Tối ưu hóa điều kiện thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng bằng enzyme alcalase

LỜI CAM ĐOAN Tơi tên là: Hồng Thị Hà MSSV: 58133345 Hiện sinh viên lớp 58CNTP-2, Nghành Công Nghệ Thực Phẩm (khóa 2016- 2020) Tơi xin cam đoan kết đề tài: “Tối ưu hóa điều kiện thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase” kết học tập nỗ lực tơi suốt q trình nghiên cứu, trung thực, nghiêm túc Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm kết nghiên cứu Sinh viên thực Hoàng Thị Hà i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm đề tài tốt nghiệp cố gắng nỗ lực học tập rèn luyện thân, em nhận quan tâm giúp đỡ thầy cô bạn bè Qua báo cáo tốt nghiệp em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Công nghệ Thực phẩm đặc biệt thầy Nguyễn Văn Minh - giáo viên hướng dẫn đồ án tốt nghiệp tận tình giúp đỡ, dạy hướng dẫn em hoàn thành đề tài tốt nghiệp suốt thời gian qua Ngồi cịn có q thầy quản lý Phịng thí nghiệm Chế Biến Cơng Nghệ Thực Phẩm tạo điều kiện tốt cho em suốt trình em làm đề tài tốt nghiệp Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ em nhiệt tình suốt thời gian học tập trình thực đồ án tốt nghiệp để hoàn thành tốt bốn năm theo đuổi ước mơ giảng đường đại học Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Hoàng Thị Hà ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii LỜI MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .4 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÁ NGỪ VÂY VÀNG 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Mùa khai thác 1.1.3 Thành phần khối lượng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tình hình khai thác, chế biến xuất cá ngừ 1.1.5.1 Tình hình khai thác xuất nước 1.1.5.2 Tình hình chế biến sản phẩm từ cá ngừ 1.1.6 Phế liệu từ chế biến cá ngừ hướng tận dụng 10 1.1.6.1 Phế liệu từ chế biến cá ngừ 10 1.1.6.2 Hướng tận dụng phế liệu từ cá ngừ 10 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE VÀ SỰ THỦY PHÂN BẰNG ENZYME 13 1.2.1 Giới thiệu chung enzyme protease 13 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme trình thủy phân … 15 iii 1.2.2.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme 15 1.2.2.2 Ảnh hưởng chất kìm hãm chất hoạt hóa 15 1.2.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 15 1.2.2.4 Ảnh hưởng pH môi trường 16 1.2.2.5 Ảnh hưởng thời gian 16 1.2.2.6 Ảnh hưởng lượng nước 16 1.2.2.7 Ảnh hưởng nồng độ chất 17 1.2.3 Tình hình nghiên cứu nước 17 1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước .17 1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 19 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.1.1 Nội tạng cá ngừ vây vàng 21 2.1.2 Enzyme alcalase 21 2.1.3 Một số thiết bị máy móc sử dụng thí nghiệm 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Quy trình thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase ……… 25 2.2.2 Tối ưu hóa trình thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 30 2.3.1 Hàm lượng nước 30 2.3.2 Hàm lượng