Nghiên cứu ảnh hưởng của chitin lên sự sinh trưởng và khả năng chịu stress của tôm he chân trắng (litopenaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHITIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG CHỊU STRESS CỦA TÔM HE CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) GVHD: TS Trần Vĩ Hích ThS Nguyễn Công Minh SVTH: Nguyễn Thị Nhật Anh MSSV: 58131167 Khánh Hòa, ngày 11 tháng năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tác động Chitin lên sinh trưởng khả chịu stress tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei)” công trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng thân tơi Các số liệu kết quả, hình ảnh nghiên cứu đề tài ghi lại cách chân thực khách quan trình thực Mọi giúp đỡ cho việc thực đồ án tốt nghiệp cảm ơn thông tin trích dẫn đồ án ghi nguồn gốc rõ ràng phép công bố Sinh viên thực Nguyễn Thị Nhật Anh TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Nghiên cứu thực nhằm xác định hiệu tích cực việc đưa Chitin vào thể tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei) theo đường cho ăn Sau tuần thí nghiệm, tơm đánh giá ảnh hưởng Chitin đến tăng trưởng, tiêu miễn dịch liên quan tổng số tế bào máu (THC), định loại bạch cầu; khả đề kháng tôm chống lại NH3 vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh chết sớm (EMS) tôm Kết nghiên cứu ghi nhận (i) Việc bổ sung Chitin từ nồng độ 0,1% - 8% vào thức ăn tôm he chân trắng không làm ảnh hưởng đến tăng trưởng tôm (ii) Tổng số tế bào máu, BC không hạt, BC có hạt gia tăng nghiệm thức 1%, 2% Chitin; (iii) Tỷ lệ chết tích lũy tơm stress NH3 nghiệm thức 2% Chitin thấp nhất; (iv) Tơm thí nghiệm nghiệm thức 1%, 2% Chitin có sức đề kháng tốt chống lại vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus, tỷ lệ sống đạt 100% đến thời điểm kết thúc Như vậy, với kết cho thấy tôm he chân trắng nuôi chế độ ăn bổ sung với hàm lượng Chitin 1%, 2% giúp kích thích tăng cường khả miễn dịch, chống lại NH3 không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống tôm he cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus LỜI CẢM ƠN Thời gian thực đồ án tốt nghiệp q trình khơng ngừng nỗ lực cố gắng hoàn thành tốt đề tài thân em Thời gian em nhận nhiều giúp đỡ, động viên khích lệ từ thầy cơ, anh chị, bạn bè người thân Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người giúp đỡ em thời gian vừa qua Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện cho em tiếp thu kiến thức tảng chuyên ngành Công nghệ Sinh học, giúp em thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn bày tỏ lòng kính trọng sâu sắc đến GVHD TS Trần Vĩ Hích ThS Nguyễn Cơng Minh ln tận tình giúp đỡ dẫn truyền đạt cho em nhiều phương pháp nghiên cứu hữu ích suốt q trình thực đề tài tốt nghiệp Trung tâm Nghiên cứu Giống Dịch bệnh Thủy sản Em xin gửi lời cảm ơn đến hai cô cố vấn học tập TS Phạm Thị Minh Thu ThS Nguyễn Thị Kim Cúc ln ln tận tình giúp đỡ em q trình học tập Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị, bạn bè tập thể lớp 58CNSH làm việc Trung tâm Nghiên cứu Giống Dịch bệnh Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang ln giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Các bạn giúp đỡ tôi cần, luôn trân trọng khoảng thời gian quý báu Cuối cùng, lời cảm ơn xin gửi đến gia đình tơi ln ln bên cạnh, hậu phương vững chắc, động viên, cổ vũ tinh thần cho em vượt qua khó khăn thử thách Xin chân thành cảm ơn tất người! Khánh Hòa, ngày 11 tháng năm 2020 Nguyễn Thị Nhật