Phân lập, tuyển chọn chủng aspergillus flavus không sinh aflatoxin nhằm ứng dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng trên gạo và đậu tương

LỜI CẢM ƠN Để có đƣợc điều kiện thực Khóa luận Tốt nghiệp nhƣ hồn thành chƣơng trình học năm Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam ngồi cố gắng phấn đấu nỗ lực thân, tơi cịn nhận đƣợc nhiều giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình cá nhân tập thể đơn vị khác Với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: TS Vũ Kim Dung – Bộ môn Công nghệ Vi sinh- Hóa sinh, Viện Cơng nghệ Sinh học Lâm Nghiệp, thầy (cô) giảng viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm Nghiệp, Trƣờng đại học Lâm Nghiệp Việt Nam- thầy cô dành nhiều thời gian quan tâm động viên, góp ý tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện Cơng nghệ Sinh học Lâm Nghiệp tạo điều kiện sở vật chất cho tơi đƣợc làm việc phịng đợt thực tập vừa qua Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ngƣời thân gia đình bạn bè, ngƣời ln bên tơi, chăm sóc, động viên tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 13 tháng năm 2018 Sinh viên Phùng Thị Ly MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .1 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT .5 DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tổng quan aflatoxin 1.1.1 Giới thiệu aflatoxin 1.1.2 Điều kiện nhiễm bẩn aflatoxin 1.1.3 Cấu tạo 1.1.4 Tính chất hóa lý .5 1.1.5 Độc tính aflatoxin .7 1.1.6 Thực trạng nhiễm aflatoxin gạo, đậu tƣơng Việt Nam giới…………… .9 1.1.7 Giới hạn aflatoxin cho phép nông sản thực phẩm 10 1.2 Aspergillus flavus 12 1.2.1 Đặc điểm hình thái 13 1.2.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng A flavus 15 1.2.3 Ðiều kiện sinh aflatoxin 16 1.3 Phòng chống nhiễm aflatoxin 17 1.3.1 Biện pháp canh tác nông nghiệp .17 1.3.2 Biện pháp sau thu hoạch 18 1.3.3 Biện pháp sinh học 19 1.4.Phòng chống aflatoxin chủng A.flavus không sinh aflatoxin 20 1.4.1 Cơ chế kiểm soát nấm mốc aflatoxin chủng A.flavus không sinh aflatoxin .20 1.4.2 Tuyển chọn chủng A.flavus không sinh aflatoxin làm tác nhân đối kháng …………………………………………………………………………21 CHƢƠNG MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………………………………………………………………………22 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 22 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.3.2 Hóa chất, dụng cụ nghiên cứu .22 2.3.3 Các thiết bị nghiên cứu 22 2.3.4 Môi trƣờng nghiên cứu 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 23 2.4.2 Phƣơng pháp phân lập .24 2.4.3 Sàng lọc sơ chủng sinh aflatoxin không sinh aflatoxin 25 2.4.4 Xác định khả cạnh tranh của chủng A flavus sinh aflatoxin với chủng không sinh aflatoxin .26 2.4.5 Nghiên cứu khả tạo bào tử chủng A flavus .26 2.4.6 Quy trình ni cấy nấm mốc A flavus tuyển chọn qui mơ phịng thí nghiệm .28 2.4.7 Xác định mật độ bào tử A flavus 28 CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1.Phân lập, tuyển chọn chủng A flavus không sinh aflatoxin 29 3.1.1 Phân lập chủng Aspergillus flavus gạo, đậu tƣơng 29 3.1.2 Sàng lọc chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin 31 3.1.3 Đặc điểm bào tử chủng Aspergillus flavus 32 3.2.Tuyển chọn chủng A flavus không sinh aflatoxin .36 3.3.