Nghiên cứu khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy tổng hợp enzym chitinase từ chủng vi sinh vật phân lập tại núi luốt trường đại học lâm nghiệp

LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới T Ngu n Nhƣ Ngọc- Bộ môn Cơng Nghệ Vi Sinh – Hóa sinh, Viện Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến thầy cô môn Công Nghệ Vi Sinh – Hóa sinh Viện Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp tận tình giúp đỡ, dạy bảo suốt q trình làm khóa luận Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè ln quan tâm tới tơi suốt q trình làm khóa luận Đâ lần cá nhân trực tiếp thực nghiên cứu khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đƣợc đóng góp chân thành quý thầy cô bạn Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Vũ Thị Ngọc Diệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG ITỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Enzyme chitinase 1.1.1 Giới thiệu Enzyme chitinase 1.1.2 Phân loại chitinase 1.2 Nguồn thu nhận Enzyme chitinase 1.2.1 Enzyme chitinase vi khuẩn 1.2.2 Chitinase từ nấm 1.2.3.Chitinase thực vật 1.2.4 Chitinase động vật 1.3 Các đặc tính enzyme chitinase 1.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 1.3.2 Ảnh hƣởng pH 1.3.3.Ảnh hƣởng nguồn cacbon 1.3.4.Ảnh hƣởng nguồn nitơ 1.3.5 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng khoáng 1.3.6 Ảnh hƣởng yếu tố khác 1.4 Các loại chất enzyme chitinase 1.4.1 Chitin 1.4.2 Cấu trúc phân tử chitin 10 1.5 Ứng dụng enzym chitinase 11 1.5.1.Ứng dụng enzyme chitinase kiểm soát nấm bệnh côn trùng gây hại thực vật 12 1.5.2.Ứng dụng dƣợc tổng hợp chitooligosaccharide 12 1.5.3.Ứng dụng chuẩn đoán bệnh truyền nhi m vi nấm enzyme chitinase 13 Đại cƣơng nấm Trichoderma 14 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1.Mục tiêu nghiên cứu 15 Xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy sinh enzyme chitinase từ chủng Trichoderma atrovirid (Tri 3) 15 2.2.Nội dung nghiên cứu 15 Đối tƣợng, hóa chất, vật liệu thiết bị 15 2.3.1.Đối tƣợng nghiên cứu 15 2.3.2.Thiết bị hóa chất 15 2.3.3 Môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc 16 2.4.2.Khảo sát ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma atroviride 18 2.4.3 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn nito đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng Trichoderma atroviride[12] 19 244 hảo sát ảnh hƣởng hàm lƣợng chitin đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng Trichoderma atroviride 19 2.4.5.Khảo sát ảnh hƣởng yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase 20 Phƣơng pháp xác định hoạt độ chitinase 20 Xác định đƣờng khử DNS 22 CHƢƠNG ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Kết ảnh hƣởng môi trƣờng nguồn Nito Cacbon đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma atroviride 23 3.1.1 Ảnh hƣởng MT đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase 23 3.1.2 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng cacbon 25 3.1.3 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn Nito 25 3.1.4 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng 26 3.2 Kết khảo sát yếu tố đến hoạt độ enzym chủng Trichoderma atroviride 28 3.2.