Anh MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .2 TRÍCH YẾU LUẬN VĂN LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC Trang ii DANH MỤC VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei) 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Nguồn gốc phân bố .5 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Tình hình ni tơm he chân trắng 1.1.4.1 Tình hình ni tơm he chân trắng giới 1.1.4.2 Tình hình ni tôm he chân trắng Việt Nam .9 1.1.5 Tác động NH3 môi trường nước tôm he chân trắng 11 1.1.6 Bệnh gây chết sớm (EMS) .12 1.1.6.1 Sơ lược bệnh gây chết sớm (EMS) 12 1.1.6.2 Vài nét vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 13 1.1.6.3 Biện pháp phịng chống bệnh EMS tơm 14 1.2 Đặc điểm hệ miễn dịch tôm 15 1.2.1 Hệ miễn dịch tôm 15 1.2.2 Các chất đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 17 1.2.2.1 Inositol 17 1.2.2.2 Beta-Glucan 18 1.2.2.3 Chitosan 20 1.2.2.4 Chitin 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu .26 2.2 Đối tượng nghiên cứu 26 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 26 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Ảnh hưởng Chitin lên tăng trưởng tỷ lệ sống tôm 27 2.4.1.1 Phương pháp ương nuôi tôm từ giai đoạn postlarvae 27 2.4.1.2 Bố trí thí nghiệm có bổ sung Chitin theo dõi tăng trưởng 28 2.4.1.3 Phương pháp xác định tỷ lệ sống 30 2.4.2 Ảnh hưởng Chitin đến đáp ứng miễn dịch tôm he 30 2.4.2.1 Ảnh hưởng Chitin đến công thức máu tôm he 30 2.4.2.2 Phương pháp xác định thành phần tế bào máu 33 2.4.3 Ảnh hưởng Chitin lên sức đề kháng tôm he chân trắng .34 2.4.3.1 Ảnh hưởng Chitin lên khả chịu stress NH3 tôm he 34 2.4.3.2 Ảnh hưởng Chitin lên khả đề kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy (EMS) tôm 36 2.4.4 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Ảnh hưởng Chitin lên tăng trưởng tỷ lệ sống tôm 40 3.1.1 Ảnh hưởng Chitin đến tăng trưởng 40 3.1.2 Ảnh hưởng Chitin đến tỷ lệ sống tôm he chân trắng 43 3.2 Kết nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tôm he chân trắng 44 3.2.1 Ảnh hưởng Chitin đến công thức máu 44 3.2.1.1 Ảnh hưởng Chitin đến tổng số tế bào máu (Total Haemocytes Count-THC) tôm he chân trắng 44 3.2.1.2 Ảnh hưởng Chitin đến thành phần tế bào máu tôm 46 3.2.2 Ảnh hưởng đến sức đề kháng tôm he chân trắng 50 3.2.2.1 Ảnh hưởng Chitin lên khả chịu stress NH3 .50 3.2.2.2 Ảnh hưởng Chitin lên khả đề kháng với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy tôm .52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .58 PHỤ LỤC 64 Phụ lục 1: 64 Phụ lục 2: 82 DANH MỤC VIẾT TẮT NTTS Nuôi Trồng Thủy Sản TNHH Trách Nhiệm Hữu Hạn TSB Trypstic Soyar Broth TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose L Lít WSSV White Spot Syndrome Virus EMS Early Mortality Syndrome ĐƯMD Đáp Ứng Miễn Dịch CDTB Chiều Dài Trung Bình KLTB Khối Lượng Trung Bình ĐVTS Động Vật Thủy Sản ĐC Đối Chứng LPS Lipopolysaccharide NT Nghiệm Thức NN & PTNT Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn PCR Polymerase Chain Reaction LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification TSA Trypstic Soyar Agar TLS Tỷ Lệ Sống MĐTB Mật Độ Tế Bào I FAO Food And Organization NA Nutrient Agar CFU Colony Forming Unit LD30, LD50 Lethal Dose 30%, 50% HAM Haemolymph Anticoagulant Media DNA Deoxyribonucleic Acid UV Ultraviolet Tb/ml Tế bào/millilit USD United States Dollar Cs cộng II DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Nồng độ vi khuẩn xác định số LD30 37 