Đánh giá cạnh tranh chủng A flavus NXĐ không sinh aflatoxin chủng A flavus ĐTT6 sinh aflatoxin .37 3.4.Nghiên cứu điều kiện thu nhận chủng A flavus NXĐ .38 3.4.1 Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng chủng A flavus NXĐ 39 3.4.2 Xác định thời gian thu hồi bào tử chủng A flavus NXĐ .40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Kết luận .42 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT PDA Potato Dextro Agar PDB Potato Dextro Broth ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic FAO Tổ chức Nông lƣơng quốc tế FDA Cục quản lý Thực phẩm Dƣợc phẩm Hoa kỳ CPA Cyclopiazonic acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số tính chất lý, hóa aflatoxin [11] Bảng 1.2 Giới hạn aflatoxin cho phép nông sản thực phẩm [22] 11 Bảng 1.3 Giới hạn aflatoxin thức ăn tinh hỗn hợp cho Bê Bò [8] 12 Bảng 1.4 Giới hạn aflatoxin thức ǎn chǎn nuôi [7] .12 Bảng 1.5 Đặc điểm hình thái A flavus [2] .14 Bảng 2.1 Mật độ tế bào A.flavus NXĐ A.flavus ĐTT6 nuôi hỗn hợp theo tỷ lệ 1:1 26 Bảng 2.2 Lƣợng sinh khối chủng A flavus NXĐ nuôi cấy thời gian khác 27 Bảng 2.3 Thời điểm thu bào tử chủng A Flavus NXĐ 27 Bảng 3.1 Kết phân lập chủng Aspergillus flavus từ gạo, đậu tƣơng 30 Bảng 3.2 Khả tạo aflatoxin chủng A flavus phân lập từ gạo vào đậu tƣơng 31 Bảng 3.3 Ðặc điểm hình thái chủng Aspergillus flavus phân lập từ mẫu gạo, đậu tƣơng 32 Bảng 3.4 Đặc điểm cấu trúc vi học cúa chủng A flavus phân lập từ mẫu gạo, đậu tƣơng 35 Bảng 3.5.Mật độ tế bào A.flavus NXĐ A.flavus ĐTT6 nuôi hỗn hợp theo tỷ lệ 1:1 38 Bảng 3.6 Lƣợng sinh khối chủng A flavus NXĐ nuôi cấy thời gian khác 39 Bảng 3.7 Thời điểm thu bào tử chủng A flavus NXĐ 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo số dạng Aflatoxin .5 Hình 1.2 Khuẩn lạc chủng Aspergillus flavus [30] 15 Hình 1.3 Cấu trúc vi học hệ sợi chủng Aspergillus flavus [30] 15 Hình 2.1 Mẫu đậu tƣơng dùng cho phân lập chủng A flavus .24 Hình 2.2 Mẫu gạo Tám Thơm dùng cho phân lập chủng A flavus 24 Hình 3.1 Mẫu hạt gạo, đậu tƣơng có nấm mốc phát triển môi trƣờng nuôi cấy PDA sau - ngày, nhiệt độ 28oC 29 Hình 3.2 Các chủng A flavus phân lập từ mẫu gạo, đậu tƣơng .34 Hình 3.3 Hình thái bào tử khuẩn ty chủng A flavus quan sát dƣới kính hiển vi 35 Hình 3.4 Chủng A flavus khơng phát quang phân lập đậu tƣơng 37 Hình 3.5 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng A flavus NXĐ 39 MỞ ĐẦU Aflatoxin chất có độc tính cao, đƣợc sinh tổng hợp chủ yếu loài nấm mốc Aspergillus Các độc tố tồn nông sản thực phẩm, làm giảm giá trị dinh dƣỡng củathực phẩm mà nguyên nhân gây nên cǎn bệnh nguy hiểm cho ngƣời động vật nhƣ viêm gan cấp tính, ung thƣ gan, suy dinh dƣỡng trẻ em Việc kiểm sốt hàm lƣợng aflatoxin có mặt nơng sản thực phẩm đƣợc nghiên cứu từ lâu với nhiều biện pháp khác nhau, biện pháp có ƣu nhƣợc điểm định nhƣng chƣa có biện pháp đạt đƣợc hiệu nhƣ mong đợi Một số biện pháp truyền thống nhƣ xử lý sau thu hoạch, chọn tạo giống kháng nấm sinh aflatoxin… cho phép phát nấm mốc giai đoạn muộn nấm mốc phát triển sinh độc tố tồn sản phẩm thực phẩm Những nǎm gần dây, xu hƣớng sử dụng chủng nấm đối kháng Aspergillus flavus không sinh độc tố có tính cạnh tranh cao làm tác nhân kiểm sốt đƣợc phát triển tỏ hiệu Chế phẩm nấm Aspergillus flavus đối kháng đƣợc nghiên cứu, ứng dụng cấp sáng chế, đƣợc sử dụng