Tạp chí Nghề cá sông Cửu Long: Số 06/2015 trình bày các nội dung chính sau: Di truyền và sinh học phân tử trong nuôi trồng thủy sản, phân tích hệ phiên mã tôm sú Penaeus monodon, nuôi cấy mô rong sụn (Kappaphycus alvarezii, Doty): Kết quả bước đầu về tạo mô sẹo trong phòng thí nghiệm, ứng dụng vi khuẩn tía quang hợp trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam,... Mời các bạn cùng tham khảo để nắm nội dung chi tiết.
Tiềm hạn chế vaccine sống nhược 65-74 Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân từ moi 108-119 độc kháng bệnh Edwardsiella ictaluri gây biển (Acetes sp.) cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Production of hydrol sate protein powder from Live vaccine against Edwardsiella ictaluri Acetes sp for catfish Pangasianodon hypophthalmus, LÊ HƯƠNG THỦY potential and limit Quy trình cơng nghệ sản xuất alkyl glycerol 120-125 TRẦN HẠNH TRIẾT, NGUYỄN TRỌNG từ sinh vật biển dùng tạo thực phẩm chức BÌNH, LÊ VĂN HẬU, TRẦN KIM HỒNG, akumarin NGUYỄN QUỐC BÌNH Technological process for production of alkyl Ứng dụng công nghệ biofloc nuôi thâm canh 75-83 glycerol from marine organisms for functional tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei) vào foods akumarin phát triển sản xuất CHU QUANG TRUYỀN, CẦM THỊ ÍNH, Application of biofloc technology on intensive HOÀNG THANH HƯƠNG, culture of white shrimp (Litopenaeus vannamei) S.P KASIJANOV, N.A LATYSHEV, for production development PHẠM QUỐC LONG NGUYỄN THỊ THU HIỀN, NGUYỄN VĂN Điều chế phức hợp kháng nguyên từ bán kháng 126-132 HUẤN, VŨ ANH TUẤN, NGUYỄN VĂN KHỎE nguyên domoic acid Đa dạng thành phần loài động vật phù du khu 84-96 Making antigen from a hap ten domoic acid vực vùng hạ Long An ĐÀO VIỆT HÀ VÀ PHẠM XUÂN KỲ Diversity on species composition of zooplankton in the lower area of Long An province LÊ THỊ NGUYỆT NGA, PHAN DOÃN ĐĂNG Đặc điểm sinh học sinh sản cá chim đen 97-107 Parastromateus niger (Bloch, 1795) The reproductive biologyof black pomfret Parastromateus niger (Bloch, 1795) MAI VIẾT VĂN VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN DI TRUYỀN VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Trần Thị Thúy Hà*, Lưu Thị Hà Giang1 TÓM TẮT Trong năm trở lại đây, tiến di truyền sinh học phân tử động vật thủy sản cung cấp thơng tin hữu ích ứng dụng ni trồng thủy sản Vai trị thao tác di truyền sinh học phân tử nuôi trồng thủy sản ngày biết đến rộng rãi Bài viết điểm lại nét ứng dụng di truyền chọn giống, lai tạo, nghiên cứu nhiễm sắc thể, điều khiển giới tính, chuyển gen vai trị sinh học phân tử ni trồng thủy sản Việt Nam Từ khóa: di truyền, nuôi trồng thủy sản, sinh học phân tử I MỞ ĐẦU Thời gian qua, ứng dụng di truyền sinh học phân tử nuôi trồng thủy sản đạt kết đáng ghi nhận Chẳng hạn việc tạo dịng cá rơ phi có sức sinh trưởng tốt khả chống chịu tốt với nhiệt độ thấp hay việc chế tạo kít chẩn đốn bệnh tơm Để nâng cao chất lượng di truyền cho đối tượng thủy sản, kết hợp phương pháp truyền thống phương pháp đại Phương pháp truyền thống kể đến lai xa, hay điều khiển giới tính Cấy chuyển gen hay thao tác nhiễm sắc thể ứng dụng công nghệ sinh học nói chung, sinh học phân tử nói riêng biết đến phương pháp đại Trong đó, thị phân tử dùng công cụ hữu hiệu nghiên cứu định danh loài, đánh giá đa dạng di truyền, tìm hiểu quan hệ huyết thống, lập đồ gen nghiên cứu bệnh động vật thủy sản phục vụ cho nghề nuôi II ỨNG DỤNG CỦA DI TRUYỀN TRONG NI TRỒNG THỦY CHỌN GIỐNG Trong chương trình chọn giống truyền thống, cá thể gia đình chọn theo tính trạng quan trọng để cải thiện giá trị quần thể (các) hệ Việc chọn tiến hành có đủ biến dị di truyền cho (những) tính trạng quan tâm Các phương pháp chọn lọc khác bao gồm chọn lọc cá thể (individual mass selection), chọn lọc gia đình (between family selection), chọn lọc gia đình (within family selection) chọn lọc kết hợp (combined family selection) Mỗi phương pháp có ưu điểm định tùy thuộc vào chất tính trạng chọn lọc nguyên liệu ban đầu cho chương trình chọn giống (Gjerde,1993; Falconer Mackay, 1996; Bourdon, 1999; Gjedrem, 2005) Chọn giống trở nên phức tạp mục đích tạo quần đàn cho suất cao nhiều môi trường ni Thực tế, số dịng/lồi thủy sản có kiểu hình thể tốt điều kiện định tính trạng khác tốt điều kiện khác Điều biết đến mối tương tác kiểu gen - mơi trường Do việc chọn lọc điều kiện cụ thể cần thiết Ở nước ta, năm gần đây, chương trình chọn giống thủy sản tập trung tập trung cho cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá rô phi (Oreochromis niloticus), cá giị (Rachycentron canadum), tơm thẻ chân trắng (Lipopenaeus vannamei), Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản *Email: thuyha@ria1.org TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN tơm sú (Penaeus monodon) cua xanh (Scylla paramamosain) Việc sử dụng thị phân tử để đánh giá nguồn vật liệu ban đầu cần thiết cung cấp thơng tin tính đa dạng kiểu gen mức độ chủng nguồn vật liệu ban đầu Chỉ thị phân tử microsatellite, dựa khác biệt độ dài đoạn lặp khoảng -5 cặp nucleotide, thường sử dụng chương trình Các vị trí microsatellite thể tính đa hình cao, phong phú hệ gen thị đồng hợp trội Phân tích đa hình microsatellite dựa vào kỹ thuật PCR, cần lượng nhỏ mơ, ví dụ từ vẩy cá, đủ lượng DNA cho nghiên cứu (Goldstein Schlotter, 1999; Liu ctv., 2001; Zane ctv., 2005; Alam Islam, 2005; Boris ctv., 2011) Mục đích chọn giống để cải thiện di truyền cung cấp giống tốt phục vụ nuôi trồng thủy sản So với động vật khác, chọn giống đối tượng