protein thô 30 2.3.3 Hàm lượng lipid 30 2.3.4 Hàm lượng tro tổng số 30 2.3.5 Phân tích thành phần acid amin 31 2.3.6 Mức độ thủy phân 31 iv 2.3.7 Độ hòa tan 31 2.3.8 Xác định suất 31 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 31 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA NỘI TẠNG CÁ NGỪ VÂY VÀNG 32 3.2 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN 33 3.2.1 Ảnh hưởng điều kiện thủy phân đến độ thủy phân độ hòa tan ……… 33 3.2.2 Kết tối ưu hóa theo độ thủy phân 34 3.2.3 Kết tối ưu hóa theo độ hịa tan 42 3.2.4 Kết tối ưu đồng thời độ thủy phân độ hòa tan 47 3.3 ĐÁNH GIÁ DỊCH THỦY PHÂN Ở ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU 49 3.3.1 Thành phần hóa học 49 3.3.2 Kết thành phần acid amin 51 3.4 HIỆU SUẤT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN NỘI TẠNG CÁ NGỪ BẰNG ENZYME ALCALASE 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .54 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .55 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần khối lượng cá ngừ vây vàng Bảng 2: Thành phần hóa học cá ngừ Bảng 3: Thành phần dinh dưỡng cá ngừ vây vàng Bảng 1.4: Tỉ lệ thành phần cá ngừ vây vàng 10 Bảng 1: Các mức mã hóa giá trị yếu tố khảo sát cho thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện thủy phân protein 27 Bảng 2: Giá trị biến thực biến mã hóa cho thí nghiệm tối ưu hóa 28 Bảng 1: Thành phần hóa học nội tạng cá ngừ vây vàng …………………….32 Bảng 2: Độ thủy phân độ hòa tan dịch protein thủy phân 33 Bảng 3: Bảng phân tích phương sai 35 Bảng 4: Ước lượng tham số mơ hình dự đốn ảnh hưởng biến đến hàm mục tiêu 35 Bảng 5: Kiểm tra kết phân tích phương sai 36 Bảng 6: Kết tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến độ thủy phân 37 Bảng 3.7: So sánh độ thủy phân thực tế độ thủy phân dự đoán 40 Bảng 8: Bảng phân tích phương sai 42 Bảng 9: Ước lượng tham số mơ hình dự đốn ảnh hưởng biến đến hàm mục tiêu 42 Bảng 10: Kiểm tra hiệu phân tích phương sai 43 Bảng 11: Kết tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan 43 Bảng 12: So sánh độ thủy phân thực tế độ thủy phân dự đoán 46 Bảng 13: Kết độ thủy phân độ hòa tan mẫu tối ưu 48 Bảng 14: Thành phần hóa học dịch thủy phân điều kiện tối ưu 50 Bảng 15: Thành phần acid amin dịch thủy phân 51 Bảng 16: Năng suất trình thủy phân 53 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Cá ngừ vây vàng Hình 2: Xuất cá ngừ Việt Nam từ năm 2019 đến tháng 5/2020 Hình 1: Sơ đồ quy trình thủy phân……………………………………………… 26 Hình 1: Đường viền bề mặt đáp ứng phụ thuộc yếu tố ảnh hưởng đến độ thủy phân ……………………………………………………… .