrophenyl chloroformate g/mol, BASF Corp), THF (Tetrahydrofuran), Dimethylformamide (DMF); 3-Amino-1-propanol (99%) (Acros Organic), dietyl ete (Acros Organic); HCl 0,1% 1.1.2 Thiết bị dụng cụ - Dụng cụ thủy tinh: lọ nhỏ có nắp kín, becher, bình cầu cổ, becher 50ml - Nhiệt kế - Cân phân tích điện tử - HADAM AEP – 250G (4 số lẻ) - Máy khuấy từ gia nhiệt - Máy cô quay chân không - Túi thẩm tách Por Regenerated Cellulose Membrane, MWCO: 12.000-14.000 D đƣợc mua Aldrich 1.1.3 Thực nghiệm 1.1.3.1 Đánh giá đặc tính nhạy nhiệt copolymer Copolymer ghép đƣợc hoà tan hoàn toàn nƣớc cất (5, 8, 10, 12, 15 20% w/v) để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt Đánh giá khả nhạy nhiệt copolymer ghép phƣơng pháp khảo sát chảy chitosan-pluronic F127 hydrogel nhiệt độ: 4, 25, 30, 37 40 oC Khả nhạy nhiệt chitosan-pluronic F127 hydrogel có thay đổi nhiệt độ đƣợc xác định thông qua phép đo lƣu biến (HAAKE RheoStress 6000) Phƣơng pháp đo biến Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin dạng dao động theo nhiệt độ đƣợc sử dụng cho biết xác nhiệt độ chuyển pha hydrogel 1.1.3.2 Thực nghiệm mang, nhả nanocurcumin hydrogel nhạy nhiệt chitosan-pluronic F127 a) Thực nghiệm mang nanocurcumin hydrogel nhạy nhiệt chitosanpluronic F127 Dung dịch curcumin cồn tuyệt nồng độ 100mM đƣợc nhỏ giọt vào copolymer ( CS:F127 = 1: 15) 15% hỗn hợp dung dịch nƣớc cồn (9:1 v/v) dƣới điều kiện siêu âm với tần số 20kHz, hệ số khuếch đại A = 70 15 phút Sau dung dịch phía đem quay để loại bỏ dung môi đƣợc đông khô để thu mẫu nanocomposite Dung dịch curcumin cồn tuyệt nồng độ 100mM đƣợc nhỏ giọt vào copolymer ( CS:F127 = 1: 15) 15% hỗn hợp dung dịch nƣớc cồn (9:1 v/v) dƣới điều kiện siêu âm với tần số 20kHz, hệ số khuếch đại A = 70 15 phút Sau dung dịch phía đem cô quay để loại bỏ dung môi đƣợc đông khô để thu mẫu nanocomposite [1] Nanocomposite đƣợc hòa tan nƣớc cất lạnh cho thử nghiệm nhƣ đo kích thƣớc hạt nanocurcumin, hiệu nhả chậm curcumin, khả tăng sinh nguyên bào sợi đánh giá hiệu chữa lành vết bỏng (cấp độ 2) Hình thái học Curcumin đƣợc quan sát kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (JEM-1400 JEOL) 25°C Lƣợng nano curcumin mang copolymer đƣợc phân tích gián tiếp thơng qua phổ UVvisible spectroscopy (Agilent 8453 UV-visible spectrophotometer) bƣớc sóng 420 nm Các nano curcumin tinh khiết đƣợc chuẩn bị ethanol tuyệt đối khoảng nồng độ 1-10 mg / ml để thiết lập đƣờng cong chuẩn [2] b) Thực nghiệm nhả nanocurcumin hydrogel nhạy nhiệt chitosanpluronic F127/ nanocurcumin Cur đƣợc nhả từ hidrogel chitosan-pluronic/nanoCur đƣợc xác định máy quang phổ UV Agilent 8453 Hòa tan hidrogel chitosan-pluronic/nano Cur với nồng độ 2mg/ml, cho vào màng thẩm tách MWCO 12.000 D - Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin 14.000 D màng ml Tiến hành thẩm tách đệm PBS (10 ml) Lấy mẫu dung dịch thẩm tách bên màng, lần lấy 1,5 ml giờ, 0.25 giờ, 0.5 giờ, 1-6 Mỗi lần lấy mẫu xong, loại bỏ dung dịch thẩm tách bên