Cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là một trong những loại hoa thương phẩm quan trọng trên thế giới. Trong nghiên cứu này, cây in vitro được huấn luyện ở vườn ươm có kiểm soát độ ẩm, ánh sáng thông qua màng che nilon và lưới cản quang, tỷ lệ sống đạt từ 83,16 đến 91,10%.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(76)/2017 NGHIÊN CỨU GIẢI PHẪU LÁ CÂY HOA CÚC CẤY MÔ Ở GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM VÀ MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG Nguyễn Văn Đính1, Nguyễn Thị Oanh1, Lê Thu Hằng1, La Việt Hồng1 TÓM TẮT Cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) loại hoa thương phẩm quan trọng giới Trong nghiên cứu này, in vitro huấn luyện vườn ươm có kiểm sốt độ ẩm, ánh sáng thơng qua màng che nilon lưới cản quang, tỷ lệ sống đạt từ 83,16 đến 91,10% Trong giai đoạn huấn luyện in vitro có số đặc điểm giải phẫu thích ứng với mơi trường tự nhiên tăng độ dày lá; tăng số lượng khí khổng; lơng che chở giảm kích thước khí khổng Các tiêu chiều dài rễ, khối lượng tươi, khối lượng khô hoa cúc tăng nhanh… Cây sinh trưởng phát triển tốt Cây có nguồn gốc cấy mơ 60 ngày tuổi sử dụng làm mẹ Cây mẹ bấm xử lý phun dung dịch Atonik ml/lít để phát sinh chồi bên đồng Chồi bên xử lý dung dịch α-NAA 0,5 mg/lít chế phẩm kích thích rễ N3M 20 g/lít để tạo hồn chỉnh Từ khóa: Cây hoa Cúc, giải phẫu, nuôi cấy mô, giai đoạn ươm, nhân giống, mẹ I ĐẶT VẤN ĐỀ Cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) loại hoa cắt cành trồng chậu quan trọng giới (Teixeira da Silva, 2014) Nuôi cấy mô thực vật (vi nhân giống) cho phép sản xuất giống chất lượng cao, không nhiễm bệnh đồng mà không phụ thuộc vào thời tiết mùa vụ Đã có nhiều cơng bố ứng dụng cơng nghệ sinh học nói chung kỹ thuật ni cấy mơ nói riêng đối tượng hoa cúc (Teixeira da Silva, 2014; La Việt Hồng cs., 2016) Tuy nhiên, hạn chế lớn trình áp dụng kỹ thuật để sản xuất giống quy mô lớn tỷ lệ chết mô chuyển điều kiện tự nhiên cao Theo Hazarika (2003), Lavanya et al (2009), Deb Imchen (2010), sống điều kiện in vitro có hình thái, giải phẫu sinh lý hoàn toàn khác biệt so với sống tự nhiên, vậy, hiệu giai đoạn huấn luyện để in vitro thích nghi định đến thành cơng quy trình Một hạn chế việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mơ giá thành sản xuất giống cịn cao, để giảm giá thành sản xuất giống phương pháp giâm cành lựa Ba giống hoa cúc Đỏ Cờ, Thạch Bích Chi Vàng thuộc nhóm hoa cúc dạng chùm, kích thước hoa nhỏ có màu đẹp, thị trường hoa ưa chuộng Hiện nay, giống nhân lên phương pháp nhân giâm cành, việc nhân giống diễn thời gian dài nên chất lượng mẹ bị thối hóa Nghiên cứu thực nhằm đánh giá số đặc điểm giải phẫu giống hoa cúc (Đỏ Cờ, Thạch Bích, Chi Vàng), số biện pháp nâng cao tỷ lệ sống, chất lượng in vitro giai đoạn vườn