Ốc cối thuộc họ ốc phân bố rộng ở vùng biển nhiệt đới. Trong công trình này, 3 loài ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum thu được từ ven biển Khánh Hòa được nghiên cứu dưới các khía cạnh: khối lượng các bộ phận của tuyến độc, thành phần conopeptid và thử nghiệm độc tính trên chuột. Kết quả cho thấy mỗi loại ốc cối có lượng peptid khá lớn từ 50 đến trên 100 loại.
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2012 THÔNG BÁO KHOA HỌC ĐỘC TỐ ỐC CỐI VEN BIỂN MIỀN TRUNG VIỆT NAM: CẤU TẠO TUYẾN ĐỘC TỐ VÀ ĐẶC TRƯNG VỀ SỐ LƯỢNG CONOPEPTID CONOTOXIN FROM CONUS IN THE CENTRE OF VIETNAM: VENOM APPARATUS AND PROFILE OF CONOPEPTIDES Ngô Đăng Nghĩa1, Nguyễn Thanh Sơn2 Nguyễn Anh Phương3, Lâm Thành Hưng4 Ngày nhận bài: 05/6/2012; Ngày phản biện thơng qua: 13/6/2012; Ngày duyệt đăng: 12/9/2012 TĨM TẮT Ốc cối thuộc họ ốc phân bố rộng vùng biển nhiệt đới Trong cơng trình này, lồi ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum thu từ ven biển Khánh Hịa nghiên cứu khía cạnh: khối lượng phận tuyến độc, thành phần conopeptid thử nghiệm độc tính chuột Kết cho thấy loại ốc cối có lượng peptid lớn từ 50 đến 100 loại Từ khóa: conopeptide, ốc cối, tuyến độc tố, sinh học thần kinh ABSTRACT Conus is the family distributed in the tropical marine areas In this study, three species of Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum collected in the coastal area in the Khanh Hoa province were studied under different aspects that were the weigh of the venom system, quantity of conopeptides and toxic property in mouse The results shown that every venom of species consited of from 50 to over 100 different peptides Keywords: conopeptide, conus, venom apparatus, neroscience I ĐẶT VẤN ĐỀ Mỗi loại độc tố ốc hỗn hợp chứa 100 loại Ốc cối (Cone snails) nhóm lớn, peptide khác Khi giải mã gen, người ta thấy ghi nhận khoảng 700 loài, có phân bố độc tố propeptid, sau chúng rộng, thuộc họ Conidae Chúng săn mồi enzym endoprotease phân cắt để tạo thành hệ thống nọc độc phát triển cao làm tê liệt peptid độc cuối Các peptid có kích thước mồi vài giây, nhờ đảm bảo bắt mồi nhỏ, tương đối dễ tổng hợp, cấu trúc ổn định, tác tránh để mồi lộ lâu bị cá lớn dụng vào mục tiêu chuyên biệt làm cho chúng giành Mỗi loài ốc cối sản sinh loại độc trở thành đầu dò (probe) lý tưởng dược tố riêng Đó hỗn hợp peptid ngắn, có học Một điều ngạc nhiên đa số độc tố ốc liên kết disunfua, có khả làm bất động mồi có liên quan giảm đau đớn dùng nhanh Độc tố tùy thuộc vào loại mồi cá trị liệu giảm đau Người ta ước lượng có khoảng (piscivorous species), nhuyễn thể (molluscivorous 50.000 đến 100.000 loại conopeptide species) hay sâu (vermivorous species) (Richard khoảng 0,1% biết rõ dược tính Số J.Lewis 2009, Heinrich 2004) độc tố lớn lao nguồn vật liệu dồi cho Các peptid chia thành loại conotoxin việc nghiên cứu dược tính ứng dụng Các độc tố (gây tử vong) conopeptid ( không gây tử vong) tác dụng lên kênh canxi (ω-conotoxin), natri PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, 2CN Nguyễn Thanh Sơn, 3CN Nguyễn Anh Phương: Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường - Trường Đại học Nha Trang TS Lâm Thành Hưng: Laboratoire de Neurobiologie CNSR, Pháp 36 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2012 (μ-, μO- δ- conotoxin) kali (κ- conotoxin), chất Sau đem ly tâm, loại bỏ cặn thu dịch lọc Làm vận chuyển norepinephrine (χ-conopeptide), thụ lạnh -200C sau đem đông khô dịch thể (receptor) acetylcholine nicotinic (α-conotoxin), lọc 24 ta thu độc tố ốc thô α1-adrenoceptor (ρ-conopeptide), thụ thể NMDA 2.2 Chuẩn bị mẫu phân tích cho HPLC/MS (conantokins), thụ thể vasopressin (conopressin) thụ thể neurotensin (contulakins) Lấy 2mg độc tố thô thêm 0,25ml pha động A (TFA 1%), 0,25ml pha động B (ACN:H2O = 9:1) cho Độc tố ốc cối phân thành nhóm vào ống ly tâm có đầu lọc, đầu lọc cho (superfamily) (A-, M-, O-, P-, S-, T-) dựa phân tử có khối lượng 10.000 Da qua Sau khung cystein chúng, tương đồng trình đem ly tâm lạnh 10.000 vòng/phút tự pre-pro gen, kiểu cuộn tác dụng sinh lý Lấy 200μl dịch sau ly tâm thêm 400μl pha động A, Chúng biết có hoạt tính giảm đau, chống động 400μl pha động B đem phân tích máy sắc ký kinh, bảo vệ tim, bảo vệ thần kinh, chúng lỏng cao áp (HPLC) Hóa chất sử dụng thuộc trở nên cơng cụ hữu ích nghiên cứu loại dùng cho HPLC ung thư, thần kinh rối loạn tâm lý (Jon-Paul 2.3 Xác định phổ peptid độc tố conotoxin Bingham, 2010) Ở nước ta có khoảng 76 lồi ốc cối thu thập (Hylleberg cs, 2003) chưa nghiên cứu nhiều độc tính Cơng trình nhằm khảo sát bước đầu cấu tạo tuyến độc tố đặc trưng phổ sắc ký tồn thể peptid có khối lượng phân tử 10.000 dalton từ độc tố ba loài ốc cối phổ biến vùng biển Khánh Hòa vùng biển miền Trung Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Mẫu ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum thu thập vùng biển Nha Trang - Khánh Hịa, rửa sạch, thấm khơ cất giữ - 700C trước phân tích HPLC Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với detector UV-VIS, cột sắc ký ngược pha RP C18 (Thermo sicentific, Mỹ), 150 x 4,6mm nhồi RP-18 cỡ 5μm Pha động: Dung dịch ACN:H2O = 9:1; TFA 1% Detector UV-VIS: bước sóng 254nm Lưu lượng dịng: 0,5mL/phút Thể tích tiêm: 20μl/ lần thí nghiệm Nhiệt độ sắc ký: nhiệt độ phịng Khảo sát chương trình chạy gradient thời gian 60, 90 120 phút III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Cấu tạo đặc trưng khối lượng tuyến độc tố Kết giải phẫu hình cho thấy cấu tạo tuyến độc tố bao gồm phần túi nọc độc, thường có kích thước lớn nhất, đến ống dẫn có đường kính nhỏ chiều dài lớn, tận vòi hút túi chứa chitin Khác với cơng Phương pháp nghiên cứu trình Jennifer 2002 J.Benjamin Franklin 2007 2.1 Giải phẫu tách tuyến nọc độc mô tả chi tiết cấu tạo phận, cơng trình Ốc rửa sạch, để nước, dùng búa đập vào đặc trưng khối lượng phận vỡ vỏ ốc, gắp nội quan cho vào đĩa petri Dùng dao tuyến độc tố Khối lượng phận tuyến mổ kéo cắt vị trí chứa tuyến nọc độc Mọi thao độc tố cho bảng hình Khối lượng tuyến tác giải phẫu tiến hành túi đá lạnh để độc tố C.striatus lớn gấp ba C.vexillum đảm bảo giữ nguyên tính chất sinh học tuyến lớn gấp hai lần tuyến độc tố C.textile Trong nọc độc Sau tách tuyến nọc độc dùng loài, tỷ lệ phận không giống panh, dao nhọn kéo cắt nhỏ, nghiền nhuyễn Loài C.striatus có khối lượng tuyến độc dung dịch TFA:ACN = 1:1 để hòa tan độc tố lớn ống dẫn lại ngắn có khối lượng nhỏ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 37 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2012 0,14g so với lồi C.textile, 0,26g Khối lượng vịi hút lại giống từ 0,19 - 0,21g Hình Cấu tạo tuyến nọc độc Conus textile Túi kitin (Dr), ống dẫn (Od), túi nọc độc (Td), vòi hút (Vh) Bảng Khối lượng trung bình tuyến nọc độc loài ốc cối, số cá thể loài n=10 Túi độc (g) Ống dẫn (g) Túi kitin (g) Vòi hút (g) KL tuyến độc cá thể (g) Conus textile 0,46 ± 0,11 0,26 ± 0,08 0,07 ± 0,05 0,21 ± 0,04 1,00 ± 0,22 Conus striatus 2,87 ± 0,27 0,14 ± 0,02 0,04 ± 0,01 0,21 ± 0,10 3,25 ± 0,36 Conus vexillum 1,38 ± 0,44 0,28 ± 0,07 0,03 ± 0,01 0,19 ± 0,06 1,88 ± 0,55 Lồi Hình Khối lượng phận tuyến độc loài ốc cối C.textile, C striatus C.vexillum Kết cho thấy vai trò ống dẫn nọc không đơn vận chuyển Qua độ dài bất thường nó, thấy có q trình sinh hóa tạo nên độc tố xảy ống dẫn (Jennifer Marshall, 2002) Điều cần có q trình hình thành tạo nên đa dạng peptid Phổ peptid từ độc tố ốc cối Để đánh giá mức độ đa dạng peptid nghiên cứu chuyên sâu vi phẫu độc tố thô, mẫu lọc để thu peptid có thuật mà cịn nghiên cứu sinh hóa để làm rõ khối lượng phân tử nhỏ 10.000 dalton 38 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2012 nhóm có tính chất sinh học đáng ý Để tìm peak rõ Do chế độ chọn để chế độ chạy gradien tốt nhất, thời gian thử chạy độc tố cho ba lồi Đây thí nghiệm ban 60, 90 120 phút Kết cho hình cho thấy đầu cho thơng tin số lượng vị trí chế độ chạy gradien 120 phút cho phân tách peak mà chưa định danh xác a b c Hình Phổ sắc ký đồ Conus textile thời gian chạy gradient khác nhau, a:60, b:90 c:120 phút TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 39 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Conus striatus Conus textile Conus vexillum Hình Phổ sắc ký đồ ba loài ốc cối C striatus, C textile C.vexillum Chế độ chạy HPLC gradien 120 phút 40 ❖ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Số 3/2012 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Dựa phổ sắc ký lồi ốc, nhận thấy lọc tách phần protein có khối lượng phân tử cao 10.000 Da, phần cịn lại có thành phần phức tạp Số lượng peak nhiều thời gian lưu khác nhau, cường độ hấp thụ UV khác diện tích khác cho thấy loại, số lượng loại peptid chất độc loài ốc phong phú đa dạng Sơ nhận thấy số lượng peptid mẫu độc tố từ 50 100 loại khác Điều phù hợp với tác giả nước Để xác định loại peptid phổ cần nghiên cứu sâu Cả lồi có peak xuất rõ cao thời gian lưu 37 72 phút Soá 3/2012 Để định danh loại conotoxin dịch độc tố này, cần tiến hành phân tích khối phổ giải trình tự protein, sau thử nghiệm lại độc tính thử nghiệm sinh học khác Trong khuôn khổ đề tài bảo tồn nguồn lợi gen, nghiên cứu dừng lại kết bước đầu phân tích đánh giá nguồn gen IV KẾT LUẬN Kết cho thấy cấu tạo tuyến độc tố ba loài ốc cối thu đặc trưng họ ốc cối sơ cho thấy số lượng peptid độc tố loài phong phú Các độc tố nguồn cung cấp peptid đa dạng cho nghiên cứu sinh học thần kinh nước ta TÀI LIỆU THAM KHẢO Heinrich Terlau and Baldomero M.Olivera (2004) Conus Venoms: A rich source of Novel Ion Channel-Targeted Peptides Physiological Reviews, 84:41-68 Hylleberg, J and Kilburm, R.N (2003) Marine molluscs of Vietnam,Proceeding of 16th International Congress and Workshop, Tropical Marine Molluscs Program (TMMP) Jennifer Marshall, Wayne P.Kelly, Stanislav S Rubakhin, Jon-Paul Bingham, Jonathan V Sweedler, and William F Gilly (2002) Anatomical Correlates of Venom Production in Conus californicus Biological bulletin 203:27-41 Jon-Paul Bingham, Erin Mitsunaga, Zachary L Bergeron (2010) Drugs from slugs-Past, present and future perspectives of ω-conotoxin research Chemico-Biological Interactions, 183: 1-18 Richard J Lewis (2009) Conotoxins: Molecular and Therapeutic in:Targets N.Fusetami and W.Kem (eds), Marine Toxins as Research tools, Progress in Molecular and Subcellular Biology, Marine Molecular Biotechnology 46 Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖ 41 ... giá nguồn gen IV KẾT LUẬN Kết cho thấy cấu tạo tuyến độc tố ba loài ốc cối thu đặc trưng họ ốc cối sơ cho thấy số lượng peptid độc tố loài phong phú Các độc tố nguồn cung cấp peptid đa dạng cho... tách tuyến nọc độc mô tả chi tiết cấu tạo phận, cơng trình Ốc rửa sạch, để nước, dùng búa đập vào đặc trưng khối lượng phận vỡ vỏ ốc, gắp nội quan cho vào đĩa petri Dùng dao tuyến độc tố Khối lượng. .. phút III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Cấu tạo đặc trưng khối lượng tuyến độc tố Kết giải phẫu hình cho thấy cấu tạo tuyến độc tố bao gồm phần túi nọc độc, thường có kích thước lớn nhất, đến ống