Tuyển chọn vi khuẩn azotobacter có khả năng cố định nitơ, phân giải phosphate khó tan và sinh tổng hợp IAA

LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp vô biết ơn quan tâm, giúp đỡ nhiều cá nhân, tập thể Nhân dịp hồn thành khố luận tốt nghiệp, xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để đƣợc nghiên cứu Viện Tôi xin chân thành cám ơn thầy cô cán công nhân viên mơn Cơng nghệ Hố sinh – Vi sinh; Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Thu Hằng tận tình giúp đỡ hƣớng dẫn tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khố luận tốt nghiệp Mặc dù tơi có cố gắng nỗ lực nhiều xong kiến thức cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi sai sót mong nhận đƣợc đóng góp quý báu thầy để chun đề đƣợc hồn thiện Chúng xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng i năm 2018 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn cố định nitơ 1.1.1 Nitơ trình cố định nitơ 1.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ 1.2 Tổng quan vi khuẩn Azotobacter 10 1.2.1 Một số đặc điểm sinh học vi khuẩn Azotobacter 10 1.2.2 Đặc tính sinh lý, sinh hóa 11 1.2.3 Ảnh hƣởng nhân tố sinh thái đến sinh trƣởng phát triển vi khuẩn Azotobacter 11 1.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định nitơ ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh 13 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Vật liệu nghiên cứu 17 2.4 Các môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 18 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.5.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu 19 2.5.2 Phƣơng pháp pha loãng mẫu phân lập chủng vi sinh vật 19 2.5.3 Phƣơng pháp nhuộm Gram 20 ii 2.5.4 Tuyển chọn chủng Azotobacter có khả cố định nitơ 21 2.5.5 Xác định khả tổng hợp IAA chủng Azotobacter 23 2.5.6 Xác định khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter 24 2.5.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết phân lập chủng Azotobacter có khả cố định nitơ 26 3.2 Tuyển chọn chủng Azotobacter 30 3.2.1 Tuyển chọn chủng Azotobacter có khả cố định nittơ cao 30 3.2.2 Xác định khả sinh tổng hợp IAA 32 3.2.3 Xác định khả phân giải phosphate khó tan 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT Ký hiệu chữ viết tắt Viết đầy đủ A Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate BNF Biological nitrogen fixation CMC Carboxyl methyl cellulose CNSH Công nghệ sinh học FAD Flavin adenine dinucleotide Fd Feredocine G Gram Kg Killogram L Lít Mg Milligram Ml Milliliter Mm Millimeter OD Optical density N Nitơ PHB Polyhydroxybutyrate VSV Vi sinh vật µg Microgram µm Micrometres iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Bảng nồng độ amonium xây dựng đồ thị chuẩn 22 Bảng 2.2 Xây dựng đồ thị chuẩn IAA 24 Bảng 3.1 Một số đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn Azotobacter phân lập 26 Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 29 Bảng 3.3 Kết xác định khả cố định nitơ chủng Azotobacter .31 Bảng 3.4 Kết xác định khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter 33 Bảng 3.5 Kết xác định khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter 34 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ q trình chuyền điện tử có tham gia tích cực feredocine (Fd) để cố định nitơ Hình 1.2 Sơ đồ thể mối quan hệ thực vật vi khuẩn trình cố định nitơ cộng sinh Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc số chủng vi khuẩn Azotobacter môi trƣờng Ashby 28 Hình 3.2 