KT XÉT NGHIỆM CƠ BẢN PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI

KT XÉT NGHIỆM CƠ BẢN PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI Điện di: chuyển động phân tử huyền phù keo dạng ion tác dụng điện trường Các phương pháp điện di: - Điện di dung dịch tự - Điện di chất giá (điện di vùng) - Điện di mao quản PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI - Áp dụng điện di DNA, RNA, Protein - Các chất giá thường dùng: -Giấy - Thạch agar-agar -Agarose -Gel tinh bột - Acetat cellulose - Polyacrylamid PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI Agarose: polysaccharide tự nhiên phân lập từ tảo biển, có kích thước lổ gel lớn, thích hợp cho phân tách phân tử có kích thước lớn điện di dựa độ tích điện Dùng để phân tách protein > 500 kDa DNA có kích thước > 2000 bp (base pair) Các loại agarose khác dựa đặc tính lý hóa nhiệt độ đông đặc, độ dai, kích thước lổ gel, độ điện thẩm PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI Polyacrylamide: hình thành trình đồng trùng hợp acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) cross linker, thông thường N,N’ methylenebisacrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2) - pH ổn định - Trơ - Trong suốt - Có thể hình thành nhiều gel có kích thước lổ gel khác Ứng dụng kỹ thuật điện di ➢ Phân tách acid amin, protein, DNA dung dịch chất cần phân tách ➢ Trong Y học: ✓Điện di phân tách Pro huyết thanh: dùng chất giá giấy, acetate cellulose, agar – agar ✓Điện di phân tách hemoglobin: dùng chất giá giấy, gel tinh bột ✓Điện di phân tách isoenzym huyết thanh: dùng chất giá agarose, acetat cellulose, gel polyacrylamid NGUYÊN TẮC CHUNG CỦA PP ĐIỆN DI PROTEIN Trong dd đệm có pH khác với pHi Pro, ph tử Pro tích điện chuyển dịch điện cực trái dấu có dòng điện chiều chạy qua dd NGUYÊN TẮC CHUNG CỦA PP ĐIỆN DI PROTEIN Điện tích tiểu phân Pro lớn pH môi trường khác xa với pHi Pro Trong môi trường dd đệm pH=8.6 hầu hết Pro huyết tích điện âm di chuyển điện cực dương Các Pro khác di chuyển với tốc độ khác NGUYÊN TẮC CHUNG CỦA PP ĐIỆN DI PROTEIN Tốc độ di chuyển Pro điện trường: V = E.Q/f • V: tốc độ di chuyển • E: Cường độ điện trường • Q: Điện tích protein • f: Hệ số ma sát, tùy thuộc vào khối lượng hình dạng protein độ nhớt môi trường Các yếu tố ảnh hưởng đến trình điện di CÁC TiỂU PHÂN PROTEIN + Trọng lượng phân tử cấu hình tiểu phân: • TLPT nhỏ: di chuyển nhanh • Hình cầu (Alb) di chuyển nhanh bầu dục (Glo) nhanh hình sợi (Fib) + Trạng thái hydrat hóa (phân tử Pro bao quanh phân tử nước): Khả hydrat hóa cao di chuyển nhanh + Thế điện động (giữa đ.tích Pro lớp đ.tích bề mặt tạo nên điện động): Thế điện 10 động tăng tốc độ di chuyển tăng Các yếu tố ảnh hưởng đến trình điện di DUNG DỊCH ĐỆM: giúp trì pH dung dịch suốt trình điện di * pH dd đệm: yếu tố quan trọng + pH xa pHi Pro tính linh động Pro tăng + pH < pH > 10: Pro bị biến tính khơng di chuyển * Lực ion dd đệm: lực ion tăng tính linh động Pro giảm ngược lại * Bản chất ion: pH chất ion khác kết điện di khác 11 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình điện di ĐiỆN THẾ: ▪ Điện lớn tốc độ di chuyển Pro cao ▪ Điện cao→ bay nước nhiều ảnh hưởng tốc độ diện di ▪ Thông thường 120 – 400V, chất giá polyacrylamid lên tới 1200V NHIỆT ĐỘ: Nh độ tăng nước bốc nhiều, điều kiện điện di bị thay đổi liên tục → làm mát, đặt tủ lạnh LOẠI CHẤT GIÁ: ảnh hưởng đến khả phân tách Pro Giấy, agar-agar, acetate cellulose: kém, 12 gel tinh bột, agarose, polyacrylamide: tốt Điện di protein huyết giấy Sơ đồ chậu điện di 13 Điện di protein huyết giấy 14 Điện di protein huyết giấy Kết quả: - Điện di Pro huyết giấy tách 5-6 thành phần: từ cực dương đến cực âm albumin, globulin 1, 2, 1, 2  - Có thể tính kết máy đo màu băng điện di Tính kết cách chiết rút màu Băng điện di cắt thành mẫu nhỏ tương ứng với vệt Pro 15 Điện di protein huyết pp SDS - Polyacrylamide 16 Điện di protein huyết pp SDS - Polyacrylamide 17 Điện di protein huyết pp SDS - Polyacrylamide Nguyên tắc - SDS (Sodium Dodecyl Sulfate): chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm lớn Để làm biến tính âm hóa Pro - Thêm chất MercaptoEthanol để phá vỡ cầu nối –S-S- Pro => Pro thành dạng thẳng → di chuyển Gel phụ thuộc vào kích thước - Sử dụng kèm băng Pro chuẩn chứa hỗn hợp Pro có kích thước khác 18 Điện di protein huyết pp SDS - Polyacrylamide Nguyên tắc 19 Điện di protein huyết pp SDS - Polyacrylamide 20 MÁY ĐIỆN DI BÁN TỰ ĐỘNG • Model : QuickGel Chamber • Hệ thống điện di thu gọn dễ sử dụng thiết lập đặc biệt cho QuickGel • Các xét nghiệm điện di máy : Điện di protein, điện di miễn dịch ImmunoFix , Hemoglobin ( Acid, Alkaline Hgb ), CK& LD Isoenzyme 21 Máy điện di tự động Hydrasys, Hyris (hãng SEABIA) thuộc dòng hệ đại • máy điện di máy giúp phát thành phần điện di protein máu nước tiểu, phân tích tổn thương cụ thể xét nghiệm Iso - enzym, điện di miễn dịch, điện di huyết sắc tố để phát bệnh Thalassemia Thalassemia (bệnh huyết tán di truyền vốn gặp nhiều VN khu vực miền Trung - Tây ngun) • Tất q trình thực tự động hoàn toàn máy, hạn chế rủi ro hay kết thiếu xác thực hành máy bán tự động thủ công 22 MÁY ĐIỆN DI TỰ ĐỘNG • Model SPIFE 3000 • Điện di protein , Cholesterol (HDL , LDL , VLDL, Lp(a) ) Điện di miễn dịch ImmunoFix , Hemoglobin ( Acid, Alkaline Hgb ), CK Isoenzyme , LD Isoenzyme , Điện di miễn dịch IgG * 300 xét nghiệm /giờ/Protein ( gel 100 test ) * 100 xét nghiệm /80 phút ( điện di Cholesterol ) * 80 xét nghiệm / 40 phút ( Lipoprotein ) * 20 xét nghiệm / 55 phút.( Hemoglobin ) 23