thủy sản nước ta có thành tựu đáng ghi nhận cá chép (C carpio), cá rô phi (O niloticus), cá tra (P hypophthalmus), tôm thẻ chân trắng (P vannamei), tôm sú (P monodon) Trong tương lai, chọn giống nhiều tiềm việc nâng cao suất, khả chống bệnh, chất lượng sản phẩm cho đối tượng nuôi trồng thủy sản LAI XA Lai xa nhằm cải thiện hiệu suất so với loài bố mẹ Lai loài khác (hybridization) dòng khác biệt loài (crossbreeding) tạo nên tổ hợp allele locus Đôi khi, tổ hợp allele ngẫu nhiên gây tương tác để tính trạng tốt biểu Lai tạo phương pháp chọn giống hiệu lai thể dị hợp tử (Bourdon, 1999; Lakra, 2001; Gjedrem, 2005) Theo hướng này, nghiên cứu cá nước nước ta triển khai thu kết khả quan Chẳng hạn lai cá trê phi (Clarias gariepinus) đực cá trê vàng (Clarias macrocephalus) cho lai vừa tăng trưởng nhanh giống bố, vừa thịt ngon giống mẹ hay lai cá rô phi vằn Israel với cá đực rô phi xanh Israel cá rô phi vằn cho tỷ lệ cá đực cao có triển vọng thực tiễn sản xuất Bên cạnh đó, việc lai tạo khác loài cá biển thu kết đáng ghi nhận qua việc lai cá song vua (Epinephelus lanceolatus) với cá song hổ (Epinephelus fuscoguttatus) Mặc dù vậy, nghiên cứu theo hướng hàu (Crassostrea sp.) cá có giá trị kinh tế khác cần nghiên cứu quan tâm nhằm tạo lai có ưu lai giúp cao suất hiệu kinh tế THAO TÁC NHIỄM SẮC THỂ Đối với nghiên cứu áp dụng thao tác nhiễm sắc thể, dòng quần đàn đơn tính vơ sinh ni trồng thủy sản sản xuất Phương pháp can thiệp vào nhiễm sắc thể nhằm tạo dịng đơn tính đực đơn tính tạo đa bội thể (tam bội tứ bội thể) ứng dụng cho nhiều lồi cá lồi nhuyễn thể Dịng đơn tính sử dụng để sản suất quần đàn toàn loài với mang nhiễm sắc thể quy định tính xác định ngun lý hình thành giới tính cá Dịng đơn tính đực sản xuất quần đàn tồn đực có giá trị thương mại ni trồng thủy sản Phương pháp sử dụng việc tạo dịng phục hồi kiểu hình bị q trình bảo quản tinh đơng lạnh Những cá thể đơn tính đực sản xuất số loài thuộc họ cá chép (Cyprinidae), họ cá rô phi (Cichlidae) họ cá hồi (Salominidae) Tạo đa bội thể việc sản xuất cá thể với nhiễm sắc thể nhiều bình thường (2n) Cá thể đa bội tạo cách xử lý hợp tử tác nhân gây đột biến áp suất thủy tĩnh, nhiệt độ hóa TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN chất Ngay sau trứng thụ tinh, dùng tác nhân tác động vào giai đoạn trung kỳ hai lần giảm phân thu thể tam bội Còn tác động vào giai đoạn tiền kỳ nguyên phân hợp tử cho dạng tứ bội (Beaumont Hoare, 2003; Komen Thorgaard, 2007) Ở nước ta, việc thử nghiệm sản xuất cá thể tam bội đối tượng thủy sản quan tâm Cá thể tam bội thường vơ sinh nhiều trường hợp, có sức sinh trưởng tốt thể lưỡng bội Động vật thủy sản thân mềm hàu cửa sông (Crassostrea rivularis) tập trung nghiên cứu tam bội thể có dấu hiệu thành cơng bước đầu Bên cạnh đó, đối tượng cá cá tra (P hypophthalmus) cá rô phi (O niloticus) thử nghiệm tạo tam bội thể quy mô nhỏ Việc phát triển đàn bố mẹ tứ bội phục vụ cho việc lai tạo với đàn lưỡng bội để sản xuất tam bội thể quan tâm Tuy nhiên, khả sinh trưởng quần đàn tam bội cần quan tâm để giúp thúc đẩy phát triển đối tượng theo hướng thương mại hóa ĐIỀU KHIỂN GIỚI TÍNH Việc sử dụng kỹ thuật điều khiển giới tính để tác động lên lồi có giá trị kinh tế cao trở thành công cụ quan trọng nhằm tăng sản lượng nuôi trồng thủy sản Công nghệ cho phép sản xuất quần đàn đơn tính cơng cụ tiềm cho lồi mà giới tính có giá trị giới tính cịn lại Có hai phương pháp kỹ thuật điều khiển giới tính sử dụng hormone thao tác di truyền Sử dụng hormone hay điều khiển nội tiết tố đồng nghĩa với việc tập trung vào xử lý hợp chất steroid suốt giai đoạn đầu đời trước hình thành giới tính đối tượng thủy sản Thao tác di truyền giúp can thiệp giới tính để sản xuất quần đàn tồn cái, tồn đực vơ sinh coi phương pháp đa bội Việc xác định giới tính thơng qua di truyền phân tử Ở nước ta, kể đến cá rô phi (O niloticus) cá hồi vân (O mykiss), với công nghệ sử dụng hormone để chuyển giới tính, từ cá thành cá đực (cá rô phi) ngược lại từ cá đực thành cá (cá hồi vân) để phục vụ nuôi trồng thủy sản cho suất hiệu cao Thành cơng điều khiển giới tính hai đối tượng đóng góp thành tựu lớn suất, sản lượng hiệu kinh tế Phương pháp di truyền giúp điều khiển giới tính tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) Bằng phương pháp vi phẫu cắt bỏ tuyến androgenic, tôm giả tạo lai với tôm đực khác để tạo quần đàn tơm xanh tồn đực CẤY CHUYỂN GEN Kỹ thuật chuyển gen nhằm đưa số copy gen tiềm vào trứng thụ tinh với mục đích hợp DNA lạ với hệ gen phơi phát triển Bằng việc đưa tính trạng di truyền mong muốn vào động vật thủy sản, đối tượng chuyển gen tốt sản xuất ni trồng thủy sản Những tính trạng bao gồm tốc độ tăng trưởng nhanh, tiêu hóa thức ăn hiệu quả, chịu đựng nồng độ oxy hòa tan thấp nhiệt độ khơng tối ưu Trong đó, tốc độ tăng trưởng tính trạng quan tâm nhiều khả ứng dụng vào thực tiễn cao Mặc dù cơng nghệ cấy chuyển gen có tiềm lớn nuôi trồng thủy sản, Việt Nam nghiên cứu theo hướng nhiều hạn chế Các nghiên cứu theo hướng biết đến chuyển tổ hợp gen hormone sinh trưởng vào cá cảnh thuộc họ Cyprinidae cá chạch bùn (Misgurnus anguillicaudatus) Với số kết bước đầu đạt được, việc nghiên cứu tạo cá chuyển gen cần tiếp tục tiến hành Để phát triển ứng dụng quy mô thương mại, đối tượng chuyển gen cần kiểm tra số vấn đề xã hội kinh tế cần giải trình cụ thể Những phát triển gần sinh học phân tử ví dụ PCR (Polymerase Chain TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Reaction), giải trình tự tự động, dự án lập đồ gen để