Hình dạng tế bào số chủng vi khuẩn Azotobacter quan sát dƣới kính hiển vi quang học (a) chủng A2; (b) chủng A5; (c) chủng A4 28 Hình 3.3 Khả phân giải CaCO3 số chủng Azotobacter 30 Hình 3.4 Phản ứng màu dịch nuôi cấy chủng Azotobacter với thuốc thử Nessler 32 Hình 3.5 Phản ứng màu dịch nuôi cấy chủng Azotobacter với thuốc thử Salkowski 33 Hình 3.6 Khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter tuyển chọn 35 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Giữa đất, vi sinh vật trồng có mối quan hệ tác động qua lại lẫn Quá trình hình thành đất độ phì đất chịu ảnh hƣởng yếu tố vật lí, hóa học vi sinh vật Vi sinh vật tổng hợp giải phóng vào đất chất hữu cần thiết tạo độ phì cho đất, ngƣợc lại đất mơi trƣờng sống cần thiết cho vi sinh vật, đất vi sinh vật tác động lớn đến trồng, đặc biệt cung cấp nguồn dinh dƣỡng, nguồn dinh dƣỡng quan trọng cho trồng nguồn nitơ Theo thống kê Bộ Nông Nghiệp Hoa Kỳ năm 2011, hecta trồng lấy khỏi đất khoảng 30 kg nitơ Trong lƣợng phân nitơ hóa học bù đắp đƣợc phần lƣợng nitơ mà lấy khỏi đất Lạm dụng mức việc sử dụng phân hóa học làm đất xấu đi, cân đối chất dinh dƣỡng làm giảm hệ vi sinh vật có ích Một giải pháp đƣợc áp dụng để cải tạo đất sử dụng phân bón vi sinh vật Nhóm vi sinh vật phân có tác dụng cải thiện độ phì, cân dinh dƣỡng đất, cải thiện tính chất lý, hóa đất đặc biệt hạn chế ô nhiễm môi trƣờng nhƣ ô nhiễm mơi trƣờng nƣớc q trình rửa trơi Azotobacter sp loại vi khuẩn hiếu khí, sống tự đất, chúng có khả cố định đạm cao khơng phụ thuộc vào chủ Ngồi đặc điểm số chủng thuộc chi cịn có khả sinh tổng hợp nên IAA (chất kích thích sinh trƣởng thực vật) Chính nhờ đặc điểm quan trọng vi khuẩn Azotobacter sp đƣợc ứng dụng rộng rãi chế phẩm phân bón vi sinh vật làm tăng suất trồng Để sản xuất phân bón vi sinh vật tốt, phải có chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao, đa chức năng, khả thích ứng rộng Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn, xác định hoạt tính chủng vi sinh vật việc làm thiếu quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật Xuất phát từ thực tế đó, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ, phân giải phosphate khó tan sinh tổng hợp IAA” CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn cố định nitơ 1.1.1 Nitơ trình cố định nitơ Nitơ (N) phân tử đƣợc cấu tạo từ nguyên tử nitơ liên kết với liên kết III bền vững N ≡ N Nitơ khí tồn dƣới dạng khí N2 chiếm khoảng 79% thể tích khơng khí Mặc dù sống “đại dƣơng nitơ” nhƣng thực vật nói chung khơng có khả đồng hóa trực tiếp đƣợc, N2 phân tử khó phản ứng với phân tử khác để tạo thành hợp chất Liên kết N ≡ N có lƣợng liên kết lớn nên muốn xảy phản ứng N với nguyên tố khác thành hợp chất vô phải dùng lƣợng lƣợng cao Trong nhóm vi khuẩn cố định nitơ biến khí nitơ thành hợp chất đạm điều kiện bình thƣờng [5] Hình 1.1 Sơ đồ q trình chuyền điện tử có tham gia tích cực feredocine (Fd) để cố định nitơ Sự cố định N2 vi khuẩn nốt sần xảy theo sơ đồ phức tạp Trong nốt sần họ Đậu có chất có chất giống với hemoglobin máu gọi leghemoglobin - chất dễ liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin Leghemoglobin đƣợc tạo nên vi khuẩn sống cộng sinh với đậu, nuôi cấy tinh khiết Rhizobium không tạo leghemoglobin không cố định đƣợc N2 [5] Mối quan hệ thực vật vi khuẩn trình cố định nitơ cộng sinh biểu diễn theo sơ đồ: Hình 1.2 Sơ đồ thể mối quan hệ thực vật vi khuẩn trình cố định nitơ cộng sinh 1.