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 28 3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng độ ẩm đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase 29 CHƢƠNG 4: ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 4.1 Kết Luận 30 4.2 Kiến Nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC VIẾT TẮT STT Ký hiệu Chú thích DNS 3,5 – dinotrosalicylic axit MT Môi trƣờng OD Mật độ quang ΔOD Hệ số mật độ quang mẫu thử thứ thứ khơng TB Giá trị trung bình DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Nguồn chất enzyme chitinase 10 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng thời gian đến họat độ enzyme chitinase 23 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng cacbon đến hoạt độ chitinase thu từ chủng Trichodermaatroviride 25 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nguồn Nito đến hoạt độ chitinase thu từ chủng Trichoderma atroviride 26 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng 27 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ chitinase 28 Bảng 3.5 Hoạt độ enzym chitinase thu từ chủng Trichoderma atroviride 29 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng độ ẩm môi trƣờng đến hoạt độ chitinase 29 DANH MỤC HÌNH Hình 1.2 cấu trúc chitin 11 Hình 3.1 Đồ thị ảnh hƣởng MT rắn MT lỏng đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma atroviride theo thời gian 24 Hìnnh Phản ứng chitinase với DN 25 Hình 3 phản ứng chitinase với DN 26 Hình 3.4.Ảnh hƣởng chất cảm ứng đến hoạt độ chitinase 27 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ chitinase 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Chitin phân bố rộng rãi tự nhiên, polysaccharide phổ biến thứ hai sau cellulose Nó chuỗi polymer chứa đơn phân Nacet lglucosamine đƣợc liên kết liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng phân tử cao, khơng hịa tan nƣớc dung mơi hữu khác Enzyme chitinase enzym có nhiều ứng dụng quan trọng nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt lĩnh vực sản suất thuốc phòng chống sâu bọ, dƣợc phẩm Hiện na , ngƣời ta nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từ nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm Tuy nhiên, đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều có khả tổng hợp chitinase cao thuộc chủng Trichoderma Với nhiều ƣu điểm nhƣ d nuôi cấ , sinh trƣởng phát triển nhanh, sản xuất đƣợc nhiều enzyme thời gian ngắn Trichoderma đƣợc sử dụng phổ biến để nuôi cấy thu chitinase Để ứng dụng chitinase từ chủng Trichoderma phân lập Việt Nam cơng nghiệp, việc tìm cách thu nhận tốt nhằm thu chitinase có hoạt độ cao công việc cần thiết Đồng thời việc nghiên cứu để tìm điều kiện tốt để ứng dụng thu chitinase đạt đƣợc hiệu cao có ý nghĩa Với thực trạng mghiên cứu tiềm ứng dụng enzyme chitinase tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh enzym chitinase từ chủng Trichodrema atroviride phân lập Núi Luốt Đại Học Lâm Nghiệp” CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan Enzyme chitinase 1.1.1 Giới thiệu Enzyme chitinase Enzyme Chitinase (poly (1,4 acetyl- β- glucosaminide) glucanhydrolase) enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase thủy phân liên kết (1,4-N-acetyl-βglucosaminide (β-1,4- GlcNAc) chitin Enzyme Chitinase đƣợc tạo từ nhiều sinh vật, từ lồi có thành phần cấu trúc chitin nhƣ nấm, côn trùng, giáp xác, đến loại khơng có chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật…Ở sinh vật chứa chitin, enzyme chitinase đóng vai trị q trình phát sinh hình thái thành tế bào Các sinh vật khác tổng hợp enzyme chitinasvới mục đích khác Vi khuẩn tổng hợp chitin để phân hủy chitin tạo nguồn carbon Ở thực vật động vật enzyme chitinase nằm hệ thống chống lại