ươm hồn thiện quy trình nhân giống hoa cúc phương pháp giâm cành, đảm bảo việc cung cấp giống cho sản xuất với số lượng chất lượng tốt II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Ba giống cúc sản xuất: Thạch Bích, Đỏ Cờ, Chi Vàng (Chrysanthemum sp.) dạng cúc chùm, thu xã Đại Thịnh, huyện Mê Linh, thành phố Hà Nội Mẫu sau lưu giữ dạng in vitro phịng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Khoa Sinh Kỹ thuật Nơng nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội (ĐHSP Hà Nội 2) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với lần nhắc lại Thí nghiệm tiến hành vườn thực nghiệm sinh học Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường, ĐHSP Hà Nội từ tháng 8/2016 - 2/2017 Khu vực vườn ươm che lớp lưới cản quang, có hệ thống tưới phun sương 2.2.1 Tỷ lệ sống, số tiêu sinh lý đặc điểm giải phẫu cúc cấy mơ giai đoạn huấn luyện - Thí nghiệm đánh giá tỷ lệ sống số tiêu sinh lý cúc cấy mô giai đoạn huấn luyện Các cúc cấy mô (chiều cao cây: - cm; số cây: - 6; số rễ/cây: - rễ) giống dùng làm vật liệu thí nghiệm Theo dõi tỷ lệ sống giống xác định sống sót sau 14 ngày Xác định tiêu sinh lý: Khối lượng tươi - khô (g), chiều dài rễ (cm) vào thời điểm ngày (bắt đầu đưa vườn ươm), ngày 14 ngày Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 49 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(76)/2017 - Đặc điểm giải phẫu cúc cấy mô giai đoạn huấn luyện Đặc điểm giải phẫu gồm: Độ dày (µm), mật độ lỗ khí biểu bì mặt (số lỗ khí/mm2), kích thước lỗ khí-chiều rộng (µm), lơng che chở (số lơng/mm2) kính hiển vi soi Optika (Italia) sau 14 ngày 2.2.2 Hoàn thiện quy trình nhân giống cúc phương pháp giâm chồi - Nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm Atonik 1.8 DD đến trình phát sinh chồi bên cúc Cây cấy mô giống sau 60 ngày tuổi vườn ươm (chiều cao 20 - 30 cm bấm làm vật liệu thí nghiệm, gồm cơng thức (CT) thí nghiệm: CT đối chứng không xử lý, CT CT xử lý Atonik 1.8 DD (công ty ADC, Cần Thơ) nồng độ ml/lít ml/lít Theo dõi tiêu: Khối lượng chồi (g); số chồi/cây sau 20 ngày xử lý - Nghiên cứu ảnh hưởng α-NAA chế phẩm N3M đến trình rễ chồi cúc CT 1: Đối chứng chồi khơng xử lý hóa chất, CT 2: Chồi xử lý dung dịch α-NAA (Dulchefa, Hà Lan) 0,5 mg/lít, CT 3: Chế phẩm phân bón kích thích rễ cực mạnh N3M (Cơng ty TNHH MTV Sinh hóa nơng Phú Lâm) nồng độ 20 g/lít phút Chồi bên phát sinh từ mô cắt rời có Chỉ tiêu Tỷ lệ sống Chiều dài rễ (cm) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) chiều cao - cm số - nồng độ xử lý theo công thức thí nghiệm, sau giâm lên luống đất với mật độ 1.000 chồi/m2 Đánh giá tiêu: Khả rễ chồi bên, tỷ lệ sống chồi giâm thành hoàn chỉnh sau 10 ngày 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lí chương trình Excel 2010 theo mơ tả Nguyễn Văn Mã (2013) theo tham số