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ Vi sinh vật cố định nitơ có vai trị quan trọng chu trình tuần hồn N2 cung cấp lƣợng nitơ đáng kể cho trồng Theo tính tốn nhà khoa học, nhóm vi sinh vật cố định đạm (BNF- biological nitrogen fixation) tự nhiên cung cấp tới 240 x 106 N/năm hành tinh, gấp lần lƣợng nitơ mà giới sản xuất đƣờng hóa học [22] Vi sinh vật cố định nitơ nhóm vi sinh vật có khả chuyển hóa khí N2 dồi khơng khí (79%) thành nitơ dạng ammone (NH4+) cung cấp cho Vi khuẩn cố định nitơ gồm có nhóm lớn [8, 10]:  Vi khuẩn cố định nitơ tự gồm: - Vi khuẩn cố định nitơ tự hiếu khí: Azotobacter Beijerinskia sp - Vi khuẩn cố định nitơ kỵ khí: vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium  Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh nhƣ vi khuẩn Rhizobium cộng sinh với rễ họ đậu, vi khuẩn Azoarcus cộng sinh với rễ lúa 1.1.2.1 Vi khuẩn cố định nitơ tự  Vi khuẩn cố định nitơ tự hiếu khí: Nhóm gồm chi Beijerinskia sp Azotobacter sp - Beijerinskia sp Đƣợc phân lập Starkey (1939), tế bào có hình dạng thay đổi nhƣ hình cầu, hình que, hình bầu dục Beijerinskia vi khuẩn gram âm, khơng sinh bào tử Có khả sống tốt môi trƣờng axit (pH = 3) Vi khuẩn có khả cố định đƣợc 16 - 20 mg nitơ đồng hóa hết g dinh dƣỡng carbon Ngồi khả cố định nitơ chúng cịn có khả tổng hợp chất kích thích sinh trƣởng cho trồng [2, 10] - Azotobacter sp Là vi khuẩn gram âm, khơng sinh bào tử, có khả cố định nitơ tự Khi chƣa trƣởng thành tế bào thƣờng có hình que, sinh sản cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao Khi trƣởng thành khả di chuyển, kích thƣớc thu nhỏ thành dạng cầu đƣợc bao bọc lớp nhầy [2, 10] Khuẩn lạc Azotobacter có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có nhăn nheo Các chủng phân lập từ tự nhiên có khả cố định 10 - 15 mg nitơ tiêu thụ hết g dinh dƣỡng carbon Một số chủng có khả cố định tới 30 mg/1g dinh dƣỡng carbon [2, 10] Trong đất, Azotobacter tập trung vùng đất xung quanh rễ Ngoài khả cung cấp dinh dƣỡng nitơ cho cịn có khả kích thích nảy mầm, kích thích sinh trƣởng Trong đất, Azotobacter thƣờng phổ biến [2, 3, 10]: Azotobacter chroococcum: Kích thƣớc tế bào 2,0 x 3,1 µm, có khả di động cịn non Khi già hình thành nang xác Khuẩn lạc có màu nâu đen già, không khuếch tán môi trƣờng Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc số chủng vi khuẩn Azotobacter mơi trƣờng Ashby Hình 3.2 Hình dạng tế bào số chủng vi khuẩn Azotobacter quan sát dƣới kính hiển vi quang học (a) chủng A2; (b) chủng A5; (c) chủng A4 Khả phân giải CaCO3, khả đồng hóa loại đƣờng khác nhƣ: glucose, sucrose, maltose, mannitol chủng vi khuẩn phân lập, kết đƣợc trình bày Bảng 3.2 Hình 3.3 28 Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập STT Ký hiệu Khả chủng vi phân giải khuẩn CaCO3 A1 + Khả đồng hóa nguồn carbon glucose sucrose maltose mannitol Kiểu hơ hấp + + + + Hiếu khí A2 - + + + + Hiếu khí A3 + + + + + Hiếu khí A4 + + + + + Hiếu khí A5 + + + + + Hiếu khí A6 - + + + + Hiếu khí A7 - + + + + Hiếu khí A1* + + + + + Hiếu khí A2* - + + + + Hiếu khí 10 A3* + + + + + Hiếu khí 11 A4* + + + + + Hiếu khí 12 AT7 - + + + + Hiếu khí Chú thích: (-) khơng có khả đồng hóa / phân giải (+) có khả đồng hóa / phân giải 29 Hình 3.3 Khả phân giải CaCO3 số chủng Azotobacter Kết trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.2 cho thấy 12 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc có đặc điểm khuẩn lạc, hình dạng tế bào số đặc điểm sinh lý, sinh hóa (kiểu hơ hấp hiếu khí, có khả phân giải