Nghiên cứu enzyme thủy phân polymanuronic acid từ động vật thân mềm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ENZYME THỦY PHÂN POLYMANURONIC ACID TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM Giảng viên hướng dẫn : ThS LÊ NHÃ UYÊN TS HUỲNH HOÀNG NHƯ KHÁNH Sinh viên thực : TRẦN TÍN PHÁT Mã số sinh viên : 55134635 Khánh Hòa: 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ENZYME THỦY PHÂN POLYMANURONIC ACID TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM GVHD : Ths Lê Nhã Uyên : TS Huỳnh Hoàng Như Khánh SVTH : Trần Tín Phát MSSV : 55134635 Khánh Hòa, tháng 6/2017 i LỜI CẢM ƠN Để luận văn đạt kết tốt, em nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo nhiệt tình thầy cơ, gia đình, bạn bè Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn TS Huỳnh Hoàng Như Khánh công tác Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang ThS Lê Nhã Uyên công tác Trường Đại Học Nha Trang tận tình hướng dẫn em suốt trình làm đề tài viết đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Trường Đại Học Nha Trang nói chung, Thầy Cơ Viện Cơng nghệ sinh học Mơi trường nói riêng dạy dỗ cho em kiến thức môn đại cương mơn chun ngành, giúp em có sở lý thuyết vững vàng tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian học tập Em xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang, Trưởng Phịng Cơng nghệ sinh học biển tồn thể Anh, Chị, Cơ, Chú công tác quan giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho em thực tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Với điều kiện thời gian kinh nghiệm hạn chế sinh viên, luận văn tránh thiếu sót Em mong nhận bảo, đóng góp ý kiến thầy để em có điều kiện bổ sung, nâng cao ý thức mình, phục vụ tốt cơng tác thực tế sau Em xin cam đoan kết công trình nghiên cứu em nghiên cứu hướng dẫn khoa học TS Huỳnh Hoàng Như Khánh ThS Lê Nhã Uyên Các nội dung nghiên cứu, tài liệu trích dẫn theo nguồn công bố Kết nêu đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức trước Nha Trang, tháng 06 năm 2017 Sinh Viên Trần Tín Phát ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ vi BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển 1.1.2 Phân loại rong biển 1.1.3 Phân bố ngành rong biển giới 1.1.4 Rong Nâu Việt Nam 1.1.5 Ứng dụng rong biển 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 12 1.2.1 Giới thiệu chung enzyme 12 1.2.2 Cấu tạo enzyme 12 1.2.3 Tính đặc hiệu enzyme 14 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme 15 1.2.4.1 Nồng độ enzyme 15 1.2.4.2 Nồng độ chất 15 1.2.4.3 Chất kìm hãm 18 1.2.4.4 Nhiệt độ……… 18 1.2.4.5 pH môi trường 19 1.2.4.6 Các yếu tố khác 19 1.2.5 Phân loại enzyme 20 1.2.5.1 Oxydoreductase 20 1.2.5.2 Tranferase 20 1.2.5.3 Hydrolase 20 1.2.5.4 Lyase 20 1.2.5.5 Isomerase 20 iii 1.2.5.6 Ligase 20 1.3 CẤU TRÖC HÓA HỌC VÀ ỨNG DỤNG CỦA POLYMANURONIC ACID 21 1.3.1 Cấu trúc polymannuronic acid 21 1.3.2 Ứng dụng polymanuronic acid 22 1.4 ENZYME POLYMANURONIC LYASE 23 1.4.1 Tình hình nghiên cứu sàng lọc polymanuronic lyase giới 24 1.4.2 Tình hình nghiên cứu sàng lọc polymanuronic lyase Việt Nam 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Hóa chất, thiết bị 25 2.1.2 Cơ chất 26 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU 27 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Nghiên cứu tách chiết sàng lọc hoạt tính polymanuronic lyase từ động vật thân mềm biển 28 2.3.2 Phương pháp sắc ký lọc gel 30 2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số 31 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme có dịch chiết 32 2.3.5 Phương pháp kết tủa enzyme muối (NH4)2SO4 33 2.3.6 Phương pháp thẩm tách 34 2.3.7 Phương pháp chuẩn bị dung dịch đệm có pH khác 35 2.3.8 Phương pháp tính tốn 36 2.4 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN XÖC TÁC CỦA POLYMANURONIC LYASE 36 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt động polymanuronic lyase 36 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động polymanuronic lyase 36 2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ đến hoạt động polymanuronic lyase 2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng Cation kim loại đến hoạt động polymanuronic lyase 2.4.5 Khảo sát độ bền nhiệt polymanuronic lyase 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN VÀ D-GALACTURONIC 38 iv 3.1.1 Đường chuẩn protein 38 3.1.2 Đường chuẩn D-Galacturonic 39 3.2 SÀNG LỌC KHẢ NĂNG THỦY PHÂN POLYMANURONIC ACID TRONG RONG NÂU CỦA ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN 40 3.3 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN POLYMANURONIC LYASE TỪ GAN TỤY SÕ MÉO TRISIDOS SEMITORTA 49 3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH XƯC TÁC CỦA POLYMANURONIC LYASE 50 3.4.1 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt động polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 50 3.4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 51 3.4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 53 3.4.4 Kết khảo sát ảnh hưởng cation kim loại polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 54 3.4.5 Kết khảo sát độ bền nhiệt polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 CHƯƠNG 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC 60 Tài liệu tham khảo 60 Phụ lục 1: Kết số liệu khảo sát pH polymanuronic lyase Sò méo Trisidos semitorta 65 Phụ lục 2: Kết số liệu khảo sát nhiệt độ polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 66 Phụ lục 3: Kết số liệu khảo sát thời gian ủ tối ưu polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 67 Phụ lục 4: Kết số liệu khảo sát độ bền nhiệt polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 68 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học (%) có số loại rong Bảng 1.2 Các dạng polysaccharide ngành rong biển Bảng 2.1 Thống kê hóa chất thiết bị dụng cụ cần thiết 25 Bảng 3.1 Kết A595 đường chuẩn BSA .38 Bảng 3.2 Kết A750 đường chuẩn D-Galacturonic 39 Bảng 3.3 Danh sách mẫu động vật thân mềm sàng lọc hoạt tính thủy phân polysaccharide rong Nâu 41 Bảng 3.4 Khối lượng mẫu thể tích dịch chiết .45 Bảng 3.5 Kết sàng lọc hoạt tính polymanuronic lyase động vật thân mềm Việt Nam 46 Bảng 3.6 Kết khảo sát cation kim loại 54 Bảng 4.1 Kết số liệu khảo sát pH 65 Bảng 4.2 Kết số liệu khảo sát nhiệt độ 66 Bảng 4.3 Kết số liệu thời gian ủ tối ưu .67 Bảng 4.4 Kết số liệu độ bền nhiệt 4oC 68 Bảng 4.5 Kết số liệu khảo sát đồ bền nhiệt 30oC 68 Bảng 4.6 Kết số liệu khảo sát độ bền nhiệt 45oC .69 Bảng 4.7 Kết số liệu khảo sát độ bền nhiệt 60oC .69 vi DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất 17 Hình 1.2 Sự phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver-Burk 17 Hình 1.3 Cấu trúc phân tử -D-manuronic acid (ký hiệu M) -L-gluronic acid (ký hiệu G) .21 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử alginic acid theo kiểu liên kết M-M 22 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử alginic acid theo kiểu liên kết G-G 22 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử alginic acid theo kiểu liên kết M-G 22 Hình 2.1 Rong Nâu Laminaria gurjanovae 26 Hình 2.2 Sơ đồ sắc ký lọc gel 31 Hình 2.3 Thẩm tách enzyme 35 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn tương quan mật độ quang học nồng độ protein (µg/ml) 38 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn D-Galacturonic (µg/ml) .40 Hình 3.3 Biểu đồ kết sàng lọc hoạt tính polymanuronic lyase .47 Hình 3.4 Sị méo Trisidos semitorta 48 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme 51 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme 52 Hình 3.7 Thời gian ủ tối ưu enzyme 53 Hình 3.8 Độ bền nhiệt polymanuronic lyase 4oC 55 Hình 3.9 Độ bền nhiệt polymanuronic lyase 30oC 56 Hình 3.10 Độ bền nhiệt polymanruonic lyase 45oC 57 Hình 3.11 Độ bền nhiệt polymanuronic lyase 60oC 57 vii BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt International Union of Biochemistry Hội hóa sinh quốc tế Trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bị KXĐ Khơng xác định Khơng xác định TNFa Tumor Necrosis Factor alpha Yếu tố hoại tử khối u IUB TTHĐ MỞ ĐẦU Việt Nam có 3.000 km bờ biển với thay đổi môi trường sinh thái đa dạng, phong phú Đây đặc điểm thuận lợi nguồn sinh vật biển phát triển phong phú, vùng biển nước ta đánh giá 16 trung tâm đa dạng sinh học cao giới Trong có thảm rong biển chiếm lượng lớn dự đốn 1000 lồi, xác định khoảng 827 lồi rong, gồm khoảng 88 loài rong Lam (Cyanophyta), 180 loài rong Lục (Chlorophyta), 147 loài rong Nâu (Phaeophyta), 412 loài rong Đỏ (Rhodophyta) [32, 46] Trong mười năm trở lại đây, số đơn vị nghiên cứu Việt Nam chiết rút thành công polysaccharide Từ rong biển fucoidan, agar, carrageenan, polymanuronic acid … Tuy nhiên, hầu hết polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, dẫn đến khả ứng dụng chúng lĩnh vực y học dược học cịn hạn chế Bên cạnh đó, oligosaccharide có hoạt tính sinh học chuẩn đặc hiệu để sử dụng làm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm dược phẩm nước ta cịn hạn chế, chưa tương xứng với tiềm chúng Vì vậy, việc sàng lọc tìm kiếm enzyme có khả phân cắt polysaccharide từ rong biển thành oligosaccharide hướng nghiên cứu thiết yếu cho khoa học có giá trị thực tiễn Bên cạnh đó, nguồn thức ăn chủ yếu động vật thân mềm biển rong Để tiêu hóa polysaccharide này, động vật thân mềm phải tổng hợp tiết số enzyme có khả phân giải polysaccharide, chuyển hóa chúng thành chất đồng hóa cho q trình sinh trưởng phát triển Các hợp chất rong Nâu có nhiều tính chất hóa lý, hoạt tính sinh học quí alginate, fucoidan, laminaran, mannitol, iod hữu cơ, hợp chất chuyển hóa thứ cấp , sử dụng nhiều công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dệt, nhuộm, in, thức ăn gia súc, dược liệu Ngoài thành phần đó, rong Nâu cịn chứa lượng tương đối lớn polymannuronic acid (mannuronan), thơng thường để có mannuronan, người ta phải tách chiết alginate sau thủy phân môi trường acid mạnh thành khối mannuronan (block M), guluronan (block G) block MG Tuy nhiên, vài nghiên cứu gần nhà khoa học cho thấy mannuronan thực tế thành phần riêng biệt có mặt rong Nâu, tách chiết khỏi polysaccharide khác mà không cần phải thủy phân từ alginic acid Mannuronan có 55 Theo nghiên cứu (Wong cộng sự, 2000) loài vi khuẩn biển Halomonas , Vibrio harveyi diện cation hóa trị hai Ca2+ Mg2+ cần thiết cho hoạt động enzyme tối ưu Qua kết khảo sát cho thấy polymanuronic lyase từ sị méo khơng thay đổi so với dung dịch đệm thêm EDTA Chứng tỏ enzyme không phụ thuộc cation kim loại 3.4.5 Kết khảo sát độ bền nhiệt polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta Khảo sát độ bền nhiệt enzyme nghiên cứu có ý nghĩa việc nghiên cứu cấu trúc enzyme Từ kết khảo sát, ta đánh giá xem cấu trúc enzyme có chắt chẽ hay khơng Ở loại enzyme có độ chịu nhiệt khác mà yếu tố nhiệt độ enzyme định cấu trúc Enzyme có cấu trúc bền vững khả chịu nhiệt cao enzyme cấu trúc hóa học lỏng lẽo khả chịu nhiệt Từ việc khảo sát giúp ta biết enzyme thích hợp hoạt động nhiệt độ để dễ dàng thực nghiên cứu sau loại enzyme cách bảo quản hợp lý (Kết số liệu khảo sát độ bền nhiệt phụ lục 4)  Độ bền nhiệt polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 4oC 1,4 1,2 A750 0,8 0,6 0,4 0,2 0 10 30 1h phút phút 2h 3h 5h 12h 24h 48h 72h 96h Thời Gian (phút,giờ) Hình 3.8 Độ bền nhiệt polymanuronic lyase 4oC 14 21 ngày ngày 56 Theo kết khảo sát hình 3.8 cho thấy hoạt tính enzyme khơng thay đổi nhiều từ 1h – ngày thứ hoạt tính enzyme vẫng khơng thay đổi, từ ngày thứ đến thứ 21 hoạt tính enzyme bắt đầu giảm, mà hoạt tính giảm từ từ Như thấy 4oC nhiệt độ tối ưu để bảo quản enzyme  Độ bền nhiệt polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 30oC 1,4 1,2 A750 0,8 0,6 0,4 0,2 0 10 phút 1h 2h 3h 5h 12h 24h 32h 48h 72h 96h 120h Thời gian Hình 3.9 Độ bền nhiệt polymanuronic lyase 30oC Kết khảo sát hình 3.9 hoạt tính enzyme điều kiện nhiệt độ enzyme đặt nhiệt độ bắt đầu giảm mạnh 48h, sau 72 hoạt tính enzyme bắt đầu giảm mạnh ngày 120h hoạt tính hồn tồn  Độ bền nhiệt polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 45oC 1,4 1,2 A750 0,8 0,6 0,4 0,2 0 10 phút 30 phút 2h 3h Thời gian 5h 8h 12h 24h 57 Hình 3.10 Độ bền nhiệt Polymanruonic lyase 45oC Qua kết khảo sát hình 3.10, cho thấy hoạt tính enzyme từ thời gian 1h đến 12h hoạt suy giảm dần đều, 12h enzyme bắt đầu giảm hoạt tính mạnh, ½ hoạt tính sau 24h 45oC enzyme hoạt tính sau 48h  Độ bền nhiệt polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta 60oC 1,4 1,2 A750 0,8 0,6 0,4 0,2 0 10 phút 30 phút 1h 2h 3h 5h Thời gian Hình 3.11 Độ bền nhiệt polymanuronic lyase 60oC Qua kết khảo sát độ bền nhiệt 60oC, cho thấy enzyme ½ họa tính chi sau 10 phút, hoạt tính giảm mạnh từ phút đầu tiên, enzyme hồn tồn hoạt tính sau 12h Theo kết nghiên cứu (Khánh cộng sự, 2016) fucoidanase từ Ốc tay quéo Lambis sp bị ½ hoạt tính sau 20 phút 54oC laminaranase từ Ốc mặt trăng Turbo chrysostomus ½ hoạt tính sau 20 phút 50oC Sau khảo sát điều kiện nhiệt độ 4oC, 30oC, 45oC, 60oC cho thấy polymanuronic lyase từ Sò méo enzyme bền nhiệt Từ kết giúp tiến hành nghiên cứu sau tránh trường hợp hoạt tính việc bảo quản sử dụng enzyme hợp lý 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Sau hồn thành thí nghiệm thu kết sau: Trong q trình nghiên cứu, chúng tơi sàng lọc hoạt tính polymanuronic lyase từ 15 mẫu động vật thân mềm biển Các mẫu thí nghiệm thu khu vực Nha Trang Kết sàng lọc hoạt tính polymanuronic lyase 15 mẫu động vật thân mềm cho thấy hoạt tính enzyme tập trung nhóm hai mảnh vỏ Bivalvia Trong số mẫu có hoạt tính cao, chúng tơi chọn mẫu Sị méo Trisidos semitorta để làm đối tượng tách chiết, thu nhận nghiên cứu đặc tính xúc tác polymanuronic lyase Tinh sơ enzyme từ dịch chiết gan tụy mẫu Sò méo Trisidos semitorta phương pháp kết tủa muối vô cơ, thẩm tách loại muối , cô đặc enzyme Bảo quản dịch chiết enzyme tinh -20oC để tránh làm hoạt tính trước tiến hành nghiên cứu Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme nhằm xác định điều kiện tối ưu để enzyme có hoạt tính cao Kết thu sau: enzyme hoạt động tối ưu nhiệt độ 30oC, pH tối ưu để polymanuronic lyase hoạt động 5,5 Enzyme có khả bền nhiệt với nhiệt độ 60oC, ½ hoạt tính 45oC sau 24h Polymanuronic lyase tách từ Sị méo Trisidos semitorta khơng bị ảnh hưởng có mặt ion EDTA, Ca2+, Mg2+ bị kìm hãm ion Zn2+ hay Pb2+, Cu2+, Fe2+ Thời gian phản ứng tối ưu để tạo sản phẩm cao Enzyme tách chiết từ Sò méo Trisidos semitorta enzyme bền nhiệt cao Đây kết mới, thú vị đáng ý kết khảo sát độ bền nhiệt độ polymanuronic lyase từ mẫu động vật thân mềm giới tổng hợp Vì thời gian thực đề tài không nhiều, tiến hành nghiên cứu sâu polymanuronic lyase tách từ Sị méo Trisidos semitorta Trong khn khổ đồ án polysaccharide polymanuronic acid nên không trực tiếp tham gia vào trình tách chiết polymanuronic acid từ rong Nâu, mà sử dụng polysaccharide tách chiết có Viện nghiên cứu Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang 59 Chúng tơi có số kiến nghị sau: Cần có thêm nghiên cứu sâu trình tự amino acid enzyme kĩ thuật sinh học phân tử, tạo tiền đề cho việc tổng hợp bán tổng hợp Cần có thêm nghiên cứu khả thủy phân polymanuronic acid loài vi khuẩn biển nấm biển 60 CHƯƠNG 4: TÀI LIỆU THAM KHẢO VÀ PHỤ LỤC Tài liệu tham khảo Tiếng Việt [1] Bùi Minh Lý (2010) Đánh giá trạng Nghiên cứu giải pháp bảo vệ nguồn lợi rong Mơ (Sargassum) Khánh Hòa Đề tài cấp tỉnh Khánh Hòa [2] Cao Đăng Nguyên, Đỗ Quý Hai (2007) Công nghệ Protein NXB Đại học Huế [3] Đặng Thị Thu Thủy Nguyễn Xn Sâm, Lê Ngọc Trí, Tơ Kim Anh (2004) Cơng Nghệ Enzyme NXB KH-KT Hà Nội [4] Đỗ Quý Hai (2008) Giáo trình cơng nghệ ứng dụng enzyme NXB Đại học Huế [5] Huỳnh Hoàng Như Khánh (2016) Nghiên cứu sàng lọc đặc tính Oglycoside hydrolase từ động vật không xương biển Việt Nam Luận án tiến sĩ sinh học [6] Lê Thị Thủy Rong biển ứng dụng đời sống Bộ môn Y sở II [7] Nguyễn Duy (2015) Rong, tảo – kho báu từ lịng biển Tạp chí thương mại thủy sản số 165 [8] Nguyễn Duy Nhứt (2008) Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học polysaccharide từ số lồi rong Nâu tỉnh Khánh Hịa Luận án tiến sỹ Hóa học, Viện Hóa học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Hà Nội [9] Nguyễn Hữu Dinh Huỳnh Quang Năng (2001) Năm loài thuộc chi rong Mơ - Sargassum ven biển Việt Nam Tạp chí Sinh học, 23(1): 1-10 [10] Nguyễn Hữu Đại (1997) Rong Mơ (Sargassaceae) Việt Nam Nguồn lợi sử dụng NXB Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh,198 trang [11] Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến.(1998) Công Nghệ Enzyme NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh 61 [12] Phạm Đức Thịnh (2015) Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học fucoidan có hoạt tính sinh học từ số loài rong Nâu vịnh Nha Trang Luận án tiến sĩ hóa học [13] Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Ánh (2009) Hóa Sinh Học.NXB Giáo Dục [14] Trần Đình Toại, Châu Văn Minh (2005) Rong biển dược liệu Việt Nam, nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [15] Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2010) chế biến rong biển nhà xuất Nơng Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Tiếng anh [16] Acartiirk F, Takka S Calcium alginate microparticles for oral administration II Effect of formulation factors on drug release and drug entrapment efficiency J Microencapsul; 1999 16:291-301 [17] Boyen C, Bertheau Y, Barbeyron T, Kloareg B Preparation of guluronate lyase from Pseudomonas alginovora for protoplast isolation in Laminaria” Enzyme Microb Technol; 1990, 12:885-90 [18] E D T Atkins, W Mackie, K D Parker, E E Smolko Crystalline structure of poly-D-mannuronic acids and poly-L-guluronic acids Polymer Letters ; 1971, vol 9,311-316 [19] Ellen C Giese , Aneli M Barbosa and Robert F H Dekker Pathways To Bioactive Oligosaccharides: Biological Functions And Potential Applications Handbook of Carbohydrate Polymers Chpt ; 2010 279-309 [20] Fujihara M, Iizima N, Yamamoto I, Nagumo T Purification and chemical and physical characterization of an antitumor polysaccharide from the brown seaweed Sargassumfulvellum Carbohydr Res; 1984 125:97-106 [21] Guiry, Michael D Blunden, Gerald Seaweed resources in Europe : uses and potential G Blunden and Gerald Blunden New York: Wiley & Sons; 1991 219-57 [22] Huynh Hoang Nhu Khanh, Bui Minh Ly, Le Quang Huan, Mikhail Kusaykin Yu V Dubrovskaya ,Cao Thi Thuy Hang, Pham Duc Thinh, Ngo Thi Duy Ngoc Screening Of O-Glycoside Hydrolase From Vietnam Marine Invertebrates Tạp chí Cơng nghệ Sinh học11(2); 2013 275-283 62 [23] Huỳnh Hoàng Như Khánh, Cao Thị Thúy Hằng, Phạm Đức Thịnh, Bùi Minh Lý, Lê Quang Huấn, Ngơ Thị Duy Ngọc, Phan Thị Hồi Trinh, Võ Thị Diệu Trang, Lê Thị Hoa Sự phân bố điều kiện xúc tác β-1,3glucanase động vật không xương sống biển Việt Nam Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 53 (2);2015 139-146 [24] Kim H-J, Lee C-H, Oh J-S, Shin B-A, Oh C-S, et al Polyelectrolyte complex composed of chitosan and sodium alginate for wound dressing application; 1999 [25] Kumar CS, Ganesan P, Suresh PV, Bhaskar N Seaweeds as a source of nutritionally beneficial compounds J Food Sci Technol; 2003 45:1–13 [26] Lin S-S, Ueng SWN, Lee S-S, Chan EC, Chen K-T, et al In vitro elution of antibiotic from antibiotic-impregnated biodegradable calcium alginate wound dressing J Trauma; 1999 47(1):136-41 [27] Lindenhayn K, Perka C, Spitzer R-S, Heilmann H-H, Pommerening K, et al .Retention of hyaluronic acid in al-ginate beads: aspects for in vitro cartilage engineering” J Biomed Mater Res; 1999 44:149-55 [28] Marrit Oteerlei, Anders Sundan, Kajar-Barak G, Liv Ryan, Smidsrodo, Espevik T Similar Mechanisms of Action of Defined Polysaccharides and Lipopolysaccharides: Characterization of Binding and Tumor Necrosis Factor Alpha Induction Infection and Immunity; 1993.61:1917-25 [29] Merrill JE, Waaland JR The seaweed resources of the United State of America In: Seaweed resources of the world” JICA; 1998 303-323 [30] Nagaoka, M., Shibata, H., Kimura-Takagi, I., Hashimoto, S., Kimura, K., Makino, T., Aiyama, R., Ueyama, S., and Yokokura, T Structural study of fucoidan from Cladosiphon okamuranus Tokida Glycoconj J.; 1999.1: 19-26 [31] Nakada HI, Sweeny PC Alginic acid degradation by eliminases from abalone hepatopancreas” J Biol Chem;1967 242:845-51 [32] Nguyen Van Tu Seaweed diversity in Vietnam, with an emphasis on the brown algal genus Sargassum Ghent University Faculty of Sciences, Department of Biology Phycology Research Group; 2014 [33] Oerther S, Le Gall H, Payan E, Lapicque F, Presle N, et al Hyaluronate- 63 alginate gel as a novel biomaterial: mechanical properties and formation mechanism Biotechnol Bioeng; 1999 63:206-15 [34] Ohno M., A T Critchley Seaweed cultivation and marine ranching Bull Mar Sci Fish; 1997 [35] Painter TJ Algal Polysaccharides In: Aspinall GO, editor The polysaccharides New York: Academic Press; 1983 195–285 [36] Park, Y.H, Jan D.S and Kim S.B, Utilization of marine product (2nd edition), Chapter Seaweed composition, Hyóungul press; 1997, 283-336 [37] Percival E Algal polysaccharides The Carbohydrates (Chemistry and Biochemistry) (W Pigman, D.Horton eds.) - N.Y.: Acad Press; 1970- V.IIB - P.541-544 [38] Pham Duc Thinh,Roza V Menshova,Svetlana P Ermakova ,Stanislav D Anastyuk,Bui Minh Ly,Tatiana N Zvyagintseva Structural Characteristics and Anticancer Activity of Fucoidan from the Brown Alga Sargassum mcclurei Mar Drugs; 2013 11(5):1456-1476 [39] Quong D, Neufeld RJ DNA protec-tion from extracapsular nucleases, within chitosan- orpoly-L-lysine-coated alginate beads Biotechnol Bioeng; 1998 60:124-34 [40] S.sadasivam Dr , A.manickam biochemical methods new delhi, new age international publishers, chapter 1:carbohydrates; 1995 5-6 [41] Schaumann K, Weide G Enzymatic degradation of alginate by marine fungi Hydrobiologia; 1990, 204/205:589-96 [42] Skjäk-Braek G, Martinsen A 1991 Ap-plications of some algal polysaccharides in biotechnology In Seaweed Resources in Europe: Uses and Potential, ed MD Guiry, G Blunden, pp 219-57 [43] Stefan Kraan Algal Polysaccharides, Novel Applications and Outlook 2012 [44] Thiang Yian Wong, Lori A Preston and Neal L Schiller Alginate Lyase: Review of Major source and Enzyme Characteristics, Structure Function Analysis, Biological Roles, and Applications Annual Review of Microbiology; 2000; 54, 289-340 [45] Trude H Flo, Liv Ryan, Eicke Latz, Osamu Takeuchi, Brian G Monks, Egil Lien, yvind Halaas, Shizuo Akira, Gudmund Skjåk-Bræk, Douglas T 64 Golenbock, and Terje Espevik, “Involvement of Toll-like Receptor (TLR) and TLR4 in Cell Activation by Mannuronic Acid Polymer”, JBC Papers in Press; June 27; 2002 [46] Tu Van Nguyen , Nhu Hau Le , Showe-Mei Lin , Frederique Steen and Olivier De Clerck, “Checklist of the marine macroalgae of Vietnam”, Botanica Marina ; 2013 56(3): 207–227 [47] Úov, A.I., Smirnova, G.P and Klochkova, N.G Polysaccharide of algae: 55 Polysaccharide composition of several brown algae from Kamchatka Russian Journal of Bioorganic chemistry ; 2001, 395-399 [48] Wijesinghea W.A.J.P., Jeon Y.J Biological activities and potential industrial applications of fucose rich sulfated polysaccharides and fucoidans isolated from brown seaweeds Carbohydrate Polymers; 2012 88:13–20 [49] Woo Jung Kim, Joo Woong Park, Jae Kweon Park, Doo Jin Choi and Yong I Park, Purification and Characterization of a Fucoidanase (FNase S) from a Marine Bacterium Sphingomonas paucimobilis PF-1 Mar Drugs; 2015 13: 4398-4417 65 Phụ lục 1: Kết số liệu khảo sát pH polymanuronic lyase Sò méo Trisidos semitorta Bảng 4.1 Kết số liệu khảo sát pH pH Ống ĐC [E] Ống Ống Ống Trung Bình Lệch chuẩn pH3 pH3,5 pH4 pH4.5 pH5 pH5.5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10 0,221 0,21 0,226 0,193 0,216 0,211 0,15 0,144 1,219 1,234 0,201 0,52 0,51 0,744 1,161 1,485 1,547 1,069 1,106 1,551 1,522 0,538 0,51 0,625 0,852 1,387 1,501 1,538 1,25 1,157 1,511 1,493 0,61 0,61 0,51 0,898 1,165 1,41 1,544 1,26 1,359 1,585 1,6 0,48 0,326 0,338 0,605 1,045 1,249 1,332 1,043 1,063 0,33 0,304 0,342 0,045 0,054 0,065 0,106 0,04 0,004 0,088 0,109 0,03 0,045 0,053 66 Phụ lục 2: Kết số liệu khảo sát nhiệt độ polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta Bảng 4.2 Kết số liệu khảo sát nhiệt độ Nhiệt độ ĐC [E] ống ống ống 10 20 30 37 45 50 60 70 0,151 0,028 0,006 0 0,112 0,125 0,16 0,954 0,931 1,467 1,189 0,959 1,13 0,593 0,433 1,009 1,366 1,276 1,278 1,129 