thống kê giá trị trung bình, độ lệch chuẩn Ảnh hưởng nhân tố thí nghiệm thực phân tích ANOVA chiều, kiểm tra sai khác LSD0,05, giá trị thể bảng số liệu giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Các chữ theo sau cột thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α = 0,05 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Một số tiêu sinh trưởng đặc điểm giải phẫu cúc cấy mô giai đoạn huấn luyện 3.1.1 Tỷ lệ sống cấy cúc cấy mô giai đoạn huấn luyện Trong nghiên cứu này, in vitro giống huấn luyện vườn ươm, sau 14 ngày, tỷ lệ sống giống Đỏ Cờ, Thạch Bích, Chi Vàng đạt: 87,12; 91,10 83,16 (%) (Bảng 1) Kết cho thấy, tỷ lệ sống giống cúc cao, đạt từ 83,16 (%) trở lên Trong giống nghiên cứu giống Thạch Bích có tỷ lệ sống cao Bảng Một số tiêu sinh trưởng cúc cấy mô giai đoạn huấn luyện Đỏ Cờ Thạch Bích Chi Vàng Thời điểm đo Thời điểm đo Thời điểm đo 7 14 14 14 ngày ngày ngày 87,12± 91,10 ± 83,16 ± 0,76 0,84 0,56 0,7 ± 7,0 ± 7,8 ± 0,6 ± 5,4 ± 7,9 ± 0,8 ± 4,3 ± 5,9 ± a b c a b c a b 0,10 0,45 1,47 0,1 0,6 1,4 0,1 1,2 1,2c 0,32 ± 0,67 0,84 ± 0,159 ± 0,339 ± 0,848 ± 0,198 ± 0,342 ± 0,468 ± a b c 0,05 ±0,17 0,11 0,02a 0,04b 0,04c 0,04a 0,10b 0,04c 0,018 ± 0,057 ± 0,070 ± 0,010 ± 0,026 ± 0,062 ± 0,010 ± 0,022 ± 0,038 ± 0,003a 0,010b 0,017c 0,002a 0,004b 0,003c 0,001a 0,006b 0,002c Ghi chú: Bảng 1, 3, 4: Trong hàng, chữ theo sau khác thể sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Kí hiệu (-): Khơng thống kê 3.1.2 Đánh giá số tiêu sinh trưởng cấy cúc cấy mô giai đoạn huấn luyện * Chiều dài rễ (cm): Kết đánh giá chiều dài rễ giai đoạn vườn 50 ươm giống cúc thể bảng cho thấy: Chiều dài rễ giống tăng từ đến 14 ngày vườn ươm, khoảng khảo sát tăng chiều dài giống khác có ý nghĩa Giống Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(76)/2017 Đỏ Cờ giai đoạn từ đến ngày chiều dài rễ tăng nhanh (từ 0,7 đến 7,0 cm), sang giai đoạn từ đến 14 ngày, chiều dài rễ tăng chậm (từ 7,0 đến 7,8 cm) Giống Chi Vàng, gia tăng chiều dài rễ tương tự giống Đỏ Cờ Giống Thạch Bích rễ phát triển qua giai đoạn khảo sát đạt kích thức 7,9 cm sau 14 ngày * Khối lượng tươi, khối lượng khô: Tiếp tục đánh giá khả sinh trưởng giống cúc giai đoạn vườn ươm thông qua tiêu khối lượng tươi, khơ tồn thể bảng Phân tích bảng cho thấy giống cúc tăng trưởng tốt giai đoạn vườn ươm, gia tăng khối lượng tươi, khô qua giai đoạn khảo sát có ý nghĩa Cụ thể: Đối với giống Đỏ Cờ từ đưa vườn ươm khối lượng tươi tăng từ 0,321 lên 0,845 g/cây; khối lượng khô tăng từ 0,018 lên 0,07 g/cây Đối với giống Thạch Bích từ đưa vườn ươm khối lượng tươi tăng từ 0,159 lên 0,848 g/cây; khối lượng khô tăng từ 0,010 lên 0,062 g/cây Đối với giống Chi Vàng từ đưa vườn ươm khối lượng tươi tăng từ 0,198 lên 0,468 g/cây; khối lượng khô tăng từ 0,010 lên 0,038 g/cây Trong giống cúc nghiên cứu