màng thêm vào lƣợng đệm PBS tƣơng ứng ban đầu 10 ml, cách xác định lƣợng nCur nhả theo báo cáo Kailas D.Thakker [3] 1.1.3.3 Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng vật liệu lên khả tăng sinh nguyên bào sợi Hydrogel đông khô đƣợc ngâm ml (15%) Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ủ 37°C 24 h Các nguyên bào sợi đƣợc gieo khoảng 3x104 tế bào giếng đĩa 24 giếng đƣợc ủ qua đêm trƣớc đƣợc xử lý với hydrogel nhƣ chuẩn bị trƣớc Sau đó, tế bào đƣợc cố định với dung dịch axit tricloaxetic 50% (w/v) lạnh giờ, rửa sạch, nhuộm với 0,2% (w/v) sulforhodamin B (SRB) 20 phút Sau lần rửa với axit axetic 1% Thuốc nhuộm gắn với protein đƣợc hòa tan 10 mM dung dịch Tris bazơ đƣợc ghi lại đầu đọc microplate bƣớc sóng hấp thụ 620 nm Dựa đƣờng cong chuẩn đƣợc tạo số lƣợng khác ngun bào sợi, tính tốn đƣợc số lƣợng nguyên bào sợi mẫu Thí nghiệm tiến hành với nhóm nghiệm thức: (a) đối chứng; (b) xử lý với CS-F127; (c) xử lý với nCur-CS-F127 Quá trình thực nghiệm đƣợc khảo sát Bộ môn Công nghệ sinh học Y Sinh, Khoa Công nghệ Sinh học Đại học Quốc Tế, Tp.HCM 1.1.3.4 Thực nghiệm đánh giá hiệu chữa lành vết thương Đánh giá hiệu chữa lành vết thƣơng bỏng mơ hình chuột nhắt trắng đƣợc gây bỏng nhân tạo Chuột nhắt trắng (Mus musculus Var albino) có trọng lƣợng 28 – 30g, cung cấp từ Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh, đƣợc ni ổn định tuần Cạo lông chuột vùng lƣng gây mê hốn hợp thuốc mê Ketamine nƣớc (tỷ lệ 1,5:1,5) với liều lƣợng 0.02ml/g trọng lƣợng thể chuột, gây bỏng nhiệt ƣớt (độ 2) kim loại (1cm x 1cm) nung nóng nƣớc Sau 48 gây bỏng, cắt Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin lọc hoại tử vết thƣơng bỏng (nếu có) Tiến hành thí nghiệm với nhóm nghiệm thức: (i) đối chứng (để lành tự nhiên); (ii) phun dung dịch CS-F127 copolymer; (iii) Phun dung dịch nCur-CS-F127; (iv) bôi kem điều trị bỏng độ thƣơng mại (Biafine, Janssen, France) Quá trình thử nghiệm theo dõi tiến trình lành hóa, đánh giá mơ học vết thƣơng bỏng chuột sau 14 ngày khảo sát Bộ môn Sinh lý động vật–Khoa sinh ĐH Khoa học Tự nhiên Tp.HCM Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Bích Trâm Page Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin CHƢƠNG 2: KẾT QUẢ 2.1 ĐẶC TÍNH NHẠY NHIỆT CỦA COPOLYMER GHÉP CHITOSAN- PLURONIC F127 Nhƣ kết (bảng 1), mẫu F1 với tỷ lệ chitosan/pluronic F127 1:1 tạo gel Khi tăng tỷ lệ pluronic F127 hệ copolyme lên, khả tạo gel đƣợc hình thành (hình 6) Hình 1: chuyển hóa sol-gel dung dịch chitosan-pluronic 10oC 37oC Mẫu F7 F8 có gel hình thành tốt nhiệt độ thể ngƣời (37oC), nhiên mẫu F8 với tỷ lệ chitosan/ pluronic 1:20 cho thấy gel hình thành nhiệt độ 25oC Nhƣ vậy, nhiệt độ tạo gel thấp tăng hàm lƣợng pluronic F127 Bên cạnh đó, giảm nhiệt độ, mẫu gel cho thấy thối biến nhiệt Đặc tính đảo ngƣợc trạng thái sol-gel theo nhiệt độ môi trƣờng gel cho thấy tiềm định hƣớng việc nghiên cứu lớp màng polyme sinh học Kết khảo sát chuyển trạng thái sol-gel theo nồng độ nhiệt độ (hình 6) cho thấy mẫu F7 tạo gel nồng độ copolymer thấp (trên 10% wt/v) khoảng nhiệt độ 32-37oC Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin Bảng Khảo sát nhiệt độ tạo gel copolymer ghép khả chuyển đổi từ gel sang dung dịch ngƣợc lại Khả NPCTên Chitosan F127- mẫu Amin (g) chuyển o o o o o o C 25 C 33 C 37 C 40 C 50 C pha solgel (g) F1 0.25 0.25 Không F2 0.25 0.5 - + Có F3 0.25 0.75 + + Có F4 0.25 + + Có F5 0.25 1.25 + ++ + Có F6 0.25 2.5 ++ ++ ++ Có F7 0.25 3.75 ++ +++ +++ Có F8 0.25 + +++ +++ +++ Có ( -: khơng có khả tạo gel; +: tạo gel yếu; ++: tạo gel nhiên gel chƣa đặc lại hoàn tồn; +++: tạo gel tốt, gel đơng đặc khơng chảy đặt nghiêng) Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin Hình 2: Giản đồ pha thể tƣơng quan nhiệt độ (25°C, 30°C, 37°C, 45°C 50°C) nồng độ mẫu copolyme từ F1-F8, hydrogel CP với lƣợng khác (wt/ wt) F127 lƣợng không đổi chitosan (CS) Để có kết luận xác trình chuyển pha chitosan-pluronic F127 hydrogel, phƣơng pháp đo lƣu biến học cách đo thay đổi modul tích G’ modul G’’ theo nhiệt độ dao động từ 4oC đến 45oC với tần số biên độ cố định Nhƣ số liệu thể hình 8, tần số khơng đổi 1Hz, giá trị G’ tăng dần, điều có nghĩa nhiệt độ tăng lên, liên kết hydro mạch chitosan-pluronic F127 bị phá vỡ hệ bị hỗn loạn cấu trúc mạch ngang hệ giá trị G’ tăng dần Mặt khác giá trị G’ tăng dần cho thấy độ cứng vật liệu tăng dần hay nói hệ chitosanpluronic F127 cho phép truyền ứng xuất hiệu trạng thái nghỉ Mặt khác giá trị G’’ khoảng nhiệt độ từ 4oC đến dƣới 30oC có xu hƣớng giảm dần biểu thị cho chảy nhớt độ linh động phân tử giảm dần Nguyên nhân mạch sƣờn chitosan làm giảm lớp hydrat hóa bao quanh phân tử pluronic dung dịch nƣớc, làm phân tán chúng kết độ tan copolymer giảm dần [6] Thêm vào đó, gần nhiệt độ tạo gel, giá trị G’’ tăng lên nhanh chóng, lƣợng hệ thoát nhiều, chảy nhớt Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin độ linh động tăng nên chuỗi kỵ nƣớc pluronic F127 có xu hƣớng quy tụ lại tạo thành mắt xích mạng lƣới liên kết, tạo thành hệ hỗn loạn Tại nhiệt độ gel đƣợc hình thành, lƣợng hệ cao tức giá trị G’’ chạm ngƣỡng tối đa Ở nhiệt độ thấp giá trị G’’ >> G dẫn đến góc 45o < δ < 90o hay giá trị tan δ >> 1, điều có nghĩa vật liệu trạng thái dung dịch đàn hồi nhớt hay trạng thái lỏng Bắt đầu từ 30oC, hai giá trị đồng thời tăng điểm 35oC hai giá trị gần nhƣ (G’= 501.992 Pa G’’= 502.125) Nhƣ điểm gel chitosan-pluronic F127 (nồng độ 15%) đƣợc ghép tỷ lệ 1:15 đƣợc xác định 35oC, điểm thích hợp cho ứng dụng y sinh sau nhiệt độ thể ngƣời bình thƣờng dao động khoảng 37oC Hệ hydrogel phù hợp cho việc phát triển hệ chất mang thuốc chữa lành vết thƣơng ngoại-nội mô Hình 3: Đồ thị biểu diễn thay đổi G’ G’’ dao động nhiệt với tần số biên độ không đổi mẫu F7 nồng độ 15% wt/v 2.2 KẾT QUẢ MANG, NHẢ NANOCURCUMIN CỦA HYDROGEL NHẠY NHIỆT CHITOSAN-PLURONIC F127 nCur đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp ƣớt ethanol tuyệt đối thay sử dụng