phục vụ cho nghiên cứu phát triển xa nghiên cứu chuyển gen loài thủy sản III VAI TRỊ CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NI TRỒNG THỦY SẢN Với kết khiêm tốn đạt được, vai trò sinh học phân tử ni trồng thủy sản dần khẳng định Trong đó, thị phân tử coi công cụ hữu hiệu với nhiều ứng dụng Chẳng hạn dùng thị phân tử để định danh cá thể giúp xác định tên khoa học phân loại xác đến loài Trong nghiên cứu này, DNA ty thể cung cấp thơng tin có giá trị để trả lời câu hỏi phát sinh loài, tiến hóa cấu trúc quần thể Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phả hệ đánh giá chất lượng quần đàn bố mẹ chương trình chọn giống, thị phân tử thể nhiều tính ưu việt (Wolfus ctv., 1997; Valles- Jiménez ctv., 2005; Perez-Enriquez ctv., 2009; Artiles ctv., 2011) Bên cạnh đó, thị phân tử giúp đánh dấu cá thể quần đàn nghiên cứu phân biệt cá thể gia đình Một ứng dụng mạnh mẽ cơng nghệ DNA tìm mối liên kết thị phân tử gen liên quan đến tính trạng quan trọng (Quantitative Trait Loci hay QTLs) Khi thị xác định, chương trình chọn giống hỗ trợ đắc lực (Liu Cordes, 2004; Chauhan Rajiv, 2010) Những nỗ lực suốt năm vừa qua cống hiến cho việc phát triển thị phân tử cho nhiều loài thủy sản hỗ trợ trực tiếp cho nghiên cứu QTLs Bên cạnh đó, thị phân tử sử dụng công cụ mạnh, khẳng định thành công can thiệp nhiễm sắc thể Đối với nghiên cứu theo hướng này, nước ta thực chương trình liên quan đến định danh lồi thị phân tử, tìm hiểu đa dạng di truyền quần thể đánh giá biến dị di truyền nguồn vật liệu thuộc chương trình chọn giống cá tra (P hypophthalmus), cá rô phi (O niloticus), cá giị (R canadum), tơm thẻ chân trắng (P vannamei), tôm sú (P monodon) cua xanh (S paramamosain) Những ứng dụng quan trọng khác sinh học phân tử tới nuôi trồng thủy sản liên quan đến sản xuất cá chuyển gen Đánh giá độ thích ứng, biểu cấy chuyển tế bào mầm gen đưa vào hồn tồn phụ thuộc vào cơng nghệ DNA Thêm vào đó, sinh học phân tử dựa kỹ thuật PCR sử dụng nhiều chuẩn đoán kiểm soát bệnh động vật thủy sản Ở nước ta, việc chế tạo kít thử dựa tảng công nghệ sinh học cao cho phép xác định nhân tố gây bệnh kiểm sốt bệnh mức độ xác cao thử nghiệm Bên cạnh đó, việc nghiên cứu sản xuất vắc xin để bảo vệ nhiều lồi cá có giá trị kinh tế cao trọng Tuy nhiên, để ứng dụng rộng rãi thực tế, nghiên cứu sâu với quy mô lớn cần quan tâm IV KẾT LUẬN Kỹ thuật di truyền đóng góp cho chương trình chọn giống nâng cao suất sản lượng đối tượng thủy sản trợ giúp chuẩn đoán, điều trị phòng ngừa bệnh động vật thủy sản Ứng dụng công nghệ sinh học đem lại cho nhà khoa học kiến thức công cụ để đạt kết nghiên cứu tốt hiệu Ở nước ta, việc ứng dụng công nghệ sinh học phân tử chiến lược chọn giống cho động vật thủy sản quan tâm song thiếu nghiên cứu dài hạn, thiếu cách hoạt động phù hợp, giá trị thương mại thấp chưa lựa chọn môi trường sản xuất phù hợp Công nghệ đem đến nhiều hội để phát triển thủy sản tạo thách thức cho lĩnh vực nghiên cứu phục vụ ni trồng thủy sản TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TÀI LIỆU THAM KHẢO Alam, S., and Islam, S., 2005 Population genetic structure of Catla catla (Hamilton) revealed by microsatellite DNA markers Aquaculture 246, 151-160 Artiles, A., Rodríguez, I., Pérez, A., Pérez, L., and Espinosa, G., 2011 Low genetic variability in the fifth introduction of Litopenaeus vannamei in Cuba, as estimated with microsatellite markers Biotecnologia Aplicada 28, 147-150 Beaumont, A.R., and Hoare, K., 2003 Biotechnology and Genetics in Fisheries and Aquaculture Oxford: Blackwell Science Boris, B., Xenia, C.O., and Marcel, S.V., 2011 Genetic diversity of six populations of red hybrid tilapia, using Microsatellite genetic Markers Rev MVZ Cordoba 16 (2), 24912498 Bourdon, M R., 1999 Understanding Animal Breeding, 2nd edition Chauhan, T., and Rajiv, K., 2010 Molecular markers and their applications in fisheries and aquaculture Advances in Bioscience and Biotechnology1, 281-291 Falconer, D.S., and Mackay, T.F.C., 1996 Introduction to Quantitative Genetics Longman, Essex, U.K., 4th ed Gjedrem, T., 2005 Selection and breeding programs in aquaculture Springer ISBN-10 1-4020-3341-9 364p Gjerde, B., 1993 Breeding and Selection In: Salmon Aquaculture Fishing News Books.p 278 p Goldstein, D.B., and Schlotterer, C., 1999 Microsatellites: Evolution and application Oxford uni Press Komen, H., and Thorgaard, G.H., 2007 Androgenesis, gynogenesis and the production of clones in fishes: a review Aquaculture 269, 150-173 Lakra, W.K., 2001 Genetics and Molecular Biology in Aquaculture - Review AsianAustralasian Journal of Animal Sciences 14(6), 894-898 Liu, Z.J and Cordes, J.F., 2004 DNA marker technologies and their applications in aquaculturegenetics Aquaculture 242(1-4), 735-736 Liu, Z.J., Li, P., Kocabas, A., Ju, Z., Karsi, A., Cao, D., and Patterson, A., 2001 Microsatellite containing genes from the channel catfish brain: evidence of trinucleotide repeat expansion in the coding region of nucleotide excision repair gene RAD23B Biochem Biophys Res Commun 289, 317-324 Perez-Enríquez, R., Hernández-Martínez, F., and Cruz, P., 2009 Genetic diversity status of White shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei broodstock in Mexico Aquaculture 297, 44-50 Wolfus, G.M., Garcia, O.K., and Alcivar-Warren, A., 1997 Application of the microsatellite technique for analyzing genetic diversity in shrimp breeding programs Aquaculture 152, 35-47 Zane, L., Bargelloni, L., and Pataenello, T., 2002 Strategies