………38 Hình 2: Mối tương quan độ thủy phân thực tế độ thủy phân dự đốn phương trình hồi quy 41 Hình 3: Đường viền bề mặt đáp ứng phụ thuộc yếu tố độ hịa tan 44 Hình 4: Mối tương quan độ thủy phân thực tế dự đốn 47 Hình 5: Mơ hình đáp ứng bề mặt thể tương tác yếu tố đến độ hòa tan độ thủy phân 48 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ASEAN Association of Southeast Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á Asian Nation AU Anson Units Đơn vị Anson Units DNFB 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzen 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzen EU European Union Liên minh châu Âu JMP Jump Phần mềm phân tích liệu KT&BVNLTS Khai thác bảo vệ nguồn lợi thủy sản MUFA Monounsaturated fatty acid Acid béo khơng bão hịa đơn PA Polyamide Polyamide PUFA Polyunstaturated fatty acid Acid béo khơng bão hịa đa nối đơi TCVN VASEP Tiêu chuẩn Việt Nam Vietnam Association of Hiệp hội Chế biến Xuất Thủy Seafood Exporters and sản Việt Nam Producers viii LỜI MỞ ĐẦU Khơng có giá trị dinh dưỡng cao mà sản phẩm chế biến từ ngun liệu thủy sản cịn góp phần lớn trình phát triển kinh tế nước nói chung Việt Nam nói riêng Bên cạnh phát triển đầy cạnh tranh thị trường giới đầy tiềm Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc nước châu Âu, chất lượng đa dạng sản phẩm chế biến từ cá ngừ vây vàng ngày đòi hỏi cao hơn, thách thức lớn cho Việt Nam Cùng với phát triển ngành đánh bắt chế biến sản phẩm từ cá ngừ vây vàng việc tận thu ngun liệu cịn lại từ chế biến (đầu, xương, nội tạng, thịt vụn, ) hướng nghiên cứu đề cập nhiều gần Bởi mang lại hiệu kinh tế cao, giảm phần lớn lượng rác thải phế liệu q trình sản xuất ngồi mơi trường tận thu hiệu giá trị dinh dưỡng từ nguồn nguyên liệu Nắm bắt quan trọng việc nghiên cứu tận thu hiệu phế phẩm từ cá ngừ vây vàng có nhiều nghiên cứu thực nhằm sử dụng nguồn nguyên liệu để chế biến sản phẩm có giá trị gia tăng Đề tài nghiên cứu “Tối ưu hóa điều kiện thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase” phát triển dựa tảng nghiên cứu trước để xây dựng hồn thiện Nhằm tận dụng thành phần protein có nội tạng cá ngừ vây vàng sau thủy phân, để sản xuất bổ sung vào sản phẩm có giá trị kinh tế cao như: bổ sung dịch thủy phân protein vào sản xuất nước mắm, thức ăn cho tơm, cá,… Trong q trình học tập bốn năm Trường Đại học Nha Trang dạy hướng dẫn nhiệt tình thầy cơ, lần đâu tiên em trực tiếp thực đề tài nghiên cứu Với lượng kiến thức hạn hẹp thân trình thực khơng thể tránh khỏi sai sót, kính mong thầy góp ý, bổ sung để báo cáo em hoàn thiện Sinh viên thực Hoàng Thị Hà ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Với phát triển ngày mạnh mẽ ngành khai thác thủy sản nay, bên cạnh giá trị kinh tế cao kéo theo phế liệu thủy sản thải môi trường ngày nhiều lên Vì vậy, vấn đề sử dụng hợp lý, tiết kiệm tận dụng tối đa nguyên liệu lại chế biến thủy sản gần đề cập đến ngày nhiều Nhằm giảm mức hao phí nguyên liệu sản xuất, tăng giá trị kinh tế, hạn chế lượng chất thải môi trường góp phần nâng cao hiệu tận dụng phế liệu Từ tạo loại sản phẩm, chế phẩm có giá trị cao làm đa dạng hóa mặt hàng thị thường Phế liệu chế biến thủy sản phần như: đầu, xương, vây, nội tạng, da,… thải sau thu nhận ngun liệu Theo nghiên cứu trước cơng bố, nguyên liệu bỏ chứa lượng không nhỏ chất dinh dưỡng protein, lipid, acid amin,… Tuy nhiên, phần giá trị dinh dưỡng