1,219 0,9 0,441 0,159 1,231 0,876 1,486 1,231 1,109 1,277 1,132 0,129 Trung bình 0,053 0,914 1,03 1,404 1,233 1,066 1,097 0,75 0,174 Lệch chuẩn 0,075 0,12 0,219 0,095 0,036 0,076 0,06 0,221 0,145 67 Phụ lục 3: Kết số liệu khảo sát thời gian ủ tối ưu polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta Bảng 4.3 Kết số liệu thời gian ủ tối ưu Thời Gian 30 phút 1h 1h30 2h 2h30 3h 4h 6h 12h ĐC [E] P/Ứ P/Ứ P/Ứ Trung bình 0 0,092 0,309 0,099 0,252 0,183 0,242 0,149 0 0,162 0,441 0,857 1,063 1,353 1,142 1,168 1,372 1,154 0 0,363 1,04 0,956 1,032 1,201 1,446 1,301 1,184 0,167 0,358 0,922 0,985 1,273 1,152 1,442 1,21 1,12 0,11 0,295 0,631 0,902 0,967 0,982 1,11 1,145 1,153 Lệch chuẩn 0,082 0,132 0,281 0,393 0,435 0,426 0,494 0,499 0,5 68 Phụ lục 4: Kết số liệu khảo sát độ bền nhiệt polymanuronic lyase từ Sò méo Trisidos semitorta Bảng 4.4 Kết số liệu độ bền nhiệt 4oC Giờ ĐC E Pứ1 Pứ2 Pứ3 10 phút 30 phút 1h 2h 3h 5h 12h 24h 48h 72h 96h 14 ngày 21 ngày 0,18 0,235 0,265 0,241 0,253 0,421 0,6 0,587 0,498 0,69 0,546 0,61 0,625 0,684 0,816 0,975 1,373 1,351 1,341 1,326 1,421 1,564 1,738 1,589 1,612 1,767 1,626 1,589 1,584 1,545 1,495 1,531 1,426 1,375 1,398 1,354 1,352 1,607 1,698 1,632 1,601 1,675 1,598 1,623 1,479 1,426 1,523 1,51 1,489 1,326 1,336 1,406 1,356 1,468 1,624 1,687 1,517 1,715 1,627 1,652 1,457 1,456 1,475 1,485 Trung bình 1,249 1,116 1,093 1,121 1,123 1,125 1,087 1,049 1,079 1,029 1,071 1,011 0,882 0,792 0,682 0,534 Lệch chuẩn 0,047 0,02 0,028 0,033 0,032 0,058 0,047 0,04 0,042 0,038 0,013 0,026 0,055 0,051 0,02 0,019 Bảng 4.5 Kết số liệu khảo sát đồ bền nhiệt 30oC Giờ ( phút ) 10 1h 2h 3h 5h 12h 24h 32h 48h 72h 96h 120h ĐC E 0,18 0,201 0,169 0,187 0,256 0,131 0,241 1,034 1,129 1,215 0,96 1,056 Pứ1 1,373 1,351 1,169 1,258 1,324 0,921 1,322 1,685 1,846 1,81 1,421 1,485 Pứ2 1,426 1,389 1,247 1,254 1,124 1,321 1,046 1,589 1,862 1,795 1,352 1,301 Pứ3 1,489 1,401 1,152 1,157 1,021 1,152 1,24 1,558 1,868 1,824 1,421 1,356 Trung bình 1,249 1,179 1,02 1,036 0,9 0,962 0,577 0,73 0,595 0,438 0,325 Lệch chuẩn 0,055 0,026 0,043 0,05 0,151 0,195 0,13 0,066 0,011 0,012 0,035 0,093 69 Bảng 4.6 Kết số liệu khảo sát độ bền nhiệt 45oC Phút ĐC E Pứ1 Pứ2 Pứ3 Trung bình Lệch chuẩn 10 phút 30 phút 2h 3h 5h 8h 12h 24h 0,18 0,21 0,195 0,31 0,283 0,18 0,421 0,51 1,373 1,236 0,85 1,131 0,86 0,716 0,956 0,571 1,426 1,268 1,032 0,811 0,812 0,636 0,821 0,85 1,489 1,21 1,204 0,857 0,757 0,502 0,832 0,841 1,249 1,028 0,834 0,623 0,527 0,438 0,449 0,244 0,047 0,024 0,145 0,141 0,042 0,088 0,061 0,129 Bảng 4.7 Kết số liệu khảo sát độ bền nhiệt 60oC Phút ĐC E Pứ1 Pứ2 Pứ3 Trung bình Lệch chuẩn 10 phút 30 phút 1h 2h 3h 5h 0,18 0,285 0,325 0,105 0,18 0,164 1,373 0,933 0,834 0,604 0,51 0,426 1,426 0,787 0,782 0,548 0,447 0,41 1,489 0,821 0,618 0,457 0,351 0,359 1,249 0,562 0,42 0,431 0,256 0,234 0,047 0,062 0,092 0,061 0,065 0,029 ... tài: ? ?Nghiên cứu enzyme thủy phân polymanuronic acid từ động vật thân mềm? ?? Với nội dung sau: 1) Tiến hành thu mẫu động vật thân mềm biển tách chiết phận tiêu hóa để thu nhận dịch chiết enzyme. .. hành nghiên cứu thêm loài động vật thân mềm biển để tìm kiếm thêm lồi khả thủy phân polymanuronic acid tiến hành xác định cấu trúc định danh loài Tiến hành nghiên cứu thêm khả thủy phân polymanuronic. .. tính phân tử enzyme Enzyme cấu tạo từ L-α-amino acid kết hợp với thông qua liên kết peptide Các kết nghiên cứu cho thấy enzyme bị thủy phân tác dụng peptide hydrolase, acid kiềm Khi enzyme thủy phân