Bảng 3.1 Các tiêu môi trường bể nuôi tôm he chân trắng tuần nuôi 40 III Ảnh hưởng Chitin đến bạch cầu hạt nhỏ Descriptives Small 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum NT0% 3.4793 09600 05543 3.2409 3.7178 3.38 3.57 NT0.1% 3.6062 07830 04521 3.4117 3.8007 3.55 3.70 NT1% 4.0202 25179 14537 3.3947 4.6457 3.83 4.31 NT2% 4.1021 18460 10658 3.6435 4.5606 3.97 4.31 NT4% 3.4079 21730 12546 2.8681 3.9477 3.16 3.57 NT8% 3.2413 07601 04388 3.0525 3.4302 3.16 3.31 Total 18 3.6428 35354 08333 3.4670 3.8186 3.16 4.31 Test of Homogeneity of Variances PL1 Test of Homogeneity of Variances Small Levene df1 df2 Sig Statistic 2.625 12 079 Small Duncana Subset for alpha = 0.05 Treatment N NT8% 3.2413 NT4% 3.4079 3.4079 NT0% 3.4793 3.4793 NT0.1% NT1% 4.0202 NT2% 4.1021 Sig 3.6062 120 189 558 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 PL1 Ảnh hưởng Chitin đến phần trăm bạch cầu không hạt Descriptives per_Hya 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound NT0% 61.6833 45501 26270 60.5530 62.8136 61.23 62.14 NT0.1% 61.0000 28054 16197 60.3031 61.6969 60.73 61.29 NT1% 58.2333 86743 50081 56.0785 60.3881 57.25 58.89 NT2% 57.9333 74574 43056 56.0808 59.7859 57.08 58.46 NT4% 61.6833 83704 48326 59.6040 63.7627 60.94 62.59 NT8% 62.8900 54443 31432 61.5376 64.2424 62.39 63.47 Total 18 60.5706 1.97868 46638 59.5866 61.5545 57.08 63.47 PL1 per_Hya Test of Homogeneity of Variances Duncana per_Hya Levene Statistic 1.249 Subset for alpha = 0.05 df1 df2 Sig 12 346 Treatment N NT2% 57.9333 NT1% 58.2333 NT0.1% 61.0000 NT0% 61.6833 61.6833 NT4% 61.6833 61.6833 NT8% Sig 62.8900 586 249 053 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 PL1 Ảnh hưởng Chitin đến % bạch cầu hạt lớn Descriptives per_Large 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Upper Bound Bound Minimum Maximum NT0% 12.3867 43822 25300 11.2981 13.4753 12.09 12.89 NT0.1% 12.6467 53725 31018 11.3121 13.9813 12.14 13.21 NT1% 16.2600 88476 51082 14.0621 18.4579 15.24 16.82 NT2% 16.3233 41187 23779 15.3002 17.3465 15.98 16.78 NT4% 12.1833 38083 21987 11.2373 13.1294 11.92 12.62 NT8% 11.2833 26577 15344 10.6231 11.9435 11.03 11.56 Total 18 13.5139 2.11306 49805 12.4631 14.5647 11.03 16.82 PL1 Test of Homogeneity of Variances per_Large per_Large Duncana Levene Statistic 1.983 Subset for alpha = 0.05 df1 df2 Sig Treatment N 12 154 NT8% 11.2833 NT4% 12.1833 NT0% 12.3867 NT0.1% 12.6467 NT1% 16.2600 NT2% 16.3233 Sig .057 12.1833 323 885 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 PL1 Ảnh hưởng Chitin đến tỷ lệ % bạch cầu hạt nhỏ Descriptives per_small 95% Confidence Interval for N Mean Std Deviation Mean Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum NT0% 25.9300 27839 16073 25.2384 26.6216 25.68 26.23 NT0.1% 26.3533 45709 26390 25.2179 27.4888 26.06 26.88 NT1% 25.5067 1.73874 1.00386 21.1874 29.8259 24.39 27.51 NT2% 25.7433 97511 56298 23.3210 28.1656 24.76 26.71 NT4% 26.1333 1.21063 69896 23.1260 29.1407 24.79 27.14 NT8% 25.8267 48521 28014 24.6213 27.0320 25.27 26.16 Total 18 25.9156 88302 20813 25.4764 26.3547 24.39 27.51 PL1 per_small Test of Homogeneity of Variances Duncana per_small Levene Statistic 3.278 Subset for alpha = df1 df2 Sig 12 043 Treatment N 0.05 NT1% 25.5067 NT2% 25.7433 NT8% 25.8267 NT0% 25.9300 NT4% 26.1333 NT0.1% 26.3533 Sig .363 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 PL1 Bảng PL1.3 Ước lượng tương quan nồng độ vi khuẩn tỷ lệ chết tôm chân trắng Confidence Limits 