dichloromethane thông thƣờng Dung dịch Cur ethanol đƣợc thêm giọt vào dung dịch copolymer Chitosan-g-Pluronic (CS: F127 với tỷ lệ 1:15 khối lƣợng) Quá trình thí nghiệm sử dụng siêu âm (tần số 20kHz, hệ số khuếch đại A = 70 15 phút) nhằm mục đích nâng cao hiệu Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin phân bố Cur vào copolymer Chitosan-g-Pluronic [1] Với mục đích điều trị bỏng, báo cáo khảo sát điều chỉnh hàm lƣợng Cur đƣợc mang khoảng 0.5% trọng lƣợng hidrogel, với hàm lƣợng Cur cao 0.75% (wt/wt), Cur ức chế nguyên bào sợi phát tiển, theo báo cáo Kang JY [7] Hình 4: Dạng sol-gel chitosan-F127 chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) Cur sau đƣợc phân bố vào copolymer CP màu vàng suốt, đồng (Hình 2.9) Bên cạnh đó, kính hiển vi điện tử truyền qua (Hình 3.10) phân tích cho thấy hạt nCur phân bố dung dịch hidrogel chitosan-pluronic với kích thƣớc khoảng 8-23 nm cho thấy Cur phân bố tan tốt dung dịch nƣớc Điều đặc biệt khơng có khác biệt nhiệt độ gel thể qua chuyển pha Sol-Gel copolymer CP copolymer CP/nCur nhiệt độ 25°C 35°C (Hình 2.9) Hình 5: Kết TEM hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin Khảo sát khả nhả Cur in vitro từ hidrogel chitosanFluronic/nanoCur môi trƣờng phosphate-buffered saline (PBS) (pH = 7,4) đƣợc thực cách sử dụng phƣơng pháp khuếch tán với màng thẩm tách sinh học MWCO 12.000 D - 14.000 D Lƣợng Cur đƣợc nhả từ hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur đƣợc xác định máy quang phổ UV Agilent 8453 Hình 6: Khả giải phóng nanocurcumin (nCur) từ hidrogel chitosanFluronic/nanoCur (F127: CS = 15: 1) môi trƣờng PBS Kết thử nghiệm in vitro chứng minh khả nhả chậm Cur từ hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur (Hình 2.11) Sau giờ, 56.98 ± 0.001% nCur đƣợc nhả từ hidrogel Từ 2-6 h, nCur đƣợc nhả với tốc độ không đổi Theo số báo cáo, hidrogel chitosan-Fluronic trƣơng phồng mơi trƣờng sinh lý thể Do đó, cho phép khuếch tán thuốc thông qua mạng lƣới hydrogel [8, 9] Vì vậy, trình nhả chậm Cur từ hidrogel chitosan-Fluronic/nanoCur cho thấy tiềm ứng dụng để điều trị tổn thƣơng da nhƣ chữa lành vết thƣơng Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin 2.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA VẬT LIỆU LÊN KHẢ NĂNG TĂNG SINH NGUYÊN BÀO SỢI Kết thực nghiệm cho thấy phát triển tế bào điều kiện ni cấy khác có khác biệt rõ rệt Quan sát mẫu xử lý với nCurCS-F127 có tăng sinh mạnh nguyên bào sợi so sánh với mẫu xử lý với CS-F127 mẫu đối chứng (hình 12) Hình 7: Hình thái tăng sinh nguyên bào sợi với (a) mẫu đối chứng; (b) mẫu xử lý với CS-F127; (c) mẫu xử lý với nCur-CS-F127 Dựa đƣờng cong chuẩn đƣợc tạo số lƣợng khác nguyên bào sợi tạo thời gian 24 giờ, tính tốn đƣợc số lƣợng Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin nguyên bào sợi tăng sinh mẫu đối chứng; mẫu xử lý với CS-F127 mẫu xử lý với nCur-CS-F127 (hình 13) Hình 8: Lƣợng nguyên bào sợi tăng sinh mẫu thử nghiệm khảo sát thời gian 24 Qua kết