chúng lại chưa khai thác hiệu nên gây lãng phí nhiễm mơi trường Chính vậy, có nhiều nghiên cứu chiết xuất protein, dầu, enzyme từ nguyên liệu lại ứng dụng sản xuất sản phẩm có giá trị cao sản xuất bột khoáng, nước mắm, thức ăn cho tôm, cá,… đạt kết khả quan ứng dụng hiệu sống Cá ngừ nói chung cá ngừ vây vàng nói riêng loại cá khơng có giá trị kinh tế cao mà giá trị dinh dưỡng vượt bậc Qua phân tích thành phần hóa học lồi cá ngừ cho thấy, chúng có hàm lượng protein cao Nên hướng để thu nhận nguồn protein hiệu cao cần cân nhắc nghiên cứu nhiều năm Với tình hình dịch bệnh Covid-19 dần phức tạp khó kiểm sốt nay, ảnh hưởng lớn đến tình tình tiêu thụ cá ngừ kim ngạch xuất cá ngừ Việt Nam Vì vậy, ngành cơng nghiệp chế biến cá ngừ cần phải tìm phương thức thích hợp, để tận dụng tối đa nguồn nguyên liệu giá rẻ phế liệu đặc biệt phần nội tạng cá ngừ (một nguồn giàu protein) Nhằm biến chúng trở thành sản phẩm, chế phẩm có giá trị gia tăng, từ làm phong phú sản phẩm thị 68 http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/1211_60009/Xuat-khau-ca-ngu-hop-cua-Viet-Namtang.htm 69 http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/1019_61507/Ca-ngu-dong-hop-Viet-Nam-chuachiem-linh-duoc-thi-truong-Sec.htm 60 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH TRONG Q TRÌNH THÍ NGHIỆM Ngun liệu sau xay bỏ vào PA để bảo quản tủ đông Mẫu chuẩn bị để đưa thủy phân Mẫu tối ưu sau thủy phân Mẫu tối ưu sau ly tâm Mẫu nguyên liệu sau ly tâm Lọc Mẫu chuẩn bị để đo độ thủy phân Mẫu chuẩn bị để đo độ hịa tan Mẫu trước tiến hành vơ hóa Mẫu sau vơ hóa Mẫu trước chuẩn độ Mẫu sau chuẩn độ PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Xác định hàm lượng nước Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3700-90 thủy sản Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao làm bay lượng nước mẫu Cân khối lượng trước sau sấy Từ tính phần trăm nước có mẫu Tiến hành: Cân xác g mẫu cho vào cốc sấy sấy cân đến khối lượng không đổi, dùng đũa thủy tinh trộn mẫu dàn thành lớp mỏng để tang diện tích tiếp xúc giúp q trình sấy nhanh Cho cốc mẫu chuẩn bị vào tủ sấy, giai đoạn đầu sấy 60°C giờ, sau nâng nhiệt độ lên 105°C giữ Sau sấy giờ, lấy cốc cho vào bình hút ẩm để nguội 30 phút sau đem cân Sấy tiếp 30 phút tiến hành để nguội đem cân lần Nếu khối lượng cốc hai lần cân không lệch 0,001 g dừng q trình sấy, cịn chênh lệch lớn 0,001 g tiếp tục sấy đến khối lượng khơng đổi Hàm lượng nước tính theo cơng thức: 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑛ướ𝑐 (%) = m1 − 𝑚2 × 100% m Với: m1 khối lượng cốc mẫu (g), m2 khối lượng cốc mẫu sau sấy (g), m khối lượng mẫu đem phân tích (g) Xác định hàm lượng protein thơ Xác định theo phương pháp Kjeldanl Nguyên lý  Vô hóa mẫu H2SO4 đậm đặc, dùng hỗn hợp xúc tác CuSO4/K2 SO4 tỷ lệ 1:10 nhiệt độ cao để chuyển Nitơ dạng (NH4)2 SO4 Rồi dùng kiềm NaOH 40% KOH đẩy NH3 từ muối (NH4)2 SO4 hình thành thể tự Sau dùng H2SO4 0,1N dư hấp thụ Rồi dùng NaOH tiêu tốn từ tính lượng Nitơ Các