rộng rãi nông nghiệp số quốc gia nhƣ Mỹ, Ấn Ðộ, Trung Quốc Ví dụ: chủng NRRL 21882 AF36 nhà khoa học thuộc Nơng nghiệp Mỹ tao có tác dụng giảm 90% hàm lƣợng aflatoxin ngô bơng Việt Nam nằm miền khí hậu nhiệt đới nóng, ẩm điều kiện thuận lợi cho loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm vào trồng từ giai đoạn canh tác, suốt trình bảo quản chế biến Cho đến nay, Việt Nam chƣa có cơng trình nghiên cứu ứng dụng chủng nấm mốc A flavus không sinh độc tố để phòng chống nấm mốc độc tố aflatoxin gạo, đậu tƣơng Mặt khác, khả nǎng đối kháng chủng nấm mốc không sinh độc tố thƣờng thay đổi theo điều kiện khí hậu hệ sinh thái vùng nên việc ứng dụng chế phẩm nấm đối kháng đƣợc sản xuất nƣớc đồng ruộng Việt Nam không dễ dàng đem lai hiệu khơng cao Do đó, việc tạo lập chế phẩm nấm A flavus đối kháng từ chủng phân lập đƣợc nguồn tự nhiên địa chắn mang lai hiệu giảm thiểu nhiễm aflatoxin Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng gạo đậu tƣơng” CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan aflatoxin 1.1.1 Giới thiệu aflatoxin Aflatoxin độc tố vi nấm số loài Aspergillus sinh (đặc biệt Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus) Aflatoxin độc tố tác nhân gây ung thƣ Sau thâm nhập vào thể, aflatoxin đƣợc gan chuyển hóa thành dạng trung gian epoxit hoạt hóa đƣợc thuỷ phân trở thành M1 độc 1.1.2 Điều kiện nhiễm bẩn aflatoxin Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rộng tự nhiên Chúng tạo khuẩn lạc gây nhiễm vào hạt trƣớc thu hoạch trình bảo quản Cây chủ dễ bị gây nhiễm Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài mơi trƣờng có độ ẩm cao bị tổn thƣơng điều kiện xấu nhƣ hạn hán Các môi trƣờng sống địa Aspergillus đất, thực vật mục nát ngũ cốc bị giảm sức đề kháng Vi sinh vật Aspergillus xâm nhập vào tất loại chất hữu có điều kiện đƣợc thuận lợi cho phát triển Điều kiện thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (> 8%) nhiệt độ cao Các loại nông sản thƣờng bị nhiễm aflatoxin ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tƣơng, hạt hƣớng dƣơng, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) loại hạt khác nhƣ hạt dẻ, dừa… Aflatoxin xuất sữa động vật đƣợc cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin 1.1.3 Cấu tạo Aflatoxin nhóm hợp chất có nhân difuranocumarin, sản phẩm trao đổi chất chủ yếu hai loài nấm mốc Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Theo Reddy Farid, có khoảng 18 cấu trúc hóa học gần đƣợc chủng nấm mốc đất trồng lúa lấy Huyện Chƣơng Mỹ Kết cho thấy mẫu gạo, đậu tƣơng khảo sát bị nhiễm nấm nghi ngờ A.flavus với tần suất cao (50- 66,7%) 3.1.2 Sàng lọc chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin Theo số tài liệu công bố tất chủng A flavus sinh aflatoxin [5] Do vậy, để sàng lọc chủng không sinh aflatoxin, chủng A flavus phân lập đƣợc nuôi cấy môi trƣờng Gzapex- Dox Sau ngày nuôi cấy, mẫu đƣợc định tính aflatoxin cách quan sát phát quang aflatoxin dƣới tia UV 360nm Khả tạo aflatoxin chủng nghi ngờ A flavus đƣợc trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Khả tạo aflatoxin chủng A flavus phân lập từ gạo vào đậu tương Số chủng A flavus sinh aflatoxin (phát Tên mẫu quang dƣới tia UV 360nm) Không phát quang Phát quang A flavus từ gạo A flavus từ đậu tƣơng A flavus từ đất Tổng số