CaCO3, khả đồng hóa loại đƣờng nhƣ glucose, sucrose, maltose, mannitol) giống với đặc điểm đặc trƣng lồi Azotobacter mơ tả khóa phân loại vi khuẩn Bergey (1989) Hơn nữa, 12 chủng vi khuẩn sinh trƣởng, phát triển tốt sau 48 nuôi cấy môi trƣờng đặc hiệu dành cho Azotobacter mơi trƣờng Ashby, có khả đồng hố đƣờng glucose, sucrose, maltose, mannitol, đặc biệt đƣờng mannitol Do vậy, 12 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc có khả thuộc chi Azotobacter chắn có khả cố định nitơ tự khơng khí 3.2 Tuyển chọn chủng Azotobacter 3.2.1 Tuyển chọn chủng Azotobacter có khả cố định nittơ cao Tiến hành nuôi cấy chủng Azotobacter môi trƣờng Ashby Sau 48 tiến hành ly tâm thu dịch trong, thực phản ứng định lƣợng NH 4+ với thuốc thử Nessler đo OD420nm Từ giá trị OD đo đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn amonium, xác định đƣợc hàm lƣợng NH4+ môi trƣờng Kết xác định khả cố định nitơ chủng Azotobacter đƣợc trình bày Bảng 3.3 30 Bảng 3.3 Kết xác định khả cố định nitơ chủng Azotobacter Ký hiệu chủng Trị số Hàm lƣợng NH4+ vi khuẩn OD420nm (mg/l) ĐC 0 A1 0,418 3,00 ± 0,05 A2 0,721 5,35 ± 0,03 A3 0,332 2,33 ± 0,04 A4 0,202 1,33 ± 0,03 A5 0,778 5,79 ± 0,01 A6 0,216 1,44 ± 0,01 A7 0,435 3,13 ± 0,06 A1* 0,357 2,53 ± 0,03 10 A2* 0,324 2,27 ± 0,04 11 A3* 0,416 2,98 ± 0,03 12 A4* 0,885 6,61 ± 0,02 13 AT7 0,675 4,99 ± 0,004 STT Kết nhận đƣợc Bảng 3.3 cho thấy 12 chủng Azotobacter có khả cố định nitơ Tuy nhiên, hàm lƣợng nitơ đƣợc cố định dịch nuôi cấy chủng Azotobacter khác khác Trong đó, có chủng có khả cố định nitơ, sinh NH4+ với hàm lƣợng mg/l chủng A2, A5, A4* so sánh công trình nghiên cứu phân lập vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ Nguyễn Thị Thu Hằng (2015), 31 chủng vi khuẩn có khả cố định nitơ cao 3,24 mg/l Trong đó, chủng A4* có khả cố định nitơ mạnh (6,61 mg/l); tiếp lần lƣợt chủng A5 (5,79 mg/l), A2 (5,35 mg/l) Để thu đƣợc hàm lƣợng nitơ cao đòi hỏi chủng có hệ nitrogenase có hoạt tính cao Mỗi chủng vi khuẩn tạo loại nitrogenase có hoạt tính cố định nitơ khác nhau, chủng có hoạt lực nitrogenase cao yếu tố giúp chúng cố định nitơ tốt môi trƣờng khơng chứa nitơ Hình 3.4 Phản ứng màu dịch nuôi cấy chủng Azotobacter với thuốc thử Nessler 3.2.2 Xác định khả sinh tổng hợp IAA Tiến hành nuôi cấy chủng Azotobacter môi trƣờng dịch chiết khoai tây (Tarand, 1984) Sau 48 tiến hành ly tâm thu dịch trong, thực phản ứng định lƣợng IAA với thuốc thử Salkowski đo OD530nm Từ giá trị OD đo đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn IAA, xác định đƣợc hàm lƣợng IAA môi trƣờng Kết xác định khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter đƣợc trình bày Bảng 3.4 32 Bảng 3.4 Kết xác định khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter STT 10 11 12 Ký hiệu chủng vi khuẩn A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A1* A2* A3* A4* AT7 Trị số OD530nm 0,097 0,208 0,086 0,023 0,247 0,028 0,109 0,023 0,102 0,072 0,275 0,165 Hàm lƣợng IAA (µg/ml) 7,96 ± 0,03 18,33 ± 0,04 6,93 ± 0,05 1,04 ± 0,03 21,98 ± 0,01 1,51 ± 0,02 9,08 ± 0,04 1,04 ± 0,03 8,43 ± 0,02 5,62 ± 0,04 24,59 ± 0,01 14,31 ± 0,02 Kết nhận đƣợc Bảng 3.4 cho thấy chủng Azotobacter có khả sinh tổng hợp IAA, nhiên khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter khác Trong đó, có chủng có khả sinh tổng hợp IAA với hàm lƣợng IAA 18 µg/ml, so sánh cơng trình nghiên cứu phân lập vi khuẩn Azotobacter sinh tổng hợp IAA Nguyễn Thị Thu Hằng (2015), chủng vi khuẩn Azotobacter sinh tổng hợp IAA với nồng độ cao đạt 11,52 (µg/ml), đó, khả sinh tổng hợp IAA chủng A2, A5, A4* cao hẳn lần lƣợt 18,33; 21,98; 24,59 (µg/ml) Hình 3.5 Phản ứng màu dịch nuôi cấy chủng Azotobacter với thuốc thử Salkowski 33 3.2.3 Xác định khả phân giải phosphate khó tan Đã có nhiều cơng bố khoa học giới chứng minh vi khuẩn Azotobacter khả cố định nitơ, sinh IAA, chúng cịn phân giải phosphate khó tan thành phosphate dễ tan Nên nhiều loại phân bón sinh học cố định nitơ cịn có tác dụng tăng cƣờng hiệu việc bón phân lân vơ cho trồng Do vậy, đề tài khảo sát khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter phân lập Kết xác định khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter đƣợc trình bày Bảng 3.5 đồ thị hóa Hình 3.6 Bảng 3.5 Kết xác định khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter STT Ký hiệu Khả phân giải phosphate khó tan chủng D - Đƣờng kính d - Đƣờng kính Hoạt tính phân vi vịng phân giải khuẩn lạc giải phosphate khó khuẩn chất (mm) (mm) tan (D/d) A1 18 ± 0,02 A2 15 3,75 ± 0,01 A3 13 2,2 ±0,03 A4* 20 4,0 ± 0,02 A5 21 5,25 ± 0,04 A6 12 2,4 ± 0,03 A7 11 2,2 ± 0,03 A1* 15 2,5 ± 0,04 A2* 15 2,14 ± 0,02 10 A3* 14 ± 0,02 11 A4* 19 3,8 ± 0,03 12 AT7 12 ± 0,02 34 Kết nhận đƣợc Bảng 3.5 Hình 3.6 cho thấy có 12/12 chủng Azotobacter có khả phân giải phosphate khó tan, khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter khác Trong đó, có chủng có khả phân giải phosphate khó tan với vòng phân giải lớn lần lƣợt A2 < A4* < A5 Chủng A5 có khả phân giải phosphate khó tan mạnh (D/d = 5,25); tiếp lần lƣợt chủng A4* (D/d = 4), A2 (D/d = 3,75) Hình 3.6 Khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter tuyển chọn 35 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã phân lập đƣợc 12 chủng Azotobacter có khả cố định nitơ - Đã xác định đƣợc đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, số đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng Azotobacter phân lập - Đã tuyển chọn đƣợc chủng Azotobacter có khả cố định nitơ cao, sinh IAA phân giải phosphate khó tan, với lực chủng:  Azotobacter A2 có khả cố định nitơ với nồng độ NH4+ 5,3 (mg/l); sinh tổng hợp IAA 18,3 (µg/ml); hoạt tính phân giải phosphate khó tan (D/d) - 3,7  Azotobacter A có khả cố định nitơ với nồng độ NH4+ 5,79 (mg/l); sinh tổng hợp IAA 21,9 (µg/ml); hoạt tính phân giải phosphate khó tan (D/d) - 5,25  Azotobacter A4* có khả cố định nitơ với nồng độ NH4+ 6,61 (mg/l); sinh tổng hợp IAA 24,59 (µg/ml); hoạt tính phân giải phosphate khó tan (D/d) - 4,0 4.2 Kiến nghị Do thời gian không cho phép nên chưa thực số nội dung nghiên cứu chủng tuyển chọn Nếu tiếp tục nghiên cứu thời gian cho phép, thực hiện: Định danh tên loài cho chủng kỹ thuật sinh học phân tử 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Lân Dũng (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, 2, 3, NXB Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB giáo dục Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, Vũ Thị Minh Đức (2001), Phân lập, tuyển chọn chủng Azotobacter cho sản xuất phân bón vi sinh vật, Hội thảo Quốc tế sinh học, Tập 2, trang 144 - 148 Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Thuỷ (2015), Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA, tạp chí Khoa học Cơng nghệ Lâm nghiệp, số – 2015 Lê Gia Huy, Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng, NXB giáo dục Nguyễn Minh Hƣng cộng (2007), Phân bón vi sinh vật, NXB Nơng nghiệp Phạm Xuân Lân (2007), Nghiên