tác nhân gây bệnh nhƣ nấm cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin nấm Cơ chất enzyme chitinase chitin số dẫn xuất Chitin Pol saccharide đƣợc tạo thành nhờ liên kết β-1,4 đơn phân Ncetyglucosamine, dạng Polysaccharide phổ biến tự nhiên Chitin thành phần chủ yếu cấu trúc xƣơng ngồi loại trùng, vỏ giáp xác thành tế bào nấm Chitin có hoạt tính hóa học thấp, mầu trắng, cứng có chứa nitrogen, chitin không tan nƣớc hầu hết dung môi hữu cơ, tan hexa fluro isopropanol, hexa fluroacetone… Hàm lƣợng nitrogen chitin chiếm từ 58% Trong môi trƣờng base, chitin bị deacetyl tạo thành chitosan 1.1.2 Phân loại chitinase Các nhà khoa học phân chitinase thành loại: Dựa vào cấu trúc phân tử, dựa vào trình tự amino acid, dựa vào phản ứng cắt  Dựa vào cấu trúc phân tử Chitinase đƣợc xếp vào họ Glycohydrolase (enzym thủ phân đƣờng): Họ Glycohydrolase 18 Là họ chitinase lớn với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm xoắn α/β cuộn tròn, đƣợc tìm thấy nhiều loại sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng, hữu nhũ virus Họ bao gồm chủ yếu enzyme chitinase, cịn có enz me khác nhƣ chitodextrinase, chitobiase Nacetylglucosaminidase Trong họ này, chitinase từ prokaryote có trình tự ngắn đƣợc bảo tồn cao (bao gồm gốc acid glutamic đƣợc bảo tồn) giống với enzyme eukaryote (10% toàn gốc giống nhau) Tuy nhiên, loại chitinase có domain xúc tác barrel (βα)8 Trong enzyme, rãnh gắn chất nằm đầu C sợi β cấu trúc barrel (βα)8 gốc acid glutamic cho proton xúc tác có vị trí tƣơng đƣơng hông giống với glycoside hydrolase khác, chitinase họ 18 có chế phản ứng bất thƣờng bao gồm việc tác động lên nhóm N-acetyl chất nguyên tử C anomer Việc dẫn đến việc tạo chất trung gian bao gồm vòng pyranose glucosamine kết hợp với vịng oxazoline Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 Họ Glycohydrolase 19 - Chuẩn bị môi trƣờng với nguồn cacbon khác au tiến hành cấy chủng vào mơi trƣờng - Nuôi chủng tủ ấm với nhiệt độ 30 - Sau 72h, dich enzyme tiến hành đo hoạt độ chitinase để xác định đâu nguồn cacbon sinh hoạt độ chitinase cao 2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nito đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng Trichoderma atroviride[12]  Nguyên tắc: Dựa vào phƣơng pháp đo hoạt độ má đo quang phổ OD để xác định nguồn Nito thích hợp sinh hoạt độ cao chủng Trichoderma atroviride Sử dụng nguồn nito khác cao nấm men, pepton, Tiến hành nghiên cứu theo bƣớc sau: - Chuẩn bị môi trƣờng với nguồn Nito khác sử dùng nguồn cacbon đƣợc xác định để tiến hành khảo sát nguồn Nito au tiến hành cấy chủng vào môi trƣờng - Nuôi chủng tủ ấm 30 - Sau 72 dịch enzyme tiến hành đo hoạt độ enz me chitinase để xác định đâu nguồn cacbon sinh hoạt độ chitinase cao 2.4.4 hảo sát ảnh hưởng h m ượng chitin đến sinh tổng hợp chitinase chủng Trichoderma atroviride Dựa vào phƣơng pháp đo hoạt độ má đo quang phổ OD để xác định hàm lƣơng chitin thích hợp sinh hoạt độ chitinase cao chủng Trichoderma atroviride Sử dụng nguồn hàm lƣợng (chitin) khác là: 5, 10, 15, 20 % Tiến hành nghiên cứu theo bƣớc sau: - Chuẩn bị môi trƣờng với hàm lƣợng chitin khác au tiến hành cấy chủng vào mơi trƣờng 19 - Nguồn nito, cacbon đƣợc xác định dùng để tiến hành thu hoạt độ chitinase chủng Trichoderma atroviride - Nuôi chủng tủ ấm 30 - Sau 72 dịch enzyme tiến hành đo hoạt độ enz me chitinase để xác định đâu nguồn cacbon sinh hoạt độ chitinase cao 2.4.5.Khảo sát ảnh hƣởng yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase 2.4.5.1.Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng Trichoderma atroviride Sử dụng MT nuôi cấy thời gian 72h , hàm lƣợng chitin, nguồn cacbon,nito thích hợp đƣợc khảo sát nhiệt độ môi trƣờng 20 , 25 30 , 35 ,40 Sau thu dịch enzyme chitinase tiến hành xác định hoạt độ chitinase 2.4.5.2.Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng Trichoderma atroviride Sử dụng MT nuôi cấy thời gian 72 giờ, hàm lƣợng chitin, nguồn cacbon, nito nhiệt độ thích hợp đƣợc khảo sát xác định độ ẩm 50, 55, 60, 65,70,75% au tiến hành au thu dịch enzyme chitinase tiến hành xác định hoạt độ chitinase 2.4.6 Phƣơng pháp xác định hoạt độ chitinase 2.4.6.1 Phương pháp xác định hoạt độ chitinase đường đường phân giải Ngun tắc: Khi chitinase có mặt mơi trƣờng chứa chitin phân giải chitin thành N- acetyl glucosamine cấu trúc mạch ngắn không bắt màu với thuốc thử lugol Khi tác dụng với thuốc thử lugol, độ lớn phần mơi trƣờng suốt (vịng phân giải) phản ánh hoạt tính chitinase chủng Đo đƣờng kính vịng phân giải đẻ xác định hoạt tính chitinase Cách tiến hành: Dùng khoan nút chai (d= 0,9 cm) vô trùng, khoan lỗ thạch MT nuôi cấy chủng đĩa peptri Dùng pipet vơ trùng 100µl dịch 20 enzyme thô vào lỗ khoan Giữ hộp peptri nhiệt độ phòng đến ngày, cho thử lugol vào Xác định hoạt tính chitinase thuốc thử lugol đo kích thƣớc vịng phân giải (D-d, cm) với D đƣờng kính vịng phân giải Nếu D – d ≥ 2,5 cm: hoạt tính enzyme mạnh D – d ≥ 2,0 cm: hoạt tính enzyme mạnh D – d ≥ 1,5 cm: hoạt tính enzyme trung bình D – d ≤ 1,0 cm: hoạt tính enzyme yếu 2.4.6.2.Xác định hoạt độ enzym chitinase phương pháp DNS Nguyên tắc: Hoạt tính chitinase đƣợc xác định dựa lƣợng đƣờng khử N-acetyl-β-D- Glucosamine sinh phản ứng thủy phân Khi cho chitinase tác dụng với chất dung dịch, N- acetyl-β- D- Glucosamine sinh phản ứng đƣợc định lƣợng qua phản ứng với thuốc thử DNS (3,5- dinitrosalisylic acid), cho sản phẩm 3- amino- nitrosalicylic acid hấp thụ ánh sáng khả kiến bƣớc sóng 535nm Tiến hành: Dịch enz me đƣợc chiết tách dung dịch đệm , thu dịch lọc, li tâm dịch lọc với tốc độ 600 vòng/phút vòng 15 phút, thu dịch enzym thô.cho vào ống nghiệm hỗn hợp 1ml dịch enzym thô + 1ml dd chitin 1% Ủ lắc 50°C vòng 60 phút Ngƣng phản ứng 1ml NaoH 1N đun sơi cách thủy vịng phút Ly tâm 4000 vòng/phút vòng phút, thu dịch thủy phân enzym bỏ cặn, au cho vào 1ml dd DN 1% lắc đều, đun sôi cách thủy vòng phút, làm lạnh nhanh Thêm ml nƣớc cất lắc đo OD bƣớc sóng 535 nm Lƣợng glucosamine sinh đƣợc xác định dựa theo đƣờng chuẩn N- acetyl-β-D- Glucosamine Một đơn vị hoạt tính chitinase (đvht) lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol N-acetyl-β-DGlucosamine (NAG) từ phản ứng thủ phân chất chitin thời gian phút nhiệt độ 40° 21 2.4.7 Xác định đƣờng khử DNS Xây dựng đƣờng khử bổ sung ml thuốc thử DNS (5,3g DNS + 9,9g NaOH + 153g K- Na- tartrat + 4,15g Na2S2O5 + 708ml H2O) vào 0,5ml mẫu đƣờng glucose, đun sôi phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấp thụ bƣớc sóng 535 nm, dựa vào đồ thị đƣờng chuẩn Glucosamine suy hoạt độ chitinase mẫu ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE BIỂU DIỄN MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ΔOD VÀ HÀM LƢỢNG GLUCO AMINE 0,9 y = 1,3107x - 0,0086 R² = 0,9878 0,8 0D 535 nm 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 Hàm lượng glucosamine ( u/ml) Hoạt tính chung (HTC) = (đvht/g CPE ) (CT1)[11] Trong đó: X: hàm lƣợng glucosamine (μg /ml) dịch thí nghiệm pha lỗng K: hệ số pha lỗng V: thể tích dịch enz me ban đầu (ml) v: thể tích enzyme TN (ml) t: thời gian phản ứng (phút) Hoạt độ riêng ( HTR) = (CT2) Trong đó: C: Nồng độ dịch enzyme (mg/ml) HTC: Hoạt tính chung 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết ảnh hƣởng ôi trƣờng nguồn Nito Cacbon đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma atroviride Các điều kiện nuôi cấ nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, pH, độ ẩm có ảnh hƣởng lớn đến sinh trƣởng, tạo bào tử nhƣ khả tạo enzym Do việc tìm điều kiện ni cấy thích hợp thu chitin cần thiết 3.1.1 Ảnh hưởng MT đến trình sinh tổng hợp enzyme chitinase Để chọn mơi trƣờng thích hợp cho chủng Trichoderma atroviride sinh tổng hợp chitinase, tiến hành xác định hoạt độ chitinase chủng Trichoderma atroviride nghiên cứu MT1 MT 120 Sau 24, 48, 72, 96, 120 nuôi cấy tiến hành xác định hoạt độ chitinase Kết trình bày hình 3.1., bảng 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng ôi trƣờng thời gian đến họat độ enzyme chitinase Thời gian Hoạt độ chitinase (U/ml) 24 48 72 96 120 Môi trƣờng lỏng 3,015 6,082 7,27 3,702 3,105 Môi trƣờng rắn 3,5 6,9 7.64 3,9 3,244 MT 23 Hình 3.1 Đồ thị ảnh hưởng MT rắn MT lỏng đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma atroviride theo thời gian Kết cho thấy: Ở MT MT 2, hoạt tính chitinase tha đổi rõ rệt theo thời gian nuôi cấ Tăng mạnh sau 24 nuôi cấ đạt cực đại 72 giờ, đến 96 hoạt tính giảm dần điều chứng tỏ, thời gian đầu chủng nghiên cứu đồng hoá mạnh nguồn cacbon nito để hấp thụ để gia tăng sinh khối Sau 48 lƣợng sinh khối MT tăng nhiều, mà nguồn dinh dƣỡng d hấp thụ cạn kiệt, vậ thúc chủng Trichoderma atroviride tiếp tục tổng hợp chitinase để phân giải nguồn chitin có mơi trƣờng sau 72 nuôi cấy hoạt độ chitinase đƣợc ghi nhận cao au nguồn chitin MT phân cắt hết đồng thời sản phẩm cuối nhƣ N- acetyl- D glucosamine có nhiều MT gâ ức chế ngƣợc lại trình sinh tổng hợp chitinase nên hoạt tính chitinase có xu hƣớng giảm Từ biểu đồ nhận thấ mơi trƣờng rắn có hoạt độ 72 so với môi trƣờng lỏng cao Từ chọn mơi trƣờng rắn môi trƣờng đƣợc sử dụng để tiến khảo sát yếu tố khác Theo tác giả Phạm Thị Lịch, Trần Thanh Thủy, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzym chitinase thô từ chủng Trichoderma SP 24 nghiên cứu nhận thấy mơi trƣờng rắn chủng Trichoderm SP có hoạt độ chitinase cao so với môi trƣờng lỏng.[11] 3.1.2 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon Hìnnh 3.2 Phản ứng chitinase v i N Bảng 3.2: Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng cacbon đến hoạt độ chitinase thu từ chủng Trichodermaatroviride Nguồn cacbon Hoạt độ chitinase (UI/ml) Saccharose Lactose Glucose 7,913 7,043 7,730 Kết cho thấy ba nguồn cacbon saccharose, lacatose, glucose có hoạt độ chitinase cao Trong đó, hoạt độ enzym chitinase nguồn cacbon saccharose 7,913 (U/ml) cao so với nguồn cacbon lại chứng tỏ nguồn cacbon phù hợp nuôi cấy sinh enzyme chitinase chủng Trichoderma atroviride từ nguồn saccharose 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn Nito 25 Hình 3.3 phản ứng chitinase v i DNS Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nguồn Nito đến hoạt độ chitinase thu từ chủng Trichoderma atroviride Nguồn nito Cao nấm men Pepton 8,290 7,7299 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 7,460 Sau nghiên cứu tìm nguồn cacbon phù hợp với chủng Trichoderma atroviride từ nguồn saccharose Tiến