giống Thạch Bích có khả sinh trưởng tốt 3.1.3 Một số đặc điểm giải phẫu giống cúc giai đoạn vườn ươm Kết giải phẫu giống cúc cấy mô thể bảng hình Phân tích kết cho thấy giải phẫu tăng số lượng khí khổng; lơng mặt giảm kích thước khí khổng (Hình 2) Trong giống nghiên cứu giống Thạch Bích có khả thích ứng tốt Cụ thể: Độ dày tăng từ 108,11% (Chi Vàng) đến 135,04% (Thạch Bích) so với giai đoạn ngày Mật độ khí khổng tăng từ 103,76% (Đỏ Cờ) đến 148,42% (Thạch Bích) so với giai đoạn ngày Lông che chở tăng từ 103,37% (Đỏ Cờ) đến 120,82% (Thạch Bích) so với giai đoạn ngày Kích thước khí khổng giảm từ 90,14% đến 92,21% so với giai đoạn ngày Bảng Đặc điểm giải phẫu số giống hoa cúc giai đoạn vườn ươm Chỉ tiêu Độ dày (µm) Mật độ lỗ khí (số lỗ khí/mm2) Kích thước lỗ khí (µm) Lơng che chở (số lơng/mm2) Thạch bích Chi vàng Đỏ cờ Thời điểm đo Thời điểm đo Thời điểm đo Ngày 14 ngày 101,23 ± 0,34 68,08 ± 1,27 15,40 ± 1,87 27,03 ± 0,15 136,71 ± 1,22 98,08 ± 1,90 14,20 ± 2,54 32,66 ± 1,18 Tăng (%) 135,04 148,42 92,21 120,82 Ngày 14 ngày 109,54 ± 1,34 67,17 ± 1,76 14,05 ± 4,12 26,66 ± 1,52 118,42 ± 2,11 81,15 ± 1,90 12,67 ± 1,38 27,58 ± 1,27 Tăng (%) 108,11 120,81 90,17 103,37 Ngày 14 ngày 112,66 ± 0,23 73,37 ± 3,42 16,57 ± 2,54 25,35 ± 0,43 145,22 ± 0,54 76,13 ± 1,60 15,27 ± 1,14 28,13 ± 0,43 a b c d e f g h Tăng (%) 128,90 103,76 92,15 110,96 Hình Hình ảnh giải phẫu số giống cúc in vitro giai đoạn vườn ươm a, b: Giải phẫu mơ Thạch bích - 14 ngày; c, d: Giải phẫu mô Đỏ cờ - 14 ngày; e, f: Lỗ khí Thạch bích - 14 ngày; g,h: Lỗ khí Đỏ cờ - 14 ngày 51 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(76)/2017 Theo Pospíšilová et al (1999), suốt giai đoạn huấn luyện dày lên, tế bào mô mềm biệt hố thành mơ giậu mơ khuyết, mật độ lỗ khí giảm lỗ khí chuyển từ hình trịn thành hình elip Sự phát triển lớp cutin, lớp sáp điều hoà hiệu hoạt động lỗ khí dẫn tới ổn định nước 3.2 Biện pháp kỹ thuật nhân giống phương pháp giâm chồi 3.2.1 Ảnh hưởng chế phẩm Atonik 1,8DD đến trình phát sinh chồi bên Kết xác định số chồi khối lượng chồi tái sinh sau lần bấm thể bảng cho thấy: Phun Atonik làm tăng số lượng chồi khối lượng chồi so với đối chứng, đặc biệt công thức phun chế phẩm Atonik ml/lít Cụ thể số chồi/cây giống Đỏ Cờ, Thạch Bích, Chi Vàng đạt 2,73; 3,03 3,10 CT đối chứng giống đạt tương ứng 1,57; 1,60 1,57 Về khối lượng chồi giống xử lý chế phẩm tăng so với đối chứng, nhiên, công thức xử lý chế phẩm (CT CT 3) khác biệt Bảng Khả sinh trưởng chồi cúc in vitro giai đoạn vườn mẹ Khối lượng Giống Công thức Số chồi/cây chồi (g) a 0,683a ± 0,01 Đối chứng 1,57 ± 0,68 Antonik 0,851b± 0,02 1,87 ± 0,68a Đỏ (3 ml/lít) Cờ Antonik 2,73 ± 0,87b 0,816b ± 0,01 (5 ml/lít) Đối chứng 1,60 ± 0,72a 0,651a ± 0,02 Antonik 1,93 ± 0,69ab 0,822b ± 0,03 Thạch (3 ml/lít) Bích Antonik 3,03 ± 0,67b 