NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA (PHYLLANTHUS URINARIA L., EUPHORBIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --- NGÔ ĐỨC TRỌNG NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA PHYLLANTHUS URINARIA L., EUPHORBIACEAE THÁ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

NGÔ ĐỨC TRỌNG

NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY

CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA (PHYLLANTHUS URINARIA L.,

EUPHORBIACEAE)

THÁI NGUYÊN - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

NGÔ ĐỨC TRỌNG

NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY

CHÓ ĐẺ RĂNG CƯA (PHYLLANTHUS URINARIA L.,

EUPHORBIACEAE)

Chuyên ngành : Hoá hữu cơ

Mã số : 60.44.27

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

THÁI NGUYÊN - 2008

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS Phạm Văn Thỉnh - Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm Thị Hồng Minh, Th.S Vũ Anh Tuấn, Th.S Hứa Văn Thao những người thầy đã động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn phòng hoạt chất sinh học của trường Đại học Y Thái Nguyên và cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm của Bác sĩ Hoàng Sầm, phòng nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu

Nhân dịp này, tôi cũng xin chân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Hóa, Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2008

Tác giả

Ngô Đức Trọng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

NGÔ ĐỨC TRỌNG

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

SKLM : Sắc kí lớp mỏng

UV : Ultraviolet spectrocopy

MS : Mass Spectroscopy

EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy

LC-MS : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy

FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

1

H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance

13

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

COSY : Correlated Spectroscopy

HSQC : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

HIV : Human Immunodeficiency Virus

đvC : Đơn vị Cacbon

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 2.1: Khối lƣợng chất tổng số đƣợc chiết từng phân đoạn của cây chó đẻ

răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)……… ……….26

Bảng 2.2: Phát hiện các nhóm chất trong cây chó đẻ răng cƣa………27 Bảng 2.3: Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây chó đẻ răng

cƣa (Phyllanthus urinaria L)……… ……… … 29

Bảng 2.4: Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của chất PH-1 trong cây chó

đẻ răng cƣa (Phyllanthus urinaria L)……… ……… ….30

Bảng 2.5: Phổ 1

H-NMR và 13C-NMR của chất PE-3………… ……….32

Bảng 3.1: Số liệu phổ 13

C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của PH-1 trong cây chó đẻ

răng cƣa (Phyllanthus urinaria L) và phổ của -sitosterol [15]….… 40

Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của PE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm

ACD/NMR của 5-hidroxymetylfufural 44

Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của PE-2 và số liệu phổ NMR trong phần mềm

ACD/NMR của axit gallic 48

Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của PE-3 và số liệu phổ trong phần mềm

ACD/NMR của chất kampherol 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L, Euphorbiaceae 3

Hình 2.1: Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phương

phương pháp khuyếch tán trên thạch 28

Hình 3.1: Phổ FT-IR của -sitosterol (PH-1) 36

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của -sitosterol (PH-1) 37

Hình 3.3: Phổ 13C-NMR và ATP của -sitosterol (PH-1) 38

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR-DMSO của PE-1 42

Hình 3.5: Phổ 13C-NMR-DMSO của PE-1 43

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR-DMSO của PE-2 46

Hình 3.7: Phổ 13C-NMR-DMSO của PE-2 47

Hình 3.8: Phổ 1H-NMR-AcetoneD6 của PE-3 50

Hình 3.9: Phổ 13C-NMR-AcetoneD6 của PE-3 51

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu 26

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh mục các chữ viết tắt dùng trong luận văn

Danh mục các bảng

Danh mục các hình và sơ đồ

MỞ ĐẦU .1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN .3

1.1 Mô tả thực vật 3

1.2 Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus 4

1.2.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus 4

1.2.2 Một số tác dụng dược lý của chi Phyllanthus 5

1.3 Tình hình nghiên cứu hoá học thực vật của chi Phyllanthus 6

1.3.1 Một số đại diện của nhóm tecpenoit 6

1.3.2 Một số đại diện của khung axit 8

1.3.3 Một số đại diện của Lignan 9

1.3.4 Một số đại diện của khung flavonoit 11

1.3.5 Một số hợp chất phenolic khác 12

1.3.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit 15

1.4 Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus urinaria L 16

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 23

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 23

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 23

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 23

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 24

2.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 24

2.2.1 Dụng cụ và hoá chất 24

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 25

2.3 Các dịch chiết từ cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) 25

2.3.1 Các dịch chiết 25

2.3.2 Khảo sát định tính các dịch chiết 27

2.3.3 Thử hoạt tính sinh học 27

2.4 Phân lập, tinh chế các chất từ 29

2.4.1 Dịch chiết n-hexan 29

2.4.2 Dịch chiết trong etylaxetat (PE) 31

2.4.2.1 Chất PE-1 31

2.4.2.2 Chất PE-2 31

2.4.2.3 Chất PE-3 32

CHƯƠNG III THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Nguyên tắc chung 34