hành xác định nguồn nito thích hợp chủng Trichoderma atroviride kết việc tha đổi nguồn Nito nhận thấy bảng 3.3 Ở MT tha đổi nguồn Nito từ nguồn cao nấm men, pepton, , kết MT chứa hàm lƣợng cao nấm men cao 8,290 (U/ml) MT chứa hàm lƣợng Pepton, thấp so với MT chứa hàm lƣợng cao nấm men Từ nhận thấy MT chứa hàm lƣợng cao nấm men thích hợp để ni cấy chủng Trichoderma atroviride sinh hoạt độ chitinase cao 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng Tiến hành nuôi chủng Trichoderma atroviride MT tha đổi hàm lƣợng chitin thô từ 5; 10; 15; 20% Sau ngày nuôi cấy, tiến hành xác định hoạt độ chitinase Kết đƣợc minh họa bảng hình sau 26 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng 10 15 20 Hoạt độ chitinase (U/ml) 4,53 8,5 7,3 5,44 Hoạt độ chitinase (u/ml) Hàm lƣợng Chitinase (%) 0 10 15 20 25 Hàm lượng chitinase (%) Hình 3.4.Ảnh hƣởng chất cảm ứng đến hoạt độ chitinase Kết cho thấy, bổ sung 5% chitin thơ vào MT hoạt độ chitinase thấp Điều chứng tỏ khơng có hàm lƣợng q thấp lƣợng chất nà không đủ để Trichoderma atroviride vừa tổng hợp enz me hi tăng nồng độ chất vào MT hoạt độ chitinase tăng lên rõ rệt hàm lƣợng chitin 10% hoạt độ chitinase 8,5 (U/ml) Tuy nhiên hàm lƣợng 20%, hoạt độ chitinase giảm mạnh, điều cho thấy tăng lƣợng chất vào MT cao, pha tăng trƣởng chủng kéo dài hơn, sản phẩm cuối thứ cấp tích tụ nhiều gâ ức chế tổng hợp chitinase Trong đó, hàm lƣợng chitin từ 1% đến 1,5% khoảng thích hợp cho enzyme chitinase với hoạt độ cao 27 Tác giả Lê Thị Huệ [8,9] nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma atroviride kết luận nồng độ chitin khoảng 10%-15% hoạt độ chitinase đạt mức độ cao, thích hợp nồng độ 10% Tác giả Đinh Minh Hiệp [10] nghiên cứu nồng độ chất cảm ứng bổ sung vào MT nuôi cấy Trichoderma atroviride để thu chitinase kết luận nồng độ chitin thơ 10% thích hợp cho trình tăng trƣởng sinh tổng hợp enzym chitinase Xem xét nghiên cứu tác giả, so sánh vào giá trị hoạt độ chitinase đạt đƣợc hàm lƣợng TN Đồng thời nhằm tiết kiệm nguyên liệu định chọn hàm lƣợng chitin 10% để tiến hành TN sau 3.2 Kết khảo sát yếu tố đến hoạt độ enzym chủng Trichoderma atroviride 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt độ chitinase Nhiệt độ (°C) Hoạt độ chitinase Hoạt độ chitinase (u/ ml ) (U/ml) 20 25 30 35 40 4,663 8,050 8,862 7,364 3,980 10 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (°C) Hình 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ chitinase 28 Kết cho thấy chủng Trichoderma atroviride sinh tổng hợp enzym chitinase hoạt độ cao tất điều kiện nhiệt độ khảo sát Trong đó, chủng sinh enzym chitinase hoạt độ cao khoảng nhiệt độ 25- 35°C cao 30°C Kết phù hợp với nghiên cứu Lê Thị Huệ [8] khoảng nhiệt độ tối ƣu cho Trichoderma tổng hợp chitinase 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase Bảng 3.5 Hoạt độ enzym chitinase thu từ chủng Trichoderma atroviride Độ ẩm (%) 50 55 60 65 70 75 4,47 6,997 9,2 8,05 6,00 3,58 Hoạt độ chitinase Hoạt độ Chitinase (U/ml) (U/ml) 10 50 55 60 65 70 75 Độ âm Bảng 3.5 Ảnh hƣởng độ ẩ ôi trƣờng đến hoạt độ chitinase Kết cho thấy khoảng độ ẩm MT ban đầu thích hợp cho chủng Tri.3 tổng hợp enzyme chitinase hoạt độ cao 55 – 65%, đạt cao mức 60% Độ ẩm MT 70% hoạt độ chitnase giảm mạnh đáng kể Qua kết chọn độ ẩm MT nuôi cấy ban đầu 60% 29 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết Luận Sau trình làm nghiên cứu rút kết luận sau: - Đã xác định đƣợc mơi trƣờng ni cấy thích hợp