phản ứng xảy ra: CR-CH-COOH NH2 CO2 + SO2 + H2O + NH3 t , xt NH3 + H2SO4 dddư (NH4)2 SO4 NaOH + (NH4)2 SO4 Na2SO4 + NH3 + H2O H2SO4dư + NaOH Na2SO4 + H2O Tiến hành:  Đốt đạm: Cho 0,5 g mẫu, g chất xúc tác (K2SO4 CuSO4 theo tỉ lệ 9:1) vào ống Kjeldahl sau cho thêm 15 ml H2SO4 đậm đặc từ từ vào bọc kín ống đưa vơ thiết bị vơ hóa mẫu cài đặt chương trình vơ hóa sẵn Nhiệt độ nâng từ nhiệt độ phòng đến 150°C 30 phút, sau giữ nhiệt vịng 30 phút, nâng từ 150°C lên 250°C 30 phút, từ 250°C đến 350°C 30 phút giữ ngun vịng 70 phút Cả q trình vơ hóa tiến hành vịng đến thu dung dịch suốt không màu có màu xanh để nguội sau đem chung cất  Chưng cất: Sau vơ hóa mẫu hồn tồn, cho giọt phenolphtalein vào ống Kjeldahl đựng mẫu, tiến hành chung cất phải tráng ống Kjeldahl nước cất để lấy hết lượng mẫu Sau dùng 40 ml NaOH 40% vào, cho mẫu chuyển sang màu tím đen Cốc hứng 250 ml phải chuẩn bị sẵn 25 ml acid Boric 4%, cho thêm giọt methy đỏ vào để ngập ống sinh hàn suốt trình chưng cất Sau 20 phút chưng cất kiểm tra lại đầu ống sinh hàn quỳ tím khơng đổi màu q trình kết thúc cịn làm đổi màu quỳ tím phải tiếp tục chưng cất  Chuẩn độ: Lấy cốc hứng đem chuẩn độ H2SO4 0,1N, đến cốc hứng chuyển từ màu vàng sang màu hồng dừng lại đọc kết Ta có cơng thức: 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑡ℎơ = (b − a) × 0,1 × 14 × 100 × 6,25 m × 1000 Với  a số ml H2SO4 0,1N tiêu tốn để chuẩn độ mẫu trắng  b số ml H2SO4 0,1N tiêu tốn để chuẩn độ mẫu  m khối lượng mẫu (g)  14 khối lượng phân tử nito  6,25 hệ số chuyển đổi nito sang protein thô  1000 hệ số chuyển từ milimol sang mol Cách pha hóa chất  NaOH 40%: tỉ lệ (NaOH: H2O 4:10) cân 200 g NaOH hòa tan nước cất định mức lên 500 ml  Acid boric H3PO3 4%: cân 10 g acid boric hòa tan nước cất định mức lên 250 ml  H2SO4 0,1N: mua ống dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N hòa tan nước cất định mức lên 1000 ml Xác định hàm lượng lipid Xác định theo phương pháp Bligh Dyer (1959) Nguyên lý: Dùng hỗn hợp dung mơi chloform methanol để hịa tan chất béo Tách chiết hỗn hợp dung môi chất béo cách đưa ly tâm Sau sấy làm bay hết dung môi, cân chất béo cịn lại tính hàm lượng chất béo Tiến hành: Lấy khoảng 25 g mẫu nội tạng cá sau xay nhỏ, mẫu thủy phân dùng khoảng ml cho vào ống ly tâm 250 ml, sau đưa đồng hóa với 25 ml chloroform 50 ml methanol vòng phút 10000 rpm có lót đá vảy phía ống để lipid khơng bị oxy hóa nhiệt sinh q trình đồng hóa Sau cho thêm 25 ml chloroform tiếp tục đồng hóa vịng phút, tiếp đến cho 25 ml KCl 0,88% vào đồng hóa phút Dịch sau đồng hóa xong đem ly tâm 2500 rpm 25 phút, sau tách lớp lấy phần dịch có chứa lipid sau ly tâm lấy 0,45 ml dung dịch vào ống nghiệm thủy tinh cân khối lượng định mức lên ml chloroform Sau đưa sấy nhiệt độ 50-55°C đến đuổi hết chloroform lại lipid ống nghiệm dừng lại trình sấy để nguội nhiệt độ phòng đem cân lại khối lượng lipid thu Hàm lượng lipid tính theo cơng thức: 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑙𝑖𝑝𝑖𝑑 = (b − a ) × c × 100% d×m Trong đó:  b khối lượng ống nghiệm có chứa lipid sau sấy đuổi hết chloroform (g)  a khối lượng ống nghiệm ban đầu cân (g)  m khối lượng mẫu (g)  d lượng lipid có d ml mẫu chứa lipid trước sấy (g)  c lượng lipid có c ml mẫu sau ly tâm (g) Các hóa chất:  Methanol  Chloroform  Dung dịch KCl 0,88% Xác định hàm lượng tro Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5105:2009 Nguyên lý: Dùng sức nóng 550-600°C nung cháy hoàn toàn chất hữu thành tro trắng Phần cịn lại đem cân tính hàm lượng khống có thực phẩm Tiến hành: Cân 10 g mẫu nguyên liệu mẫu thủy phân g cho vào cốc nung nung đến khối lượng khơng đổi Mẫu vơ hóa trước bếp tủ hốt cháy hoàn tồn thành than đen q trình vơ kết thúc Cho cốc chứa mẫu vào lò nung nhiệt độ 600°C giữ nhiệt độ khoảng đến kiểm tra mẫu đến mẫu thành tro trắng kết thúc nung Tắt điện lị nung, chờ cho nhiệt độ hạ bớt lấy cốc nung ra, cho vào bình hút ẩm để nguội 30 phút cân Tiếp tục nung nhiệt độ 30 phút, để nguội cân Nếu khối lượng cốc hai lần cân không lệch 0,001 g dừng q trình nung, cịn chênh lệch lớn 0,001 g tiếp tục nung đến khối lượng khơng đổi Hàm lượng tro tính theo công thức: 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜 (%) = m1 − 𝑚2 × 100% m Với: m1 khối lượng mẫu cốc sau nung (g), m2 khối lượng cốc nung (g), m khối lượng mẫu đem phân tích (g) Xác định độ hòa tan Theo phương pháp biuret (Taheri et al, 2013) Nguyên lý: Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với ion Cu2+ tạo thành phức chất màu tím (phản ứng biuret), màu sắc phức chất tỷ lệ với số liên kết peptid (-CO– NH) protein Sự tạo phức xảy Hình 1: Hình 1: Cơng thức tạo phức cho thuốc thử biuret vào protein Tiến hành:  Chuẩn bị mẫu cân 50 g mẫu nguyên liệu vào cốc thủy tinh 250 ml, cho thêm dung dịch đệm 50 ml vào khuấy trộn đem đồng hóa mẫu để tạo mẫu đồng Sau đem ly tâm 5000 vòng/phút 25 phút tách lấy dịch đưa định mức dung dịch đệm lọc  Lấy 0,1 ml dung dịch mẫu lọc cho vào ống nghiệm có nắp sau cho thêm ml nước cất vào, tiếp đến 2,5 ml dung dịch Biuret chuẩn bị trước vào mẫu đưa ủ bóng tối vịng 35 phút Chú ý bên cạnh việc chuẩn bị mẫu ln phải chuẩn bị mẫu trắng để so sánh màu Cuối đo với bước sóng 540 nm ghi lại kết tính theo phương trình tuyến tính hồi quy y = mx+b Độ hịa tan protein tính sau: Độ ℎò𝑎 𝑡𝑎𝑛 (%) = 𝑡ổ𝑛𝑔 ℎà𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑑ị𝑐ℎ × 100% 𝑡ổ𝑛𝑔 ℎà𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ẫ𝑢 Độ ℎò𝑎 𝑡𝑎𝑛 (%) = 𝐴 × 40 × 100 𝑃×8 Với:  A lượng acid amin tự hình thành trình thủy phân (mg/ml) A theo đường chuẩn ta có: 𝐴= 𝑂𝐷 − 0,0109 × 11 0,0504  11 hệ số pha loãng mẫu đem đo OD  40 hệ số pha loãng mẫu ban đầu  P hàm lượng protein g dịch thủy phân (mg) Bảng 1: Kết đo OD (540 nm) dựng đường chuẩn Ống nghiệm Hàm lượng BSA (mg/ml) OD (540 nm) 1 0,056 2 0,108 0,217 0,322 0,418 0,464 10 0,506 Độ hấp thụ (540 nm) 0.6 y = 0.0504x + 0.0109 R² = 0.9987 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 12 Độ hịa tan (%) Hình 1: Đường chuẩn