3.2 Xác định định tính các nhóm chất thiên nhiên 34

3.3 Phân lập và nhận dạng các hợp chất 35

3.3.1 -sitosterol (PH-1) 35

3.3.2 5-Hydroxymetylfufural (PE-1) 41

3.3.3 Axit gallic (PE-2) 45

3.3.4 Kampherol (PE-3) 49

3.4 Thử hoạt tính sinh học 53

KẾT LUẬN 55

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 62

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1

MỞ ĐẦU

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người Từ trước khi có sự ra đời của thuốc tây, nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên đã được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh và rất có hiệu quả Rất nhiều loại bệnh tật đã được chữa khỏi nhờ thảo dược

Ngày nay những hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh Điều đó đã góp phần làm tăng tuổi thọ con người, song nhu cầu sử dụng cây cỏ để làm thuốc cũng ngày càng tăng lên, được khoa học hiện đại soi sáng, vì trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp Mặt khác việc dùng thuốc nam hầu như không gây ra tác dụng phụ

Có nhiều bộ môn khoa học nghiên cứu về cây thuốc ra đời Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc Trên cơ sở các nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao như mong muốn để làm thuốc chữa bệnh

Cây chó đẻ răng cưa là một cây thuốc đã được sử dụng từ lâu trên thế giới cũng như ở Việt Nam Trong Y học dân tộc cây này được nhân dân dùng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh như: đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, bệnh viêm gan,… rất có hiệu quả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

Thực vật chó đẻ răng cưa có nhiều ứng dụng quan trọng nhưng gần đây mới được các nhà khoa học các nước quan tâm chọn làm đối tượng nghiên cứu, còn ở nước ta hiện có rất ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học

và dược lí học của cây chó đẻ răng cưa

Với mục đích nghiên cứu và tìm hiểu thành phần hóa học các hợp chất

có hoạt tính sinh học của cây chó đẻ răng cưa, góp phần làm tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc phong phú và quý giá của Việt Nam

Chúng tôi chọn cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) làm đối tượng

nghiên cứu cho công trình nghiên cứu này Tên đề tài là: “Nghiên cứu hóa

học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L., Euphorbiaceae)”

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1.1 Mô tả thực vật

Cây chó đẻ răng cưa còn gọi là diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, cam kiềm, rút đất, khao ham (Tày), prakphle (Campuchia)

Tên khoa học là: Phyllanthus urinaria L, thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae)

Phân bố địa lý: Cây chó đẻ răng cưa phân bố rộng khắp ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới

Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa thường thấy mọc tự nhiên ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước, điển hình như: Thái Nguyên, Bắc Ninh, Nghệ

An, Hà Giang,… Trên thế giới loại cây này mọc nhiều ở các nước Châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Philippin, Inđonexia, Myanma, Thái Lan,… Châu Mĩ như: Brazil, Argentina,…[5]

Hình 1.1: Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L, Euphorbiaceae)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

4

Đặc điểm sinh trưởng và phát triển:

Cây chó đẻ răng cưa là một loại cỏ mọc hàng năm, cao chừng 30 cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành, thường có màu đỏ hơi tía

Cây có vị hơi ngọt Lá mọc so le lưỡng hệ hay có cuống rất ngắn Hoa mọc ở kẽ lá, đơn tính, màu đỏ nâu Hoa đực và hoa cái cùng gốc Hoa đực ở đầu cành, hoa cái ở cuối cành Hoa không có cuống hoặc có cuống rất ngắn Quả nang không cuống hình cầu hơi dẹt Đường kính quả có thể đạt tới 2mm Hạt ba cạnh hình trứng màu nâu nhạt có vân ngang [5]

1.2 Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus

1.2.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus

Các loài cây thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) được sử dụng

rộng rãi trong y học dân tộc của nhiều nước để chữa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh viêm gan B…[7] Các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là

3 loài Phyllanthus urinaria L, Phyllanthus niruri L và Phyllanthus amarus

Schum et Thonn [4]

Một số bài thuốc dùng cây chó đẻ đắng (Phyllanthus amarus Schum et

Thonn) [6]:

Chữa viêm gan do virus: Chó đẻ đắng sao khô 20g, sắc nước 3 lần

Trộn chung các nước sắc Thêm 50g đường, đun sôi cho tan đường Chia làm

4 lần uống trong ngày Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc

Chữa xơ gan cổ trướng thể năng: Chó đẻ đắng sao khô 100g sắc nước 3

lần Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30-40 ngày Khẩu phần

ăn hàng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ)

Riêng cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) trong y học dân

tộc được nhân dân dùng để chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm

da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, chữa bệnh gan, sốt, rắn rết cắn rất có hiệu quả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

Một số bài thuốc dùng cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L)

[5], [6]:

Nhân dân ta thường dùng toàn cây hái về làm thuốc, mùa thu hái quanh năm nhưng tốt nhất là vào mùa hạ Thường dùng tươi có khi phơi khô, ngày uống 20-40g cây tươi, sao khô, sắc đặc, uống thay nước

Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Chó đẻ răng cưa sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g Sắc nước uống hàng ngày

Đối với bệnh ngoài da: Cây tươi dã nát với một ít muối đắp ngoài da với liều lượng không hạn chế

1.2.2 Một số tác dụng dƣợc lý của chi Phyllanthus

Năm 1961, phòng Đông Y Viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng sinh của cây chó đẻ răng cưa thấy kết quả tác dụng kháng sinh

như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Typhi (0,9 cm), Flexneri (1,1cm), Sonnei (0 cm), Shiga (1cm), Subtilis (0,4 cm), Coli (0 cm)

Năm 1977, một nhóm bác sĩ Việt Nam, khoa Tiêu hoá, Gan, Mật đã sử dụng bài thuốc gia truyền của Lương y Trần Xuân Thiện gồm 3 vị là chó đẻ đắng, xuyên tâm liên, quả dành dành để điều trị cho những người có kết quả xét nghiệm HBsAg (+) Sau một thời gian điều trị, kết quả xét nghiệm âm tính được coi là khỏi Tỷ lệ đạt 26/98 bệnh nhân Ngoài ra, thuốc còn giúp cơ thể người dùng sản xuất kháng thể chống HBsAg (59/98 người) Liều điều trị trung bình 4-5 tháng [6]

Năm 1988 các tác giả Blunberg và Thiogarajan công bố đã điều trị 37

bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng chó đẻ răng cưa Phyllanthus amarus và

Phyllanthus niruri đạt kết quả âm tính 22/37 bệnh nhân sau 30 ngày Các tác

giả còn chứng minh Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men

pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B [5]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

6

Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng tại Bệnh viện Thanh Nhàn (Hà Nội), đã sử dụng chế phẩm LIV/94 (chó đẻ răng cưa là một trong 3 thành phần chính của thuốc) điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính trong 2 năm (2001-2002) đạt kết quả tốt Thuốc

có tác dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân [6]

Những công trình nghiên cứu hóa học gần đây về các loài Phyllanthus

đã phát hiện một vài lignan, flavonoit và tanin thủy phân có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HBsAg, ức chế mạnh HIV transcriptase ngược [21]

Các thí nghiệm in vitro của cây chó đẻ với kháng nguyên HBsAg và với tổn thương gan do cacbontetraclorit gây nên đã chứng minh cây chó đẻ có khả chống virus viêm gan B Cây chó đẻ răng cưa có tác dụng kháng khuẩn

đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Coli, Shigella

dysenteriae, S flexneri, S shigae, Moraxella và kháng nấm đối với Aspergillus fumigatus [1]

1.3 Tình hình nghiên cứu hoá học thực vật của chi Phyllanthus

Cho đến nay người ta đã phát hiện chi Phyllanthus L họ thầu dầu

(Euphorbiaceae) có 700 loài, gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây

gỗ nhỏ Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [11] Ở

Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus

urinaria L (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus niruri L (chó đẻ thân xanh) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (chó đẻ đắng hay diệp hạ châu đắng)

1.3.1 Một số đại diện của nhóm tecpenoit

Từ loài Phyllanthus flexuosus đã phân lập được 5 tritecpen mới, cấu

trúc được chỉ ra là: olean-12-en-3β,15α-diol; lup-20 (29)-en-3β,24-diol; 3β,24-diol; oleana-11:13(18)-dien-3β,24-diol và olean-12-en-3β,15α,24-triol và hai chất đã biết là: tritecpen diol betulin [33]; lup-20(29)-en-3β,15α-diol [41]