0,939b ± 0,01 (5 ml/lít) Đối chứng 1,57 ± 0,37a 0,720a ± 0,03 Antonik (3 2,00 ± 0,70ab 0,876b ± 0,01 Chi ml/lít) Vàng Antonik (5 3,10 ± 0,80b 0,992b ± 0,02 ml/lít) 3.2.2 Ảnh hưởng N3M α-NAA đến khả rễ chồi bên Kết xác định tỷ lệ chồi rễ số lượng rễ/ chồi sau 10 ngày giâm thể bảng Bảng Khả rễ chồi cúc giai đoạn vườn giâm Giống Công thức Đối chứng Đỏ Cờ α-NAA (0,5 mg/lít) N3M (20 g/lít) Đối chứng Thạch Bích α-NAA (0,5 mg/lít) N3M (20 g/lít) Đối chứng Chi Vàng α-NAA (0,5 mg/lít) N3M (20 g/lít) Số rễ/chồi (rễ) Tỉ lệ chồi rễ (%) 6,69a 75 26,83c 100 16,83b 100 8,70a 70 25,93b 100 28,70c 100 11,27a 72 22,93b 100 26,03c 100 Đối với cúc việc giâm chồi để kích thích rễ tạo hồn chỉnh dễ dàng, cơng thức đối chứng tỷ lệ chồi rễ đạt 52 Hình thái chất lượng rễ Rễ yếu mảnh, xuất không xung quanh mặt cắt chồi Rễ mập khỏe, rễ xuất xung quanh mặt cắt chồi Rễ yếu mảnh, xuất không xung quanh mặt cắt chồi Rễ mập khỏe, rễ xuất xung quanh mặt cắt chồi Rễ yếu mảnh, xuất không xung quanh mặt cắt chồi Rễ mập khỏe, rễ xuất xung quanh mặt cắt chồi từ 70 - 75%, số rễ đạt đạt từ 6,69 - 11,27 rễ/chồi Tuy nhiên, xử lý chồi dung dịch NAA chế phẩm kích thích rễ số chồi Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(76)/2017 rễ đạt 100%, đặc biệt số rễ/chồi, rễ mập khỏe, rễ xuất xung quanh mắt cắt chồi so với đối chứng giống hoa cúc phương pháp nuôi cấy bấm để có nguồn giống tốt, giá thành hợp lý phục vụ sản xuất IV KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 4.1 Kết luận - Dùng kỹ thuật che nylon lưới chắn cản quang (che lớp, nylon che quanh luống để đảm bảo độ ẩm 80 - 90%) để huấn luyện cúc in vitro, cho tỷ lệ sống cao từ 83,16 - 91,1% Cây sinh trưởng tốt, thích ứng với điều kiện trồng tự nhiên sau 20 ngày Cây cấy mô 60 ngày tuổi đạt tiêu chuẩn xuất vườn dùng làm mẹ để nhân giống kỹ thuật bấm ngọn, giâm chồi - Khi đưa cúc in vitro vườn ươm có đặc điểm giải phẫu thích ứng với mơi trường tự nhiên có biến đổi thời tiết như: tăng độ dày (tăng 108,11 - 135%); tăng số lượng khí khổng (103,76 - 148,42%); tăng số lơng che chở (103,37 - 120,82%) giảm kích thước khí khổng (90,14 - 92,21%) - Với kỹ thuật bấm ngọn, dùng Atonik ml/lít phun lên mẹ làm tăng số chồi/cây; chồi đạt chiều cao - cm có số - cắt nhúng vào dung dịch α-NAA (đối với giống Đỏ Cờ Thạch Bích) chế phẩm N3M (với giống Chi Vàng) phút để tạo hoàn chỉnh, số rễ/ chồi đạt 26,83; 25,93 26,03 4.2 Kiến nghị Người sản xuất áp dụng kỹ thuật nhân Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong, 2013 Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật NXB Đại học Quốc gia Hà Nội La Việt Hồng, Hoàng Thị Thanh, Nguyễn Thị Chung Anh, Phạm Thị Nhì, 2016 “Xây dựng quy trình sản xuất giống hoa cúc Mê Linh-Hà Nội kỹ thuật nuôi cấy mô” Báo cáo Hội nghị Khoa học Nghiên cứu Giảng dạy sinh học Việt Nam.10141021 