95% Confidence Limits for concen Probability PROBIT 010 020 030 040 050 060 070 080 090 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 Estimate Lower Bound Upper Bound 438.153 599.160 730.764 848.493 958.112 1062.502 1163.349 1261.742 1358.434 1453.975 1926.513 2409.375 2919.009 3467.922 4068.310 4733.860 5481.242 6331.888 7314.547 8469.368 172.349 258.489 334.040 404.906 473.326 540.437 606.912 673.189 739.579 806.312 1150.369 1520.578 1925.448 2372.125 2867.818 3420.540 4039.819 4737.667 5530.122 6439.762 792.914 1027.009 1211.121 1371.740 1518.534 1656.284 1787.763 1914.750 2038.471 2159.818 2750.379 3344.349 3968.222 4642.681 5388.736 6230.998 7200.597 8338.776 9702.164 11371.337 PL1 95% Confidence Limits for log(concen)a Lower Upper Estimate Bound Bound 2.642 2.236 2.899 2.778 2.412 3.012 2.864 2.524 3.083 2.929 2.607 3.137 2.981 2.675 3.181 3.026 2.733 3.219 3.066 2.783 3.252 3.101 2.828 3.282 3.133 2.869 3.309 3.163 2.907 3.334 3.285 3.061 3.439 3.382 3.182 3.524 3.465 3.285 3.599 3.540 3.375 3.667 3.609 3.458 3.731 3.675 3.534 3.795 3.739 3.606 3.857 3.802 3.676 3.921 3.864 3.743 3.987 3.928 3.809 4.056 .650 9854.904 700 11561.046 750 13735.073 800 16640.334 850 20811.077 900 27574.615 910 29513.999 920 31775.764 930 34463.266 940 37734.344 950 41845.651 960 47251.755 970 54864.196 980 66915.050 990 91504.089 a Logarithm base = 10 7499.963 8762.487 10312.267 12299.859 15025.158 19212.754 20372.513 21705.846 23265.771 25132.314 27433.887 30394.467 34455.000 40670.159 52737.712 13465.924 16173.348 19808.508 24952.455 32831.074 46646.996 50815.913 55783.753 61827.364 69377.865 79151.880 92451.427 ######## ######## ######## PL1 3.994 4.063 4.138 4.221 4.318 4.441 4.470 4.502 4.537 4.577 4.622 4.674 4.739 4.826 4.961 3.875 3.943 4.013 4.090 4.177 4.284 4.309 4.337 4.367 4.400 4.438 4.483 4.537 4.609 4.722 4.129 4.209 4.297 4.397 4.516 4.669 4.706 4.747 4.791 4.841 4.898 4.966 5.049 5.160 5.336 Phụ lục 2: a) Hình ảnh theo dõi sinh trưởng tơm qua tuần Hình PL2.1 Tơm đưa vào thí nghiệm Hình PL2.2 Tơm tuần thứ thí nghiệm Hình PL2.3 Tơm tuần thứ thí nghiệm Hình PL2.4 Tơm tuần thứ thí nghiệm Hình PL2.5 Tơm tuần thứ thí nghiệm Hình PL2.6 Tơm tuần thứ thí nghiệm PL2 b) Các hình ảnh dụng cụ, thiết bị sử dụng thí nghiệm Hình PL2.7 Bộ kít Sera đo NO2 Hình PL2.8 Bộ kit đo lượng oxy hịa tan Hình PL2.9 Bộ kit Sera đo NH4/NH3 Hình PL2.10 Thiết bị đo độ mặn PL2 Hình PL2.11 Chuẩn bị pha Formalin 10% Hình PL2.12 Dụng cụ nhuộm tế bào Hình PL2.13 Kính hiển vi Hình PL2.14 Chuẩn bị mơi trường TCBS Hình PL2.15 Phối trộn thức ăn với Chitin Hình PL2.16 Cân đo khối lượng tơm PL2 Hình PL2.18 Bể ương tơm postlarvae Hình PL2.17 Chitin dạng bột Hình PL2.19 Dung dịch nhuộm Hemacolor Hình PL2.20 Thức ăn ấu trùng tơm Hình PL2.21 Thức ăn tơm trưởng thành PL2 PL3 ... tế bào máu 33 2.4.3 Ảnh hưởng Chitin lên sức đề kháng tôm he chân trắng .34 2.4.3.1 Ảnh hưởng Chitin lên khả chịu stress NH3 tôm he 34 2.4.3.2 Ảnh hưởng Chitin lên khả đề kháng với vi khuẩn... Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Nghiên cứu tác động Chitin lên tôm tiến hành theo sơ đồ (Hình 2.1) Nghiên cứu tác động Chitin lên sinh trưởng khả chịu stress tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei,... ? ?Nghiên cứu tác động Chitin lên sinh trưởng khả chịu stress tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei)? ?? cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng thân Các số liệu kết quả, hình ảnh nghiên cứu