chủng A flavus Kết phân tích khả tạo aflatoxin chủng A flavus bảng 3.2 cho thấy, sàng lọc đƣợc chủng nghi A flavus không sinh aflatoxin dùng cho thí nghiệm tiếp sau Kết phân tích 71, 4% số chủng phân lập đƣợc có khả tạo aflatoxin vùng khảo sát Sự nhiễm A flavus có khả sinh aflatoxin với tần suất cao gạo đậu tƣơng địa điểm lấy mẫu số liệu khoa học quan trọng việc khuyến cáo xây dựng chƣơng trình phịng chống nấm mốc độc tố aflatoxin gạo, đậu tƣơng Việt Nam Những số liệu cho 31 thấy cần có biện pháp hiệu quả, an tồn để phịng chống nhƣ cần kiểm tra chặt chẽ mức độ nhiễm độc tố nông sản 3.1.3 Đặc điểm bào tử chủng Aspergillus flavus Để mô tả đầy đủ đặc điểm chủng Aspergillus flavus tiến hành quan sát bào tử chủng A flavus phân lập đƣợc theo khóa phân loại Raper Fennell “The genus Aspergillus” (tài liệu kinh điển dùng phân lập lồi nấm mốc thuộc chi Aspergillus) Theo khóa phân loại Raper Fennell lồi Aspergillus flavus có đặc điểm cấu trúc vi học nhƣ sau: Đầu bào tử có dạng tỏa trịn, đƣờng kính khoảng 200 – 750 µm Cuống bào tử có thành dày, khơng màu, sần sùi, thƣờng dài 1µm Bọng đỉnh giá có hình cầu hay hình gần cầu, đƣờng kính khoảng 25-60µm Thể bình 01 02 tầng, đơi có hai kiểu thể bình đầu, Bào tử trần có hình cầu hình cầu, sần sùi có gai, kích thƣớc 2,5-6µm Đặc điểm hình thái cấu trúc vi học chủng A flavus không sinh aflatoxin chủng A flavus sinh aflatoxin cao (ký hiệu ĐTT6) đƣợc trình bày bảng 3.3, 3.4 Bảng 3.3 Ðặc điểm hình thái chủng Aspergillus flavus phân lập từ mẫu gạo, đậu tương STT Ký hiệu chủng Đƣờng Màu sắc kính khuẩn khuẩn lạc (cm) lạc Màu vàng xanh cây; Mặt NXĐ 6,5- 7,5 trái khuẩn lạc có màu nâu;khơng có sắc tố hòa tan quanh khuẩn 32 Dạng mặt Chú khuẩn lạc thích Bơng xơ trung tâm rìa ngồi khuẩn lạc có dạng nhung Khơng sinh aflatoxin lạc Màu KLG -7 vàng xanh cây; Bông xơ Khơng Mặt trung tâm sinh khuẩn lạc có aflatoxin màu ngồi trái nâu; rìa khơng có sắc khuẩn lạc tố có hịa tan quanh khuẩn dạng nhung lạc Màu vàng xanh cây; trái Bông xơ khuẩn lạc có trung tâm Sinh màu tím nhạt; aflatoxin khơng có sắc ngồi tố khuẩn lạc Mặt ĐTT6 5,5-7 hịa tan rìa quanh khuẩn có lạc, rìa khuẩn nhung lạc có trắng mịn 33 màu dạng Hình a NXĐ Hình b KLG Hình c ĐTT6 Hình 3.2 Các chủng A flavus phân lập từ mẫu gạo, đậu tương 34 Bảng 3.4 Đặc điểm cấu trúc vi học cúa chủng A flavus phân lập từ mẫu gạo, đậu tương STT Ký hiệu chủng Số hàng thể bình NXĐ KLG 1-2 ĐTT6 1-2 Bào tử trần Hình cầu, có gai Bọng đỉnh giá Hình chùy Hình cầu, có hình cầu hay gai gần cầu Hình cầu, có hình cầu hay gai gần cầu Cuống sinh bào tử sần sùi sần sùi sần sùi Hình 3.3 Hình thái bào tử khuẩn ty chủng A flavus quan sát kính hiển vi Bảng 3.3, 3.4 mơ tả đặc điểm hình thái cấu trúc vi học chủng A flavus không sinh aflatoxin chủng A flavus sinh aflatoxin cao phân lập đƣợc Kết cho thấy, khoảng ngày nuôi cấy môi trƣờng Czapeck nhiệt độ 28oC, khuẩn lạc A flavus có đƣờng kính 335 7,5cm Sợi nấm từ thƣa đến dày, có nếp nhăn mép cƣa gần mép khuẩn lạc Khuẩn lạc màu xanh –vàng Mặt dƣới khuẩn lạc thƣờng có màu nâu, nâu hồng tím nhạt chạy theo hình phóng xạ Khuẩn lạc khơng đổi màu sang nâu già, đặc điểm hình thái quan trọng để phân biệt loài A flavus với loài Aspergillus oryzae lồi khơng sinh aflatoxin vốn đƣợc dùng công nghệ chế biến thực phẩm Đầu bào tử có dạng