for microsatellite isolation: a review Mol Ecol 11,1-16 Valles-Jiménez, R., Cruz, P., and Perez-Enriquez, R., 2005 Population genetic structure of Pacific White shrimp (Litopenaeus vannamei) from Mexico to Panama: microsatellite ADN variation Mar Biotechnol 6, 475-484 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN GENETICS AND MOLECULAR BIOLOGY IN AQUACULTURE Tran Thi Thuy Ha1*, Luu Thi Ha Giang1 ABSTRACT In recent years, the advance in genetics and molecular biology of aquatic animals has provided useful information and has been applied in aquaculture The roles of modern genetic manipulations and biotechnological innovations to aquaculture have been realized This article reviews some points of the applications of genetics in breeding, hybridization, chromosome engineering, sex control, gene transfer and molecular technologies for enhanced aquaculture productivity in Vietnam Keywords: aquaculture, genetics, molecular biology Người phản biện: TS Trịnh Quốc Trọng Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015 Ngày duyệt đăng: 07/8/2015 Research Institute for Aquaculture No *Email: thuyha@ria1.org TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN LẮP RÁP, CHÚ GIẢI VÀ PHÂN TÍCH HỆ PHIÊN MÃ TÔM SÚ Penaeus monodon Nguyễn Cường1*, Phạm Quang Huy1, Nguyễn Văn Lâm1, Hà Thị Thu1, Phạm Thị Hoa1, Nguyễn Hải Triều1, Đậu Huy Tùng1, Nguyễn Giang Thu2, Nguyễn Hữu Ninh3, Đồng Văn Quyền1, Chu Hoàng Hà1, Đinh Duy Kháng1 TĨM TẮT Tơm sú (Penaeus monodon) lồi thủy sản đem lại nguồn lợi lớn cho quốc gia năm gần Tuy nhiên, liệu hệ gene hệ phiên mã chúng hạn chế Mặc dù cơng việc gia hóa sử dụng biện pháp di truyền chọn giống nâng cao chất lượng tôm sú Tuy nhiên, nhu cầu giải mã phân tích hệ gene, hệ phiên mã của tơm sú để tìm thị phân tử liệu quan trọng khác giúp tăng hiệu suất cho trình chọn giống Trong báo này, chúng tơi cơng bố kết giải trình tự hệ phiên mã tôm sú công nghệ đọc trình tự hệ Với Gb liệu thu từ máy Illumina MiSeq, tiến hành lắp ráp de novo để tạo ngân hàng với 51.638 transcript, từ thực giải chức transcript, phát 7.016 thị phân tử microsatellite 17.783 SNP Chúng xây dựng hệ thống website quản lý ngân hàng transcript cơng cụ phân tích cần thiết Kết báo tiền đề cho nghiên cứu chuyên sâu lồi tơm sú mang lại nguồn lợi lớn Từ khóa: hệ phiên mã, lắp ráp de novo, giải trình tự hệ mới, giải, biểu gene, microsatellite, SNP I ĐẶT VẤN ĐỀ Động vật giáp xác chiếm 10% tổng sản lượng thủy sản giới lĩnh vực nuôi trồng thủy sản tăng trưởng nhanh (trung bình 15% năm từ năm 1970 đạt triệu vào năm 2008 (FAO, 2010) Trong đó, tơm sản phẩm thủy sản có giá trị nhóm nuôi trồng Việt Nam tôm sú Penaeus monodon Mặc dù ngành sản xuất nuôi trồng thủy sản đem lại nguồn lợi lớn cho quốc gia ngành sản xuất bị ảnh hưởng nặng nề thiên nhiên dịch bệnh dịch đốm trắng (WSSV) Do đó, nhu cầu nghiên cứu sâu hệ gene marker phân tử hỗ trợ chọn giống dựa vào thị phân tử để nâng cao suất ni tính trạng tăng trưởng kháng bệnh cần thiết Hiện nay, nguồn liệu tôm sú P monodon khiêm tốn (Andriantahina ctv., 2013) Trên ngân hàng Genbank có tổng cộng 39.908 EST ứng dụng vào tìm điểm đa hình (ví dụ SNP) có khoảng 600 trình tự microsatellite (cập nhật tháng 10 năm 2013) Trong đó, P monodon có 44 nhiễm sắc thể với kích thước hệ gene lớn ~2,17 Gb (You EM ctv., 2010) Với đời phát triển không ngừng công nghệ đọc trình tự hệ Next Generation Sequencing (NGS), cơng suất đọc trình tự lên tới từ Gb 600 Gb, cho phép đọc trình tự nguyên gene với mức Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam *Email: cuongnguyen@ibt.ac.vn Vụ Khoa học Công nghệ & Môi trường, Bộ NN&PTNT Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, Bộ NN&PTNT TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SAÛN độ lặp lớn lên tới 100x Hơn nữa, chi phí đọc trình tự thời gian đọc trình tự hệ gene giảm đáng kể thực phịng thí nghiệm có quy mơ trung bình Do đó, NGS cơng cụ mạnh để giải trình tự tồn hệ gene hệ phiên mã lồi từ ứng dụng nhiều phân tích sinh học phân tử đánh giá biểu gene, phát thị phân tử, phân tích SNP/InDel, ứng dụng chuẩn đốn bệnh Trong nghiên cứu này, chúng tơi đọc trình tự hệ phiên mã tơm sú Penaeus monodon, tiến hành lắp ráp de novo để thu ngân hàng transcript Từ đó, chúng tơi tiến hành giải transcript thu được, phân tích biểu gene, tìm kiếm thị phân tử microsatellite phát thị SNP Chúng tiến hành xây dựng hệ thống phần mềm quản lý ngân hàng transcript với cơng cụ phân tích cần thiết II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Một cá thể tôm sú Penaeus monodon lấy từ vùng nuôi trồng thủy sản Ninh Thuận, sau mơ tim cá thể đem tách chiết mRNA tổng số đọc trình tự máy giải trình tự hệ Illumina Miseq 2.2 Phương pháp 2.2.1 Lắp ráp de novo hệ phiên mã Dữ liệu trình tự đọc sau giải trình tự tiền xử lý để loại bỏ adaptor trình tự xấu có chất lượng thấp độ dài ngắn Những trình tự đọc có chất lượng base thấp (chất lượng QC2%) bị dính adaptor loại bỏ công cụ đánh giá cao Trimmomatic (http://www.usadellab org/cms/?page=trimmomatic) Những trình tự đọc chất lượng tốt từ mô tim lắp ráp để tạo nên hệ phiên mã bao gồm transcript tôm sú phần mềm Trinity (http:// 10 trinityrnaseq.sourceforge.net/) (Grabherr ctv., 2011) với tham số mặc định Để đánh giá chất lượng lắp ráp đưa tiêu chí: N50, phân bố độ dài transcript số lượng trình tự đọc ánh xạ ngược trở lại hệ phiên mã tham chiếu 2.2.2 Chú giải phân loại transcript hệ phiên mã Chú giải chức cho transcript hệ phiên mã đòi hỏi phải sử dụng thuật tốn