thử nghiệm kết luận mẫu hydrogel CS-F127 có chứa nanocurcumin hỗ trợ nguyên bào sợi phát triển Theo số báo cáo, nguyên bào sợi tăng sinh, chúng tạo thành phần đệm gian bào làm cho q trình biểu mơ hố cung cấp sợi laminin, decorin, elastin, fibronectin để tế bào biểu mô bám trƣợt giúp tăng nhanh q trình biểu mơ hố che phủ vết thƣơng Chúng sản sinh collagen có vai trị quan trọng q trình sửa chữa vết thƣơng, phục hồi cấu trúc chức mô Đồng thời nguyên bào sợi nguồn cung cấp quan trọng số yếu tố tăng trƣởng (growth factors - GF) kích thích liền vết thƣơng nhƣ TGFβ, PDGF, KGF, … Hơn nữa, nguyên bào sợi chuyển dạng thành myofibroblasts tạo nên co rút liền vết thƣơng nhanh Nguyên bào sợi tham gia vào giai đoạn sửa chữa sẹo diễn nhiều năm sau vết thƣơng liền [10-13] Thử nghiệm cho thấy tìm ứng dụng vật liệu hydrogel nCur-CS-F127 lĩnh vực làm lành vết thƣơng Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin 2.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM CHỮA LÀNH VẾT THƢƠNG (Đánh giá hiệu chữa lành vết thƣơng bỏng độ 2) Kết thử nghiệm chữa lành vết bỏng độ mơ hình chuột cho thấy sau 14 ngày vết bỏng phủ với hydrogel composite chứa nanocurcumine lành gần nhƣ hồn tồn với nhiều lơng mọc mơ tái tạo Trong mẫu thuốc thƣơng mại vết bỏng chữa lành tốt với độ co vết thƣơng 95%.Trong mẫu khơng khơng điều trị vết bỏng chữa lành khoảng 80% (hình 14) Hình 9: Hình ảnh theo dõi trình chữa lành vết bỏng đồ thị đánh giá độ co vết thƣơng Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin Kết đánh giá mô học cho thấy gel không gây dị ứng, không làm ngăn cản trình đáp ứng bình thƣờng thể Gel composite có tác dụng đẩy nhanh q trình tái tạo lành hóa vết thƣơng bỏng với mật độ collagen tái tạo có trật tự, nhiều mạch máu mơ hạt hình thành tƣơng đƣơng kết phân tích mơ học vết bỏng đƣợc xử lý với thuốc thƣơng mại Biafine Tuy nhiên, mẫu mô tái tạo với hydrogel composite cho trật tự hình thành lớp thƣợng bị, hạ bì lớp có trật tự nhƣ mẫu mơ tự nhiên (hình 2.12) Kết nghiên cứu sơ khởi cho thấy tiềm hydrogel sở chitosan mang nanocurcumine chữa lành vết thƣơng Hình 10: Kết nhuộm hóa mơ Hematoxyline&Eosin của: a) Mô thƣờng, b) mô chữa với Biafine c) mô chữa với hydrogel composite Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin CHƢƠNG 3: KẾT LUẬN KẾT LUẬN Copolymer ghép nhạy nhiệt Chitosan- Pluronic F127 đƣợc tổng hợp thành công để làm chất cho tổng hợp nanocomposite hydrogel chứa nanocurcumin kích thƣớc khoảng 8-23 nm Dung dịch copolymer mang nanocurcumine phân tán có điểm chuyển nhiệt trạng thái sol sang gel 34oC, khoảng nhiệt độ lí tƣởng cho thử nghiệm ứng dụng hydrogel chữa lành vết thƣơng da Hệ nanocomposite hydrogel nhả chậm curcumin ổn định theo thời gian Kết thử nghiệm tƣơng hợp sinh học cho thấy hệ nanocomposite hydrogel tăng cƣờng phát triển nguyên bào sợi fibroblast Kết thử nghiệm sơ mơ hình bỏng độ chuột cho thấy nanocomposite hydrogel tăng cƣờng hiệu chữa lành vết bỏng độ Hiện nghiên cứu xa hệ nanocomposite hydrogel đƣợc thực để đánh giá tiềm nanocomposite hydrogel ứng dụng thực tế KIẾN NGHỊ Tiếp tục phát triển đề tài phạm vi cấp sở lên cấp tỉnh với tiêu đánh giá cao nhƣ: Đánh giá hiệu chữa lành vết thƣơng bỏng cấp độ cao (cấp độ 3) thực thử nghiệm lâm sàn để ứng dụng vào thực tế Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin TÀI LIỆU THAM KHẢO W.N Findley and F.A Davis, 2013 Creep and relaxation of nonlinear viscoelastic materials Courier Corporation Z Hu and Y Che, Production of organic compound nanoparticles with high repetition rate ultrafast pulsed laser ablation in liquids 2015, Google Patents K.D Thakker and W.H Chern, 2003, Development and validation of in vitro release tests for semisolid dosage forms-case study Dissolution Technologies 10(2): p 10-16 D.H Nguyen, N.Q Tran, and C.K Nguyen, 2013, Tetronic-grafted chitosan hydrogel as an injectable and biocompatible scaffold for biomedical applications Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 24(14): p 1636-1648 N.Q Tran, Y.K Joung, E Lih, K.M Park, and K.D Park, 2011, RGDconjugated in situ forming hydrogels as cell-adhesive injectable scaffolds Macromolecular research 19(3): p 300-306 H.H Winter and F Chambon, 1986, Analysis of linear viscoelasticity of a crosslinking polymer at the gel point Journal of Rheology (1978present) 30(2): p 367-382 J Kang, H Huang, and F Zhu, 2009, Effect of curcumin on growth and function of fibroblast in human hyperplastic scar Zhongguo Zhong xi yi jie he za zhi Zhongguo Zhongxiyi jiehe zazhi= Chinese journal of integrated traditional and Western medicine/Zhongguo Zhong xi yi jie he xue hui, Zhongguo Zhong yi yan jiu yuan zhu ban 29(12): p 11001103 J Gopal, M Muthu, and S.-C Chun, 2015, One-step, ultrasonicationmobilized, solvent-free extraction/synthesis of nanocurcumin from turmeric RSC advances 5(60): p 48391-48398 J.H Cho, S.-H Kim, K.D Park, M.C Jung, W.I Yang, S.W Han, J.Y Noh, and J.W Lee, 2004, Chondrogenic differentiation of human Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm Chuyên đề loại 2: Tổng hợp nanocurcumin dung dịch polymer nhạy nhiệt đánh giá đặc tính hóa lý hệ hydrogel nhạy nhiệt chứa nanocurcumin mesenchymal stem cells isopropylacrylamide) and using a thermosensitive water-soluble chitosan poly (N- copolymer Biomaterials 25(26): p 5743-5751 10 C.P Kiritsy and S.E Lynch, 1993, Role of growth factors in cutaneous wound healing: a review Critical Reviews in Oral Biology & Medicine 4(5): p 729-760 11 D.A Lauffenburger and A.F Horwitz, 1996, Cell migration: a physically integrated molecular process Cell 84(3): p 359-369 12 C.J Schaffer and L.B Nanney, 1996, Cell biology of wound healing International review of cytology 169: p 151-181 13 I.K Cohen, R.F Die-gelmann, W.J Lindblad, and N.E Hugo, 1992, Wound Healing: Biochemical and Clinical Aspects Plastic and Reconstructive Surgery 90(5): p 926 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Bích Trâm