tỏa trịn Cuống bào tử có thành dày, khơng màu, sần sùi Bọng đỉnh giá có hình cầu hay hình gần cầu Thể bình 01 02 tầng, đơi có hai kiểu thể bình đầu Bào tử trần có hình cầu hình cầu, sần sùi có gai Đối chiếu với đặc điểm hình thái cấu trúc vi học loài A flavus đƣợc Rapper Fennell miêu tả khóa phân loại “The genus Aspergillus “cho thấy chủng A flavus phân lập đƣợc thuộc loài Aspergillus flavus Do vậy, bƣớc đầu khẳng định phân lập đƣợc hai chủng nghi ngờ Aspergillus flavus không sinh aflatoxin 3.2 Tuyển chọn chủng A flavus không sinh aflatoxin Theo nghiên cứu nhiều tác giả giới, hiệu giảm aflatoxin phụ thuộc vào tỷ lệ chủng A flavus không sinh aflatoxin với chủng sinh aflatoxin Tỷ lệ cao hiệu giảm aflatoxin lớn [18,12 ] Các chủng A flavus khơng sinh aflatoxin mục tiêu phải có tốc độ phát triển nhanh để chiếm ƣu số lƣợng có khả đối kháng cao với chủng A flavus sinh aflatoxin Trên sở đó, dựa vào bảng 3.3, chủng A flavus NXĐ không sinh aflatoxin có đƣờng kính khuẩn lạc cao mơi trƣờng Czapeck sau ngày nuôi cấy đƣợc chọn để thực nghiên cứu Để khẳng định khả không sinh aflatoxin chủng tuyển chọn, chủng A flavus NXĐ chủng A flavus ĐTT6 đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng Czapek sau tiến hành quan sát dƣới tia UV bƣớc sóng 360nm Chủng sinh aflatoxin phát huỳnh quang sau đƣợc chiếu tia UV cịn chủng khơng sinh aflatoxin ngƣợc lại không phát huỳnh quang Kết đƣợc thể hình 3.4 36 Hình 3.4 Chủng A flavus khơng phát quang phân lập đậu tương 3.3 Đánh giá cạnh tranh chủng A flavus NXĐ không sinh aflatoxin chủng A flavus ĐTT6 sinh aflatoxin Chủng A.flavus ĐTT6 sinh aflatoxin đƣợc nuôi hỗn hợp với chủng A.flavus NXĐ không sinh aflatoxin tỷ lệ 1:1 (số bào tử chủng x 105CFU/ml) môi trƣờng Czapeck nhiệt độ 280C thời gian ngày Để đánh giá khả cạnh tranh chủng A.flavus NXĐ với chủng A.flavus ĐTT6 sinh aflatoxin môi trƣờng nuôi cấy, tiến hành phân lập lại chủng phƣơng pháp pha lỗng thập phân, cấy chuyền mơi trƣờng Czapeck để phát phát quang chủng A.flavus ĐTT6 sinh aflatoxin dƣới ánh sáng cực tím bƣớc sóng 360nm Tính tỷ lệ khuẩn lạc A.flavus phát quang màu xanh cây, vàng sáng tổng số khuẩn lạc Khả cạnh tranh chủng A.flavus NXĐ chủng A.flavus ĐTT6 đƣợc trình bày bảng 3.5 37 Bảng 3.5.Mật độ tế bào A.flavus NXĐ A.flavus ĐTT6 nuôi hỗn hợp theo tỷ lệ 1:1 Mật độ bào tử ban đầu (CFU/ml) Mật độ bào tử sau nuôi cấy hỗn hợp 09 ngày (CFU/ml) STT Tên chủng A flavus NXĐ x105 x108 A.flavus ĐTT6 x105 KPHÐ Ghi chú: KPHĐ – không phát đƣợc Kết bảng 3.5 cho thấy, sau 09 ngày nuôi cấy môi trƣờng Czapeck, mật độ bào tử 02 chủng nấm A.flavus NXĐ A.flavus ĐTT6 trƣớc nuôi cấy hỗn hợp sau 09 ngày ni cấy hỗn hợp có khác đáng kể Trƣớc nuôi cấy 02 chủng đƣợc tiếp giống với tỷ lệ 1:1 (mật độ bào tử ban đầu 1x105 CFU/ml) Sau 09 ngày nuôi cấy hỗn hợp, mật độ bào tử chủng A.flavus NXĐ đạt 5x108 CFU/ml, không phát thấy có mặt chủng A.flavus Điều chứng tỏ chủng A.flavus NXĐ cạnh tranh lấn át hoàn toàn chủng A.flavus ĐTT6 Theo nghiên cứu Huang cộng sự, q trình ni hỗn hợp hai chủng A flavus không sinh aflatoxin chủng A flavus sinh aflatoxin có mặt chủng A flavus không sinh aflatoxin phá vỡ không bào chủng A flavus sinh aflatoxin làm ức chế sinh trƣởng, phát triển nhƣ sinh tổng hợp aflatoxin chủng A flavus sinh độc tố [21] 3.4 Nghiên cứu điều kiện thu nhận chủng A flavus NXĐ Để sản xuất đƣợc lƣợng lớn bào tử A flavus NXĐ phục vụ cho nghiên cứu làm tiền đề cho sản xuất chế phẩm nấm đối kháng sau quy mô công nghiệp, yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh trƣởng tạo bào tử chủng A flavus NXĐ đƣợc khảo sát Một yếu tố ảnh hƣởng nhiều nhiệt độ, thời gian hàm ẩm môi trƣờng nuôi cấy 38 3.4.