tìm kiếm tương đồng sở liệu protein quan trọng Trong nghiên cứu này, sử dụng công cụ BLAST+ với chế độ BLASTX để so sánh toàn transcript lên sở liệu NCBI non-redundant protein (Nr, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Swiss-Prot (http://www.expasy.ch/sprot) với tham số E-value 1e-6 Trong trường hợp kết giải sở liệu khác thứ tự ưu tiên kết giải vùng mã hóa protein Nr, Swiss-Prot Kết giải từ ngân hàng Nr sau phần mềm Blast2GO (Conesa ctv., 2005) sử dụng để lấy mã Gene Ontology (GO) riêng biệt cho transcript Toàn transcript hệ phiên mã ánh xạ vào mã GO phân loại dựa vào hạng mục: trình sinh học, thành phần tế bào phân tử chức Hơn nữa, từ số liệu gene ontology, transcript sau giải gán mã số enzyme commission (EC code) tương đương 2.2.3 Phân tích biểu gene mơ tim Trình tự đọc tinh từ thư viện mô tim ánh xạ ngược trở lại hệ phiên mã vừa lắp ráp sử dụng Bowtie2 (http://bowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) (Langmead and Salzberg, 2012) với tham số mặc định Tổng số lượng trình tự đọc ánh xạ vào transcript đếm xem xuất (biểu hiện) lần mô tim công cụ SAMtools (http://samtools.sourceforge net/) (Li ctv., 2009) Việc đếm trình tự đọc tiêu chuẩn hóa theo đơn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu cho phép rút số kết luận sau: Điều kiện thích hợp cho q trình thủy phân moi biển hỗn hợp enzyme Alcalase Bromelin thô tỷ lệ nước bổ sung 20%, pH = muối = 2%, nhiệt độ thủy phân 50,010C thời gian thủy phân 14,93 giờ, tỷ lệ enzyme Alcalase so với chất 0,49% tỷ lệ enzyme Bromelin so với chất 13% Dịch đạm có mùi thơm đặc trưng, vị có hậu, có phân lớp rõ ràng dịch bã có hàm lượng Nts 24,73 (gN/l), tỷ lệ Naa chiếm 58,35% so với Nts Đã nghiên cứu xác định số thông số thích hợp cho q trình sấy khơ để sản xuất bột đạm từ dịch thủy phân từ moi: cô đặc dịch thủy phân nhiệt độ 750C đến hàm lượng chất khô 32 - 33oBx phối trộn hỗn hợp chất trợ sấy maltodextrin-trehalose (1:1) với tỷ lệ 2%, sấy phun hỗn hợp chế độ tốc độ phun: 12 p/lít; tốc độ ly tâm: 25.800 v/p; tốc độ bơm: 85 v/p; nhiệt độ đầu vào: 150oC; nhiệt độ đầu ra: 95oC Bột đạm thu dạng mịn, tơi, màu vàng có mùi thơm đặc trưng nước mắm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Cảnh, 2004 Quy hoạch thực nghiệm Nhà xuất Đại học Quốc gia TP HCM Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, 1989 Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản, Tập Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh 118 Trần Bích Lam, 1997 Bột protein concentrat từ ruốc Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, số 4, 1997, trang 31-34 Trần Bích Lam, 1997 Sử dụng protein concentrat ruốc sản xuất mì sợi Tạp chí Khoa học Công nghệ, số 5/1997, trang 14-16 Tài liệu tiếng Anh Chervan, M., William, D., 1984 Protein hydrolysis, University of Illinois Foundation, Urbana, IL, US Gildberg, A., Stenberg, E., 2001 A new process for advanced utilization of shrimp waste Process Biochem 36, 809–812 Jain, N.K., Roy, I., 2009 Effect of trehalose on protein structure Protein Sci 18(1), 24-36 Choi, S.H., Kobayashi, A., Yamanish, T., 1982 Odor of Cooked small shrimp, Acetes japonicus Kishinouye: Difference between raw material and fermented product Agric Biol Chem 47 (2), 337 – 342 See, S F., Hoo, L L., Babji, A.S., 2011 Optimization of enzymatic hydrolysis of Salmon (Salmo salar) skin by Alcalase International Food Research Journal 18(4),1359-1365 Program of Food Science, School of Chemical Sciences and Food Technology, Faculty of Science and Technology, Universiti Kebangsaan Malaysia Abd, A.S., Gaik, A L.O., 2000 Studies on the enzymatic hydrolysis of rice protein using commercial enzymees in reactor Biotechnology Department, Faculty of Food Science and Biotechnology, University Putra TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SAÛN PRODUCTION OF HYDROL SATE PROTEIN POWDER FROM Acetes sp Le Huong Thuy1* ABSTRACT In this paper, the results of research to produce protein powder with a high content of amino acids from hydrolytic Acetes The optimal hydrolysis condition of Acetes by the combination of Alcalase and Bromelin was determined: hydrolysis temperature of 50.010C, pH = 7, added water ratio of 20%, Alcalase/material ratio of 0.49%, bromelin/material ratio of 13% and hydrolysis time of 14.93 hours The hydrolysis solution contained 24.73 g N/l of protein and the Naa/Nts ratio was 58.35% with the special flavour and odour The appropriate parameters of dried procedure were determined The hydrolyzed Acetes was condensed at 750C until the solid concentration reached 32- 330Bx; added 2% maltodextrin-trehalose (1:1), mixed and spray dried at 1500C The protein powder was smooth, sporadic, yellow and had specific odor and flavor of fish source Keywords: Alcalase, bromelin, acetes, hydrolyzed, optimal, protein powder Người phản biện: ThS Nguyễn Thị Hương Thảo Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015 Ngày duyệt đăng: 07/8/2015 Research Institute For Marine Fisheries *Email: thuylehuong@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 119 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT ALKYL GLYCEROL TỪ SINH VẬT BIỂN DÙNG VÀ TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG AKUMARIN Chu Quang Truyền1*, Cầm Thị Ính1, Hoàng Thanh Hương1, S.P Kasijanov2, N.A Latyshev2, Phạm Quốc Long1 TĨM TẮT Alkyl glycerol (AG) có tác dụng kích thích hệ miễn dịch người cách tự nhiên, giảm lượng cholesterol, chống viêm Tác động sinh lý chất đa dạng, rõ rệt để điều