chủng Trichoderma atroviride sinh trƣởng tổng hợp chitinase môi trƣờng rắn - Đã xác định đƣợc hàm lƣợng Nito cacbon thích hợp để tiến hành ni cấy chủng Trichoderma atroviride Nguồn cacbon saccharose, nguồn Nito cao nấm men hàm lƣợng chitin 10% thu đƣợc hoạt độ chitinase cao - Đã xác định đƣợc yếu tố nhiệt độ 30ᵒ C thời gian 72 giờ, độ ẩm 60% thích hợp cho hoạt độ chitinase tăng lên chủng Trichoderma atroviride 4.2 Kiến Nghị -Tiếp tục nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase số chủng khác -Tiếp tục nghiên cứu khả ứng dụng rộng rãi enz me nà lĩnh vực sản xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt hƣu phƣơng Yến Anh (2007 ), nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Luận văn Thạc sĩ inh Học, Trƣờng Đại Học sƣ Phạm TP Hồ Chí Minh Trƣơng Phƣớc Thiên Hồng (2007), Khảo sát hoạt tính số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ loại đất khác thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ CHí Minh Trần Thanh Thùy (1998), hưỡng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB Giáo dục Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase Trichoderma vai trị kiểm sốt sinh học công nghệ TP HCM, tr 153-160 Tơ Du hƣơng (2004), Khảo sát hoạt tính số hệ enzyme thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng trichoderma phân lập từ loại đất khác nhâu thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ, Luận văn Thạc sĩ inh Học, Trƣờng Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh Nguy n Lân Dũng, Ngu n Đìm Qu ến, Phạm Văn T (1998), Vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguy n Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm vi nấm NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Các tác giả Lê Thị Hồng Thƣơng, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu Cơng trình nghiên cứu khảo sát số yếu tố tác động lên trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase chủng nấm mốc Trichodrema Lê Thị Huệ năm 2010 Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichodrema 10 Đinh Minh Hiệp 2012 nghiên cứu chitinase β-glucanase từ Trichoderma spp 11 Theo tác giả Phạm Thị Lịch, Trần Thanh Thủy, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzym chitinase thô từ chủng Trichoderma SP Tài liệu tiếng anh 12 A.A Shubakov and P S Kucheryavykh (2004), chitinolytic Activity ofnFilamentos Fungi Applied Biochermistry and Microbiology Vol 40 No 5, p 445- 447 31 32 PHỤ LỤC MT MT Hình ảnh của MT bán rắn MT lỏng đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma atroviride Hình ảnh nhiệt độ đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma atroviride saccharose Cao nấm men Hình ảnh nguồn cacbon ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme chitinase Hình ảnh nguồn Nito ảnh hƣởng đến hoạt độ enzyme chitinase 10% Hình ảnh hà lƣợng chitin t i hoạt độ enzyme chitinase ... mghiên cứu tiềm ứng dụng enzyme chitinase tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh enzym chitinase từ chủng Trichodrema atroviride phân lập Núi Luốt Đại Học Lâm Nghiệp? ??... sinh enzyme chitinase từ chủng Trichoderma atrovirid (Tri 3) 2.2.Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả sinh enzyme chitinase từ chủng Trichoderma atroviride... atroviride (Tri 3) Nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấ đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase 2.3.Đối tƣợng, hóa chất, vật liệu thiết bị 2.3.1.Đối tượng nghiên cứu Trichoderma atroviride (Tri