cứu ảnh hưởng số loại phân hữu vi sinh tới suất, hàm lượng NO3 rau cải bắp hóa tính đất trồng rau thị xã Hà Giang, Đại học Nông Lâm Nguyễn Đức Lƣợng (2006), Công nghệ vi sinh vật, Tập 1, NXB Đại học quốc gia Vũ Triệu Mẫn, Lê Lƣơng Tề (1998), Giáo trình bệnh nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp Hà Nội 10 Nguyễn Thị Thanh Phụng (1982), Nghiên cứu đặc điểm vi sinh vật đất hệ sinh thái nơng nghiệp Việt Nam, Tạp chí Khoa học nơng nghiệp, Tập 7, trang 294 - 300 11 Lê Xuân Phƣơng (2009), Vi sinh vật học môi trường, NXB Đà Nẵng 12 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hƣng, Phạm Văn Toản (2003), Giáo trình Cơng nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường, NXB Nông Nghiệp 13 Ngô Tự Thành, Vũ Thị Minh Đức, Nguyễn Ngọc Quyên, Nguyễn Thu Hà (2003), Đặc tính sinh học số chủng Azotobacter, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Tập 4,trang 31 - 37 14 Lê Văn Tiềm, Trần Cơng Tàu (1999), Phân tích đất trồng, NXB Nông nghiệp 15 Phạm Văn Toản (2003), Khả sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức cho số trồng nông nghiệp, công nghiệp lâm nghiệp, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, trang 127 - 131 16 Phạm Văn Toản, Trƣơng Hợp Tác (2004), Phân bón vi sinh vật nông nghiệp, NXB Nông nghiệp 17 Phạm Văn Toản (2005), Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm phân bón, NXB Nơng nghiệp 18 Lê Văn Tri (1998), Chất điều hòa sinh trưởng suất trồng, NXB Nơng nghiệp 19 Hồng Lƣơng Việt (1978), Đặc tính vi sinh vật học số loại đất, Tập 5, trang 63 - 93 20 Vũ Văn Vụ (1994), Sinh trưởng phát triển thực vật, NXB Nông nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH 21 Anthony F., Gaudy J., Elizabeth T G (1980), Microbiology for Environmental Scientists and Engineers, Printed in United States of America 22 Aquilanti L., Favilli F., Clemanti F (2004), Comperison of different strategies for isolation and preliminaru identification of Azotobacter from soil sampes, Soil Biology and Biochemistry, 36, pp 1475 - 1483 23 Arora Diplip K (1996), Hand book of applied mycology, Volume 1: Soil and Plant, pp, 327 - 355 24 Bhatia R., Ruppel S (2008), Diversity studies of Azotobacter spp from wheat cropping systems of India, Joural of Basic Microbiology, 48 (4), pp 455 - 463 25 Bretrand H., Nalin H., Bally R (2001), Isolation and identification of the most efficient plant growth promoting bacterio associated with canola, Biology and Fertility of Soil, 33, pp 152 - 156 26 Chaway C.P., Hynes R.K., Nelson L.M (1989), Plant growth - promoting rhizobacteria effects on growth and nitrogen fixation of lentils and pea, Soil Biology and Biochemistry, 21, pp 511 - 517 27 Christion J.H., Ronald L.C., Guy R Knudsen, Linda D.S (2002), Manual of Environmental Microbiology, Printed in the United States of America 28 Damir O., Mladen D (2011), Cultivation of the Bacterium Azotobacter chroococcum for preparation of biofertilizers, African Journal of Biotechnology, Vol 10 (16), pp 3104 - 3111 29 Duff J.T, Wyss O (1961),Isolation and classification of a new series of Azotobacter bacteriophage, J Gen Microbial, 24, pp 273 - 289 30 Gatierrez I., Torres A.B, Moreno N (2011), Optimising carbon and nitrogen sources for Azotobacter chroococcum growth, African Journal of Biotechnology, 10 (15), pp 2951 - 2958 31 Glick B.R (1995), The enhancement of plant growth by free - living bacteria, Canadian Journal of Microbiology, 41, pp 109 - 117 32 