độ hịa tan Cách pha hóa chất:  Dung dịch đệm bỏ vào mẫu ban đầu: hòa tan Na2HPO4 1M 4,66 ml, NaH2PO4 1M 0,34 ml vào 45 ml nước cất để đủ 50 ml cho mẫu nguyên liệu cho vào cốc theo tỉ lệ mẫu: dung dịch đệm 50:50  Dung dịch biuret: hòa tan 1,5 g CuSO4*5 H2O, g NaKC4H4O6*4 H2O, 300 ml NaOH (10%) nước cất định mức lên 1000 ml  Dung dịch đệm để lọc: phối trộn dung dịch Na2HPO4 1M 4,66 ml, NaH2PO4 1M 0,34 ml theo tỉ lệ 1: 1, Cho vào mẫu định mức toàn mẫu lên 40 ml để đồng mẫu Xác định mức độ thủy phân Xác định mức độ thủy phân sử dụng DNFB Nguyên lý: Độ thủy phân xác định tỉ lệ số liên kết peptit bị cắt đứt tổng số liên kết peptit có mẫu đơn vị khối lượng protein Khi liên kết peptit bị cắt đứt hình thành nhóm amin tự (NH2) sau định lượng để xác định độ thủy phân Nhóm amin tự tham gia phản ứng với dinitroflourobenzene (DNFB) tạo hợp chất dinitrophenyl có màu vàng ủ nhiệt độ 60°C 10 phút, đo bước sóng 410 nm máy quang phổ UV–Vis Tiến hành: Lấy 0,1 ml mẫu dịch thủy phân ly tâm pha loãng 100 ml nước cất Sau từ dịch pha lỗng lấy ml cho vào ống nghiệm có nắp làm sạch, song hành phải chuẩn bị mẫu trắng Tiếp tục cho thêm ml dung dịch sodium tetraborate 2% vào mẫu lắc Sau cho thêm vào mẫu 0,25 ml dung dịch DNFB lắc kĩ Tất mẫu cho vào bể ổn nhiệt nhiệt độ 60°C vòng 10 phút, làm nguội tiếp tục cho thêm ml acid HCl 10N vào đưa đo OD bước sóng 410 nm đọc kết theo phương trình đường chuẩn Bảng 2: Kết đo OD dựng đường chuẩn (410 nm) Nồng độ 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 40 80 120 160 200 Nước (µl) 1000 960 920 880 840 800 OD 0,246 0,497 0,725 0,931 1,139 (mM) Glycine 5mM (µl) 1.4 y = 1139.7x + 0.0198 R² = 0.9981 OD (410 nm) 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 Nồng độ (mM) 0.001 0.0012 Hình 2: Đường chuẩn độ thủy phân Kết độ thủy phân tính theo cơng thức: Độ 𝑡ℎủ𝑦 𝑝ℎâ𝑛 (𝐷𝐻) = Độ 𝑡ℎủ𝑦 𝑝ℎâ𝑛 (𝐷𝐻) = ℎ × 100 ℎ𝑡𝑜𝑡 𝐴 × 75,07 × 100 × 100 Với:  h số liên kết peptid bị phá vỡ  ℎ𝑡𝑜𝑡 tổng số liên kết peptid đơn vị khối lượng Trong mẫu cá ℎ𝑡𝑜𝑡 = liên kết peptid/g protein (Adler- Nissen, 1986)  75,07 khối lượng phân tử glycine  A lượng acid amin tự hình thành trình thủy phân (mg/ml) A theo đường chuẩn ta có: 𝐴= 𝑂𝐷 − 0,0198 1139,7 Cách pha hóa chất  HCl 10N: định mức đến 250 ml có 208,3 ml HCl đậm đặc 41,7 ml nước cất  NaOH 2%: tỉ lệ NaOH: H2O 2:100, hòa tan g NaOH vào nước định mức lên 250 ml bình định mức 250 ml  Dung dịch DNFB: Tỉ lệ ethanol: DNFB 1:0,013 (ml), pha trộn 50 ml ethanol với 0,65 ml DNFB rã đông trước bảo quản tủ lạnh tránh tiếp xúc với ánh sáng PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TRONG NGUYÊN LIỆU Hàm lượng nước Bảng 1: Hàm lượng nước nội tạng cá ngừ vây vàng nguyên liệu Mẫu Khối lượng ban đầu (g) Khối lượng sau sấy (g) Khối lượng cốc (g) Hàm lượng nước (%) 59,7338 56,9759 56,1036 75,97 61,4627 58,6906 57,8277 76,26 60,4562 57,6062 56,9337 75,73 Trung bình (%) Độ lệch chuẩn Kết 75,99 0,26 75,99±0,26 Hàm lượng protein thô Bảng 2: Hàm lượng protein thô nội tạng cá ngừ vây