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng A flavus NXĐ Với mục đích xác định thời điểm thích hợp để thu nhận sinh khối giống lỏng cho mẻ nuôi kế tiếp, chủng thử nghiệm A flavus NXĐ đƣợc nuôi cấy nhiệt độ 28oC, pH = 6,5, tốc độ khuấy 200 vịng/phút mơi trƣờng PDB, bình tam giác Sau 12 ni cấy, mẫu đƣợc lấy ra, lọc, thu hệ sợi nấm sấy khô đến khối lƣợng không đổi nhiệt độ 105oC Kết đƣợc trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Lượng sinh khối chủng A flavus NXĐ nuôi cấy thời gian khác Thời gian (giờ) Lƣợng sinh khối (g/l) 12 24 36 48 60 72 80 1,2 ± 0,06 1,5±0.07 2,9±0,1 4,5±0,2 4,45±0,2 4,4 ±0,2 4,3 ±0,2 Từ bảng 3.6 ta xây dựng đƣợc đƣờng cong sinh trƣởng chủng A flavus khoảng thời gian khảo sát đƣợc thể hình 3.5 Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng chủng A flavus NXĐ 39 Kết hình 3.5 cho thấy, hàm lƣợng sinh khối chủng A flavus NXĐ phụ thuộc chặt chẽ vào thời gian giảm dần theo thời gian nuôi cấy Ở thứ 12, sinh khối đạt 1, 2g/lít đạt cao sau 48 nuôi cấy (4, g/l) môi trƣờng dịch thể khoai tây Sau 48 nuôi cấy, sản lƣợng sinh khối A flavus NXĐ giảm dần Nhƣ nói thời gian nhân ni thích hợp cho thu hồi sinh khối chủng A flavus NXĐ 48 giờ, tiếp tục kéo dài thời gian nhân nuôi xảy tƣợng thiếu dinh dƣỡng thành bình tạo bào tử, sinh khối nấm mốc giảm Kết nghiên cứu phù hợp với kết Jafari cộng sự, để thu sinh khối mốc nuôi cấy môi trƣờng lỏng thời gian 3- ngày nuôi cấy cho sản lƣợng sinh khối mốc cao Tuy nhiên, số chủng cơng nghiệp tiềm đƣợc nuôi cấy qui mô lớn khoảng 2-3 ngày [20] Vì vậy, thời điểm cấy chuyển thích hợp chủng A flavus NXĐ ngày 3.4.2 Xác định thời gian thu hồi bào tử chủng A flavus NXĐ Thời gian ni cấy có ảnh hƣởng lớn đến sinh trƣởng, phát triển nấm mốc, yếu tố công nghệ quan trọng việc sản xuất chế phẩm sinh học Nếu kết thúc sớm q trình ni cấy sản lƣợng bào tử chƣa đạt tối đa, kết thúc muộn ảnh hƣởng đến chất lƣợng làm tăng chi phí sản xuất Nhằm tìm thời gian ni cấy thích hợp cho thu hồi bào tử nấm cao, chủng A flavus NXĐ đƣợc nuôi cấy môi trƣờng cám trấu với pH= 5,5, nhiệt độ 28oC xác định mật độ bào tử sau khoảng thời gian nuôi cấy khác Kết đƣợc trình bày bảng 3.7 40 Bảng 3.7 Thời điểm thu bào tử chủng A flavus NXĐ STT Thời gian nuôi cấy (ngày) Mật độ bào tử (CFU/ml) Chỉ có sợi nấm phát triển, khơng có bào tử 1-3 1.2 x 103 1.9x 103 3.6 x 104 4.5 x 105 5.1 x 106 3.2 x 107 10 2.5 x 107 nhìn thấy mắt thƣờng Kết bảng 3.7 cho thấy, mật độ bào tử chủng A flavus NXĐ nuôi cấy môi trƣờng cám trấu tăng nhanh chóng khoảng thời gian từ 4- ngày Ngày thứ mật độ bào tử đạt 5, x 106 CFU/ml đạt cao ngày thứ 3,2 x107 CFU/ml Do vậy, thời gian nuôi cấy phù hợp cho tạo bào tử chủng A flavus NXĐ ngày Nếu kéo dài thời gian nuôi cấy đến ngày thứ 10 làm tăng chi phí sản xuất, sản lƣợng khơng khơng tăng lên mà cịn giảm Từ kết nghiên cứu đƣa quy trình nhân ni bề mặt chủng A flavus NXĐ là: Chủng nấm đƣợc tăng sinh môi trƣờng PDB nhiệt độ 28oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, sau 48 thu hồi sinh khối hệ sợi phân phối lên môi trƣờng nuôi cấy bề mặt với tỷ lệ giống 10% Chủng A flavus NXĐ có khả tạo bào tử cao mơi trƣờng cám trấu (tỷ lệ 4:1), nhiệt độ nuôi cấy 28oC, pH= 5.5, sau ngày nuôi cấy tiến hành thu hồi bào tử để sản xuất chế phẩm 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình nghiên cứu thực đề tài thu đƣợc số kết sau đây: - Đã phân lập đƣợc chủng A flavus tổng số 14 mẫu gạo, đậu tƣơng đất - Đã tuyển chọn đƣợc chủng A flavus NXĐ khơng sinh aflatoxin có khả cạnh trạnh cao chủng A flavus ĐTT6 sinh độc tố - Đã xây dựng đƣợc quy trình ni cấy bề mặt chủng A flavus NXĐ cho sản xuất chế phẩm đối kháng không sinh aflatoxin môi trƣờng nuôi cấy cám trấu (tỷ lệ 4:1), pH=5,5, nhiệt độ nuôi cấy 28oC, thời gian nuôi cấy ngày Kiến nghị Định danh xác chủng A flavus tuyển chọn Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện số điều kiện nuôi cấy cho sản lƣợng bào tử nấm cao quy mơ phịng thí nghiệm áp dụng vào công nghệ tạo chế phẩm bào tử nấm A flavus NXĐ không sinh aflatoxin quy mô công nghiệp Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm từ bào tử chủng A flavus NXĐ không sinh aflatoxin với tỷ lệ khác quy mơ phịng thí nghiệm đồng ruộng Nghiên cứu ảnh hƣởng thuốc bảo vệ thực vật đến chế phẩm từ bào tử chủng A flavus NXĐ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thùy Châu (1996), Nghiên cứu mức độ nghiễm nấm mốc sinh độc tố (mycotoxin) ngô, gạo Việt Nam biện pháp phòng trừ Luận án phó tiến sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên Lê Vǎn Lƣơng, Quyền Ðình Thi (2004), Kỹ thuật di truyền ứng dụng NXB Đại học Quốc Gia HN Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm vị nấm, độc tố vi nấm NXB Khoa học kỹ thuật Bùi Xuân Ðồng, Nguyễn Huy Vǎn (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, trang 203 Đặng Hồng Miên (1980), Nấm mốc độ thực phẩm NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Ðoàn Vǎn Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Ðặng Ðức Trạch, Phạm Vǎn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học.Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, trang:325-378 Quyết định số 104/2001/QĐ-BNN Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn: Về việc ban hành số quy định kỹ thuật tạm thời thức ăn chăn nuôi QCVN 2013/BNNPTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia thức ăn chăn nuôi – quy định giới hạn tối đa cho phép hàm lƣợng độc tố nấm mốc, kim loại nặng vi sinh vật thức ăn tinh hỗn hợp cho bò, trang Tiếng Anh Martinez A J., Weng C Y., Park D L (1994) Distribution of ammonia/aflatoxin reaction products in corn following exposure to ammonia decontamination procedure Food Addit Contam, 11:659–667 10 Masimango N., Remacle J., Ramaut J (1979) Elimination of aflatoxin B1 by absorbentclaysfromcontaminatedsubstrates.Ann.Nutr.Alim, 33:137–147 11 AOAC oficial methods analysis 14thed (1990) Association of afficial Analytical chemists.Washington 12 Miller J D (1995) Fungi and mycotoxins in grain: Implications for stored product research J stored Prod Res., 31:1-16 13 Reddy S V., Farid Waliyar (2007) Properties of aflatoxin and it producing fungi http://www.icrisat.org/aflatoxin/aflatoxin.asp 14 Wicklow D T., Bobell J R., Palmquist D E (2003) Effect of intraspecific competition by Aspergillus flavus on aflatoxin formation in suspended disc culture Mycological Research 107:617–623 15 HornB.W.,GreeneR.L.,.DornerJ.W.(2000)Inhibitionofaflatoxi nB1production by Aspergillus parasiticus using nonaflatoxigenic strains: role of vegetative compatibility Biological Control, 17:147-154 16 Brown R L., Cotty P J., Cleveland T E (1991) Reduction in Aflatoxin Content of Maize by Atoxigenic Strains of Aspergillus flavus Journal of Food Protection, 54: 623 –626 17 Christensen C M., Henry H K (1969) Grain Storage Mineapolis University of MinesotaPress 18 Hara S., Fennell D I., Hesseltine C W (1974) AflatoxinProducing Strains of Aspergillus flavus Detected by Fluorescence of Agar Medium Under Ultraviolet Light Appl Environ Microbiol.27:1118-1123 19 Rapper, Fennel (1965) The genus Aspergillus Williams &Wilkins 20 Cotty P J., Bayman P (1993) Competitive Exclusion of a Toxigenic Strain of Aspergillus flavus by an Atoxigenic Strain Posthavest Pathology and Mycotoxins, 83:283-1287 21 Huang C (2007) Mechanism of intraspecific toxin inhibition in Aspergillus flavus MSc thesis, Zhejiang University, China 22 Jafari A R., Sarrafzaden M H (2007) Effect of stirrer speed and aeration rate on the production of glucose Oxidase by Aspergillus niger Journal of Biological Sciences, 7: 270 –275 23 MaceK., AugilarF., Wang J.S., VautraversP., Gomez LechonM.,GonzaleaF.J., Groopman J., Harris C C., Pfeifer A M A (1997) AFB1 induced DNA adduct formation and p53 mutation in CYP450 expressing human liver cell lines Carcinogensis, 18: 1291 – 1297 24 FAO/WHO/UNEP (1999) Third Joint FAO/WHO/UNEP International Conference on Mycotoxins, Tunis, Tunisia, 3–6 March 1999 (MYC-CONF/99/8a), Geneva, WHO 25 Makun H A., Anjorin S T., Moronfoye B., Adejo F O., Afolabi O A., Fagbayibo G., Balogun B O., Surajudeen A A (2010) Fungal and aflatoxin contaminationof some human food commodities in Nigeria African Journal of Food Science 4: 127- 135 26 Schroeder H W., Boller R A (1973) Aflatoxin production of species and strains of theAspergillusflavusgroupisolatedfromfieldcrops.Appl.Microbiol25:885– 889 27 Clevstrom G (1983) Production of aflatoxin by an Aspergillus flavus isolate cultured under a limited oxygen supply Applied and environmental microbiology, 46: 400 -405 28 Pitt J I., Hocking A D., Glenn D R (1983) An improved medium for the detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus Journal of applied batergiology 54: 109 –114 29 https://www.slideshare.net/garmentspace/tim-hiu-nganh-lua-gaovit-nam 30 http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012/02/aspergillusflavus.html ... thiểu nhiễm aflatoxin Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: ? ?Phân lập tuyển chọn chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng gạo đậu tƣơng”... .29 3.1 .Phân lập, tuyển chọn chủng A flavus không sinh aflatoxin 29 3.1.1 Phân lập chủng Aspergillus flavus gạo, đậu tƣơng 29 3.1.2 Sàng lọc chủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin. .. chống aflatoxin chủng A .flavus không sinh aflatoxin 20 1.4.1 Cơ chế kiểm soát nấm mốc aflatoxin chủng A .flavus không sinh aflatoxin .20 1.4.2 Tuyển chọn chủng A .flavus không sinh aflatoxin