trị phục hồi cho bệnh nhân ung thư (ức chế phát triển khối u, giảm di căn, giảm tăng trưởng mạch máu khối u, giảm đau), trị liệu sau xạ trị xử lý trạng thái suy giảm miễn nhiễm Được sử dụng dạng thuốc hỗ trợ, điều trị đối HIV/AIDS để tăng cấp độ hệ thống miễn dịch chúng tế bào máu Tác dụng điều tiết miễn nhiễm dựa vào kích sinh bạch cầu, tiểu cầu cytokine diệt virus Nó giúp ngăn ngừa giảm bệnh tiểu đường, cao huyết áp Bài viết trình bày phương pháp sản xuất alkyl glycerol từ sinh vật biển tạo thực phẩm chức akumarin phục vụ cho sống Chi tiết bước quy trình thủy phân mỡ, axít hóa, rửa nước, kết tinh phần hai bước aceton, lọc sấy khô tạo sản phẩm cuối điều kiện phù hợp trình bày báo Với hàm lượng AG thu ≥90% bào chế thực phẩm chức Akumarin chứa 50% hàm lượng AG Từ khóa: Alkyl glycerols, lipid, sinh vật biển, hợp chất có hoạt chất sinh học tự nhiên I ĐẶT VẤN ĐỀ Thực phẩm chức (functional foods), thực phẩm thuốc (medical foods) khác với thực phẩm phổ biến thông dụng hàng ngày (ordinary foods) thức ăn ngồi giá trị dinh dưỡng cịn có tính đặc biệt phịng ngừa điều trị bệnh tật Thực phẩm chức sản xuất sử dụng Nhật, sau lan rộng sang Mỹ, nước châu Âu nhiều nước toàn giới, có Việt Nam Hàng năm, tồn giới sử dụng khoảng 65 tỷ USD cho chế phẩm bổ sung dinh dưỡng, thị trường Bắc Mỹ chiếm 1/3, thị trường châu Âu 1/3 Nutrition Business Journal, 2003; 2004) Alkyl glycerol họ hợp chất có vai trị quan trọng nhiều trình thể sống với hai chức sinh học tham gia cấu trúc màng tế bào đảm nhận vai trò trung gian đáp ứng tế bào (Taguchi et al., 1998) Tác động sinh lý chất đa dạng, rõ rệt để điều trị phục hồi cho bệnh nhân ung thư, trị liệu sau xạ trị xử lý trạng thái suy giảm miễn nhiễm (Lannitti et al., 2011, Magnusson et al., 2011) Tác dụng điều tiết miễn nhiễm dựa vào kích sinh bạch cầu, tiểu cầu cytokine diệt virut Tác động kháng tạo hình hoạt tính ức chế hoạt động enzym protein kinaza C (Anne-Laure et al., 2010) Khả trội khác dễ tạo nhũ tương dạng nano dẫn thuốc đến nơi cần nhận (Taguchi et al., 1998) Alkyl glycerol có tác dụng kích thích hệ miễn dịch người cách tự nhiên làm giảm lượng cholesterol, bệnh tim mạch Hiện nay, lipit thu nhận theo nhiều phương pháp khác như: phương pháp Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên *Email: quangtruyen69@gmail.com Viện Sinh học biển A.V Zhirmunsky 120 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN hóa học, phương pháp sinh học, phương pháp học phương pháp nhiệt II QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ 2.1 Nguyên liệu Sau sàng lọc, lựa chọn nguyên liệu nội tạng thủy sản (cá, bạch tuộc, mực ) từ nhà máy chế biển hải sản Hải Phòng, Nha Trang Các mẫu nội tạng bảo quản điều kiện nhiệt độ -20°C phục vụ cho xử lý phân tích sau 2.2 Sơ đồ nghiên cứu chung Từ nguyên liệu nội tạng thủy sản tiến hành thu nhận lipit tổng Bằng phản ứng kiềm hóa, axit hóa sau kết tinh aceton chúng tơi thu nhận akyl glycerol đạt độ tinh khiết ≥ 90%, hiệu suất trình đạt 98% Dưới sơ đồ nghiên cứu sản xuất alkyl glycerol tạo thực phẩm chức Hình Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất alkyl glycerol tạo TPCN Akumarin 2.3 Dụng cụ, hóa chất dung mơi thiết bị phân tích Lipit chiết tách thiết bị chiết đa có gia nhiệt 150 lít, phễu chiết cơng nghiệp 80 lít, bình phản ứng, thiết bị làm lạnh, cân công nghiệp, máy quay cất chân không 10 lít Dung mơi, hóa chất phân tích: aceton, dietyl ete, axit acetic, n-hexan, etanol, etyl acetat, HCl, H2SO4, Na2SO4, KOH Xác định hàm lượng AG GC-MS: Máy GC- 6890 Agilent Mỹ Detector MS5975C Agilent Mỹ Cột DB-XLB (30 m * 250 mm * 0,25 µm), nhiệt độ: từ 80-2700C, bơm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 121 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN mẫu µl, nhiệt độ 2500C, khí mang He, tốc độ ml/phút III THỰC NGHIỆM 3.1 Chiết lipit tổng Nguyên liệu nội tạng thủy sản sau thu mua bảo quản -20°C Sau tan đông để tự phân hủy enzym nội sinh chiết lipit tổng phương pháp nhiệt thiết bị đun đa 150 lít có gia nhiệt, nhiệt độ ổn định 90°C thời gian 180 phút, lọc tách riêng phần lipit tổng, phần bã lại tiếp tục li tâm để tận thu phần lipit 3.2 Thủy phân môi trường kiềm Lipit tổng kiềm hóa mơi trường kiềm KOH/EtOH 15% khuấy đun nhiệt độ 60°C thời gian 60 phút cho tan hồn tồn Sau để nguội nhiệt độ phịng axit hóa H2SO4/H2O, khuấy đến pH=3, tách bỏ lớp nước rửa lại nước ấm đến pH = 6, loại bỏ phần nước thu lớp lipit 3.3 Tinh chế Alkyl glycerol Để nghiên cứu trình kết tinh sản phẩm aceton, tiến hành thí nghiệm với hỗn hợp phản ứng sau q trình thủy phân gồm có lipit AG (hàm lượng AG lipit 2% theo khối lượng) kết tinh aceton sau: + Kết tinh lần 1: hòa tan kg dầu béo với 20 lít aceton, khuấy đun nóng 60°C hỗn hợp hòa tan hết (1 giờ) Sau ngừng cung cấp nhiệt, ngừng khuấy giữ dung dịch vòng 10 nhiệt độ phòng Tiếp theo hỗn hợp làm lạnh đến 0°C để 12 Sau thời gian đó, lọc lấy kết tủa rửa lại 500 ml aceton lạnh Kết tủa đem sấy khơ nhiệt độ phịng Cân kiểm tra khối lượng xác định hàm lượng AG có sản phẩm + Kết tinh lần 2: Sản phẩm trung gian kết tinh lần đem lặp lại lần xác bước giai đoạn Từ kg lipit sau kết tinh thứ từ aceton thu 45 g sản phẩm AG có độ tinh 122 khiết 80,5%; hiệu suất trình 90,6% Kết tinh lần thứ thu 41 g sản phẩm AG có độ tinh khiết 95,6%; hiệu suất trình 98% 3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở thực phẩm chức Akumarin 3.4.1 Yêu cầu tiêu cảm quan - Trạng thái: Viên nén kích thước - Màu sắc: Bột màu trắng vàng nhẹ, nén thành viên - Mùi vị: có mùi đặc trưng sản phẩm, khơng có mùi lạ 3.4.2 u cầu tiêu chất lượng AG có tiêu mức chất lượng theo quy định đây: Bảng Yêu cầu tiêu chất lượng Chỉ tiêu Đơn vị tính Mức cơng bố Hàm lượng tro % ≤1 Độ ẩm % ≤5 Khối lượng mg/viên 950±10% riêng Hàm lượng mg 400-600 Alkyl glycerol 3.4.3 Hàm lượng kim loại nặng Bảng Hàm lượng kim loại nặng Tên tiêu Đơn vị tính Hàm lượng Pb Hàm lượng Hg Hàm lượng Cd mg/kg mg/kg mg/kg Không vượt 10,0 0,5 2,0 3.4.4 Các tiêu vi sinh vật Bảng Các tiêu vi sinh vật Tên tiêu Tổng số vi sinh vật hiếu khí Coliforms E coli Pseudomonas aeruginosa Tổng số nấm men mốc ĐVT CFU/g Mức tối đa 104 CFU/g CFU/g CFU/g CFU/g 10 0 102 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 3.4.5 Hàm lượng hóa chất khơng mong muốn Bảng Hàm lượng hóa chất khơng mong muốn TT Tên tiêu ĐVT Mức tối đa Aflatoxin B1, ppm 3,0 Hàm lượng ppm 0,1 Aflatoxin tổng số Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, thuốc thú y chất không mong muốn khác phù hợp với Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm ban hành Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 trưởng Bộ Y tế 3.5 Thành phần cấu tạo Tính cho viên nén 1.000 mg/viên: Alkyl glyceryl ete 500 mg (hoạt chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ lipit có nội tạng thủy sản (cá, mực ), Avicel 40 mg, tinh bột 60 mg tá dược Sản phẩm Akumarin TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 123 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN IV KẾT LUẬN Từ nguyên liệu nội tạng thủy sản, chiết tách kết tinh chế phẩm alkyl glycerol xây dựng tiêu chuẩn sở alkyl glyceryol Từ chế phẩm alkyl glycerol, bào chế sản phẩm thực phẩm chức AKUMARIN cấp giấy xác nhận an toàn thực phẩm số 14511/2014/ATTP-XNCB Y tế Chúng xây dựng quy trình sản xuất TPCN chứa akyl glycerol đạt độ tinh khiết ≥ 90%, hiệu suất trình đạt 98% Đã xây dựng tiêu chuẩn sở TPCN Akumarin Đây công bố đâu tiên quy trình sản xuất TPCN Akumarin Việt Nam chứa hàm lượng alkyl glycerol Bước đầu khẳng định thành cơng từ việc nghiên cứu quy trình tạo chế phẩm alkylglycerol, sản xuất TPCN Akumarin từ nội tạng thủy sản phục vụ sống LỜI CÁM ƠN Công trình thực tài trợ Đề tài: “Nghiên cứu quy trình sản xuất thực phẩm chức giàu hoạt chất alkyl glyxeryl ete từ nội tạng động vật thủy sản” 124 Số: 629/HĐ-KHCN-CNSH, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn TÀI LIỆU THAM KHẢO Nutrition Business Journal, 2003 The NBJ/SPINS Organic Foods Report 2003 New Hope Natural Media, Inc., Boulder, CO Taguchi, H., Armarego, W.L., 1998 Glyceryl ether monooxigenase [EC1.14,16.5] A Microsomal enzyme of ether lipid metabolism In © 1998 John Wiley & Sons, Inc Med Res Rev 18(1), 43- 89 Iannitti, T., Palmieri, B., 2011 An update on the therapeutic role of alkyl glycerols Mar Drugs 8, 2267–2300 Anne-Laure, D., Paul, M.,, Frédérique, P., Romain, M., Damien, L.B., 2010 Multiple beneficial health effects of natural alkyl glycerols from shark liver oil Mar Drugs 8, 2175-2180 Magnusson, C.D., Haraldsson, G.G., 2011 Ether lipids Chem Phys Lipids 164, 315-340 Nutrition Business Journal, 2004 NBJ’s Organic Foods Report 2004, New Hope Natural Media, Inc., Boulder, CO TAÏP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TECHNOLOGICAL PROCESS FOR PRODUCTION OF ALKYL GLYCEROL FROM MARINE ORGANISMS FOR FUNCTIONAL FOODS AKUMARIN Chu Quang Truyen1*, Cam Thi Inh1, Hoang Thanh Huong1, S.P Kasijanov2, N.A Latyshev2, Pham Quoc Long1 ABSTRACT Alkyl glycerol’s (AGs) are involved in stimulating the immune system of mammals naturally, reducing cholesterol and anti-inflammatory Physiological impact of AGs is diverse and clearest in treatment and recovery of cancer patient AGs are widely known to normalize the function of bone marrow, causing excessive stimulation In this regard, AG is successfully used in the rehabilitation therapy during the treatment of cancer, radiation lesions, immunodeficiency states and others AGs are used as support medicine to treat HIV/ AIDS by increasing levels of immune system and blood AGs are used to regulate infection dismiss based on stimulating white blood cell, platelet and cytokine multiplication for killing virus They are also used to prevent and reduce diabetes and high blood pressure symptom This paper presents the method for producing alkyl glycerol’s of marine organisms’ fat involving the hydrolysis of fat, acidification of the fatty mixture, washing it with water, two-step fractional crystallization in acetone, filtration and drying of the end product under proper conditions The purity of obtained AG is more than 90% and it was used for the preparation of functional food akumarin containing 50% of AG Keywords: Alkyl glycerol, lipid, marine organisms, natural bioactive compounds Người phản biện: ThS Nguyễn Thị Lan Chi Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015 Ngày duyệt đăng: 07/8/2015 Institute of Natural Products Chemistry – VAST *Email: quangtruyen69@gmail.com A.V Zhirmunsky Institute of Marine Biology - FEB, RAS TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 125 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐIỀU CHẾ PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN TỪ BÁN KHÁNG NGUYÊN DOMOIC ACID Đào Việt Hà1* Phạm Xuân Kỳ1 TÓM TẮT Nhằm lựa chọn protein tải tối ưu phức hợp kháng nguyên DA, chất DA (có chất bán kháng nguyên) gắn kết với 03 loại protein khác bao gồm Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Bovine Serum Albumin (BSA) Polylysin (Plys) thơng qua cầu nối hóa học Disuccinimidyl Suberate (DSS) Ở thí nghiệm tạo phức DA-DSS (pH 6-7, nhiệt độ phòng khoảng 28oC), hiệu suất phản ứng ổn định (65-68%) Ngược lại, có khác biệt hiệu suất protein tải phản ứng kết hợp với phức hợp DA-DSS: cao BSA (20,5%), KLH (7,15%) Plys (14,2%) Trong phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein, tỉ lệ số phân tử DA gắn kết với phân tử protein có khác biệt theo protein (Plys:59, BSA: 22, KLH: 14) Trên sở so sánh kết với số gốc acid amin lysin tự nội phân tử protein, BSA nhận định có tính ưu việt chọn lựa protein tải phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein để gây phản ứng miễn dịch thỏ trắng New Zealand Việt Nam Từ khóa: domoic acid, hiệu suất, kháng nguyên, protein tải I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thập niên gần đây, hướng nghiên cứu miễn dịch học nhằm phục vụ phát triển phương pháp thử nghiệm nhanh (ELISA) độc tố domoic acid (DA) quan tâm nhiều Một khó khăn lớn tạo kháng thể kháng độc tố DA động vật bậc cao sản sinh kháng thể kháng lại độc tố có chất protein Trong đó, DA có khối lượng phân tử thấp, khơng thuộc nhóm protein nên thể sinh vật khơng có hiệu ứng miễn dịch bị tiêm trực tiếp độc tố Muốn tạo hiệu ứng miễn dịch sinh vật thử nghiệm DA, trước tiên phải điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA có chất bán kháng nguyên (hap ten) cách gắn kết độc tố với loại protein thích hợp, cho phức chất tạo vừa có tính chất kháng ngun từ độc tố (DA), vừa có tính sinh miễn dịch phân tử protein Công bố lĩnh vực Newsome ctv., (1991) ông thành công tạo kháng nguyên DA-BSA (Bovine Serum Albumin) nhờ tính chất vật lý bám dính phân tử DA bề mặt phân tử protein mang (BSA) mơi trường có độ ion hóa cao Tuy nhiên, lượng kháng thể sản sinh sử dụng kháng nguyên thấp thiếu tính đặc hiệu cấu trúc bền vững phức hợp kháng nguyên tính ngẫu nhiên phân tử DA gắn kết với BSA Smith Kitts (1994), Osada cs., (1995) cải tiến cách gắn kết DA BSA với có mặt Ethyl dimethylaminopropyl carbondiimide (EDC) N-hydroxy succinimide (NHS) đóng vai trị hoạt hóa nhóm amin thứ cấp phân tử protein BSA, sau gắn với gốc cacboxyl phân tử DA thơng qua liên kết kiểu peptide Vì DA có 03 gốc cacboxyl, gốc kết hợp Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam * Email: daovietha69@gmail.com 126 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 8/2015 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ngẫu nhiên với phân tử protein tải nên kháng thể sản sinh dạng hỗn hợp 03 kháng thể tương ứng với 03 điểm tiếp nhận khác phân tử DA Mặt khác, hàm lượng kháng thể tạo từ kháng nguyên điều chế phương pháp lẫn nhiều tạp chất khơng mong muốn Nhằm cải thiện chất lượng kháng thể (có tính đặc hiệu hơn), Garthwaite ctv., (1998) phát triển phương pháp tạo kháng nguyên cách gắn gốc amine DA với gốc cacboxyl protein tải Ở phương pháp này, với 01 gốc amine tự DA, kháng nguyên hoàn toàn tương đồng điểm tiếp nhận DA giảm thiểu tạp chất không mong muốn sản phẩm miễn dịch Mặc dù vậy, protein mang thường có nhiều nhóm cacboxyl bề mặt phân tử, chất lượng kháng thể phụ thuộc vào tỉ lệ gắn kết thành công số lượng phân tử DA định với phân tử protein tải Bằng phương pháp này, kháng thể sản sinh có sản lượng tính đặc hiệu cao hẳn so với Smith Kitts (1994) Tuy nhiên, DA có nhóm amine thứ cấp (-NH) nên cần phải chuyển đổi sang dạng amine sơ cấp (-NH2) trước tạo phức kháng nguyên làm hao hụt phần kháng nguyên sau điều chế nên quy trình thực lại phức tạp tốn Một phương pháp khác sử dụng để điều chế phức hợp kháng nguyên gắn kết gốc amine sơ cấp phân tử DA với gốc amine sơ cấp phân tử protein tải Để thực phản ứng gắn kết này, cần có tham gia hợp chất mang tính cầu nối 02 phân tử Disuccinimidyl Suberate (DSS, C16H20N2O8) hợp chất có khả liên kết nhóm amine sơ cấp DA nhóm nitrate (-NO3) phân tử DSS, sau phức kết hợp với nhóm amine sơ cấp phân tử protein thơng qua nhóm cacboxyl phân tử DSS tạo thành phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein Phương pháp đơn giản tốn so với Garthwaite ctv., (1998) Mặt khác, tính gốc amine sơ cấp phân tử DA, kháng nguyên có đồng 01 dạng epitopi (điểm tiếp nhận), cho sản phẩm kháng thể tương ứng với độ đặc hiệu cao phương pháp trước Mặt khác, để phục vụ cho việc điều chế phức hợp DA protein từ kháng nguyên ban đầu (DA), cần phải có bước chọn lọc protein đặc hiệu cộng hợp đặc hiệu với DA Hemoyamin KeyHole Limpets (KLH), Bovine Serum Albumin (BSA), Human Gamma Globulin (HGG), Diphtheria Toxoid (DT), Ovalbumin (OVA) hay Polylysin (Plys) thường sử dụng làm protein tải DA (Branaa ctv., 1999; Kawatsu ctv., 1999; Kania Hock, 2002; Kania ctv., 2003) Tùy thuộc vào số lượng gốc amine sơ cấp (-NH2) hoạt tính phân tử, protein tải khác có ảnh hưởng lớn đến sản lượng độ đặc hiệu kháng thể Vì nghiên cứu tiến hành thăm dò thử nghiệm khả gắn kết với phân tử DA số protein tải thương mại bao gồm BSA, KLH, Plys sở so sánh hiệu suất phản ứng, tỉ lệ gắn kết 01 phân tử protein tải Kết nghiên cứu sở khoa học cho việc chọn lựa protein tải tối ưu độc tố DA nhằm tạo phức hợp kháng nguyên tốt từ chất bán kháng nguyên DA ban đầu Đây nội dung quan trọng đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu phát triển KIT phát nhanh số độc tố vi tảo sản phẩm thủy sản” chương trình Cơng nghệ Sinh học Thủy sản Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn đến 2020 II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chuẩn bị dung dịch DA: Hòa tan mg domoic acid (DA) chuẩn (TOCRIS, Anh 14277-97-5) thể tích nhỏ nước cất (