Islam M.Z., Sharif D.I., Hossain M.A (2008), A comparative study of Azotobacter spp from different soil samples, J.Soil.Nature, (3), pp 16 - 19 33 Jones I.W., Greaves J.E (1993), Azotobacter chroococcum and its relationship to accessory growth factory, African Journal of Biotechnology, (2), pp 751 - 763 34 Kizilkaya R (2008), Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp strain isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the microbiologycal properties of soils, J Environ Biol, 30 (1), pp 73 - 82 35 Kloepper J.W., Hume D.J., Scher F.M (1988), Plant growth - promoting rhizobacteria on canola, Plant Disease, 72, pp 42 - 45 36 Robert S B., Murray B.G., Nathan R S (1957), Bergey’s manual of determinative bacteriology, Made in United States of America, pp 341 – 344 37 Sachin D (2009), Effect of Azotobacter chroococcum (PGPR) on the Growth of Bamboo (Bambusa bamboo) and Maize (Zea mays) Plants, Biofrontiers, 1, pp 24 - 31 38 Sandeep C., Rushmi S.N., Shurmila V., Surekha R., Tejuswini R., Suresh C.K (2011), Growth Response of Amaranthus Gangeticus Azotobacter chroococcum isolated from different Agroclimatic Zones Kamalaka, Journal of Phytology, 65 (3), pp 56 - 73 39 Sarwar K., Macrac I.C (1992), Determination of bacterially derived auxins using a microplate method, Lett Appl Microbiol, 20, pp 282 - 286 40 Shaukat et al (2006), Growth response of triticum aestivum to plant growth promoting rhizobacteria used as a biofertilizers, Research Journal of Microbiology, 4, pp 330 - 338 41 Suliasih, Widawati S (2005), Isolation and identification of Phosphate solubilizing and nitrogen fixing Bacteria from soil in Wamena Biogical Garden, Jayawijaya, Papua, Biodiversitas, 6, pp 157 - 177 42 Vigyan K., Sirohi K (2010), Methodology of nitrogen Biofertilizer production, Journal of Advances in Developmental Research, (1), pp - PHỤ LỤC Kết xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn mối tƣơng quan trị số OD420nm nồng độ NH4+ đƣợc trình bày Bảng 3.6 đồ thị hóa Hình 3.7 Bảng 3.6 Trị số OD420nm đo đƣợc nồng độ NH4+ khác Ống nghiệm số Nồng độ NH4+ (mg/l) Trị số OD420nm 0,000 0,194 0,323 0,423 0,553 0,660 0,745 0,909 1,085 10 1,165 11 10 1,375 Hình 3.7 Bảng nồng độ amonium xây dựng đồ thị chuẩn Phƣơng trình tƣơng quan hàm lƣợng NH4+ trị số OD420nm là: y = 0,1292x + 0,0298 Trong đó: x: nồng độ NH4+ (mg/l); y: trị số OD420nm Kết xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn mối tƣơng quan trị số OD530nm nồng độ IAA đƣợc trình bày Bảng 3.7 đồ thị hóa Hình 3.8 Bảng 3.7 Trị số OD530nm đo đƣợc nồng độ IAA khác Ống nghiệm số Nồng độ IAA (µg/ml) Trị số OD530nm 0,000 0,077 10 0,096 20 0,253 40 0,443 80 0,864 Hình 3.8 Xây dựng đồ thị chuẩn IAA y = 0,0107x + 0,0118 Phƣơng trình tƣơng quan hàm lƣợng IAA trị số OD530nm là: Trong đó: x: nồng độ IAA (µg/ml); y: trị số OD530nm ... ? ?Tuyển chọn vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ, phân giải phosphate khó tan sinh tổng hợp IAA? ?? CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi khuẩn cố định nitơ 1.1.1 Nitơ trình cố. .. thấy có 12/12 chủng Azotobacter có khả phân giải phosphate khó tan, khả phân giải phosphate khó tan chủng Azotobacter khác Trong đó, có chủng có khả phân giải phosphate khó tan với vịng phân giải. .. chủng vi khuẩn có khả phân giải phosphate khó tan tạo vịng trịn phân giải bao quanh khuẩn lạc Ca3(PO4)2 bị phân giải Đo đƣờng kính vịng phân giải phosphate khó tan, xác định khả phân giải phosphate