Nhà xuất ĐH Quốc gia Hà Nội Deb C.R, Imchen T, 2010 “An efficient in vitro hardening of tissue culture raised plants” Biotechnology 9:79-83 Hazarika B.N, 2003 “Acclimatization of tissue-cultured plants” Curr Sci 85:1704-1712 Lavanya M, Venkateshwarlu B, Devi B.P, 2009 “Acclimatization of neem microshoots adaptable to semi-sterile conditions” Indian J Biotechnol 8:218-222 Pospíšilová J, Ticha I, Kadlecek P, et al, 1999 “Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions” Biol Plant 42:481-497 Teixeira da Silva JA, 2014 “Organogenesis from chrysanthemum (Dendranthema x grandiflora (Ramat.) Kitamura) petals (disc and ray florets) induced by plant growth regulators” Asia-Pacific J Mol Biol Biotechnol 22(1):145-151 Leaf anatomy of in vitro Chrysanthemum in nursery stage and technical measures for propagation Nguyen Van Đinh, Nguyen Thi Oanh, Le Thu Hang, La Viet Hong Abstract Chrysanthemum is one of the most important commercial flowers in the world In This study, in vitro plantlets of Chrysanthemum were hardened in a green house with controlled light intensity and relative humidity by using black sunshade and transparent polyethylene layers Survival rate reached from 83.16 to 91.10 % In hardening stage, leaf anatomical characteristics of plants (such as increase in leaf thickness, stomata density of lower leaf and protective filaments of leaf upper surface, decrease in stomatal size) were adapted to natural environment Plants derived from in vitro propagation showed great growth and high increase in some physilogical parameters including regeneration of root lenght, fress and dry mass of plants 60 old days tissue cultured plants after nursery were used as mother ones The spraying concentration of Atonik preparation was ml/l which was favourable for forming terminal shoots of stock mother plant Both Naphthaleneacetic acid NAA (0.5 mg/l) and N3M (20 g/l) preparation were suitable for rooting of terminal shoots Key words: Chrysanthemum, anatomy, tissue culture, nursery stage, propagation, stock mother plant Ngày nhận bài: 14/3/2017 Người phản biện: TS Nguyễn Thị Kim Lý Ngày phản biện: 20/3/2017 Ngày duyệt đăng: 24/3/2017 53 ... 0,010 lên 0,038 g /cây Trong giống cúc nghiên cứu giống Thạch Bích có khả sinh trưởng tốt 3.1.3 Một số đặc điểm giải phẫu giống cúc giai đoạn vườn ươm Kết giải phẫu giống cúc cấy mô thể bảng hình... KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Một số tiêu sinh trưởng đặc điểm giải phẫu cúc cấy mô giai đoạn huấn luyện 3.1.1 Tỷ lệ sống cấy cúc cấy mô giai đoạn huấn luyện Trong nghiên cứu này, in vitro giống huấn... trưởng giống cúc giai đoạn vườn ươm thông qua tiêu khối lượng tươi, khô toàn thể bảng Phân tích bảng cho thấy giống cúc tăng trưởng tốt giai đoạn vườn ươm, gia tăng khối lượng tươi, khô qua giai