vàng nguyên liệu Mẫu a (ml) b (ml) m Hàm lượng (g) protein thô (%) 0,2 14,45 0,5103 24,43 0,2 10,25 0,5093 17,27 0,2 12,20 0,5101 20,58 Trung Độ bình lệch (%) chuẩn 20,76 3,58 Kết 20,76±3,58 Hàm lượng lipid Bảng 3: Hàm lượng lipid mẫu nội tạng cá ngừ vây vàng Khối Mẫu lượng ban đầu (g) Lượng Khối Hàm mẫu lượng sau lượng (ml) sấy (g) lipid (%) 21,2622 21,3149 4,6555 21,1133 21,1520 3,4187 21,1243 21,1658 3,6661 Độ Hàm lệch lượng chuẩn lipit (%) 3,9134 0,6544 3,91±0,65 Trung bình Hàm lượng tro Bảng 4: Hàm lượng tro mẫu nguyên liệu Khối Khối lượng lượng ban sau đầu (g) nung (g) 45,1645 Mẫu nguyên liệu Khối Hàm lượng lượng cốc (g) tro (%) 34,447 34,3135 1,23 45,5328 35,2616 35,095 1,60 45,3568 35,0705 34,9324 1,32 Trung Độ lệch bình chuẩn 1,38 0,19 Kết 1,38±0,19 PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TRONG DỊCH THỦY PHÂN Ở ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU Hàm lượng nước Bảng 1: Hàm lượng nước mẫu thủy phân Mẫu thủy phân Khối lượng ban đầu (g) Khối lượng sau sấy (g) Khối lượng cốc (g) Hàm lượng nước (%) 66,7475 63,9308 63,5692 88,62 63,1675 60,3568 59,9937 88,56 64,5673 61,5623 61,0014 88,49 Trung bình Độ lệch chuẩn Kết 88,56 0,07 88,56±0,07 Hàm lượng protein thô Bảng 2: Kết hàm lượng protein thô dịch thủy phân Lần a (ml) b (ml) m (ml) Hàm lượng protein thô (%) 0,2 21,15 9,17 0,2 20,42 8,85 0,2 21,09 9,14 Trung bình Độ lệch chuẩn Hàm lượng protein thơ (%) 9,05 0,18 9,05±0,18 Hàm lượng lipid Bảng 3: Hàm lượng lipid mẫu thủy phân điều kiện tối ưu Khối lượng Mẫu ban đầu (g) Lượng mẫu (ml) Khối lượng sau sấy (g) Hàm lượng lipid (%) 11,2114 11,2119 0,0499 10,9796 10,9809 0,1298 11,5736 11,5745 0,0899 Trung bình Độ lệch chuẩn Hàm lượng lipit (%) 0,0899 0,0399 0,09±0,04 Hàm lượng tro Bảng 4: Hàm lượng tro mẫu tối ưu thủy phân Mẫu Khối lượng cốc mẫu (g) Khối lượng cốc mẫu sau nung (g) Khối lượng cốc (g) Hàm lượng tro (%) 65,0586 59,7038 59,6526 0,95 69,9941 64,7743 64,728 0,88 65,6097 59,5634 59,4965 0,88 Trung bình Độ lệch chuẩn Kết 0,90 0,04 0,90±0,04 Kết độ thủy phân độ hòa tan điều kiện tối ưu Bảng Kết độ thủy phân độ hòa tan điều kiện tối ưu Độ thủy phân (%) Độ hòa tan (%) Độ hòa tan protein thủy phân (%) 67,03737 25,02947 68,5703 0,8 66,87270 27,42084 72,14043 53,5 0,8 67,20204 27,8538 72,14043 53,5 0,8 Nồng độ enzyme (%) Mẫu Thời gian (giờ) Nhiệt độ 6,6 53,5 0,8 6,6 53,5 6,6 TB 6,6 (°𝐂) 67,04±0,16 27,07±1,01 70,95±2,06 ... để thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase để thu nhận dịch protein hòa tan Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase. .. dụng để đánh giá 2.2.2 Tối ưu hóa q trình thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase Có nhiều phương pháp tối ưu hóa q trình thủy phân protein từ nội tạng cá ngừ vây vàng Và nghiên cứu em,... Quy trình thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase ……… 25 2.2.2 Tối ưu hóa q trình thủy phân nội tạng cá ngừ vây vàng enzyme alcalase 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH