Nghiên cứu nuôi cấy in vitro rễ cây mật nhân (eurycoma longifolia jack)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG MAI THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng – Năm 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG MAI THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO RỄ CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) Ngành: CỬ NHÂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn: TS Võ Châu Tuấn Đà Nẵng – Năm 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Đà Nẵng, ngày 28 tháng năm 2016 Sinh viên MAI THỊ HUYỀN LỜI CẢM ƠN Đề hoàn thành khóa luận tơi xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Sư phạm, khoa Sinh – Môi trường, môn công nghệ sinh học, quý thầy cô tận tình dạy dỗ, bảo cung cấp cho tơi nhiều kiến thức bổ ích Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn, thầy giáo trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho tơi từ nhận đề tài hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến gia đình, bạn bè thương u ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên thực MAI THỊ HUYỀN MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 10 Mục tiêu đề tài 11 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 11 3.1 Ý nghĩa khoa học 11 3.2 Ý nghĩa thực tiễn 11 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .12 1.1 NUÔI CẤY RỄ BẤT ĐỊNH VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG NUÔI CẤY RỄ IN VITRO Ở THỰC VẬT .12 1.1.1 Nuôi cấy rễ bất định 12 1.1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ bất định nuôi cấy in vitro 12 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO 15 1.2.1 Một số nghiên cứu giới 15 1.2.2 Một số nghiên cứu nước .16 1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÂY MẬT NHÂN 20 1.3.1 Phân bố 20 1.3.2 Đặc điểm hình thái 20 1.3.3 Thành phần hóa học 20 1.3.4 Tác dụng dược lí 21 1.3.5 Các nghiên cứu đối tượng .21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Tạo rễ in vitro mật nhân 24 2.2.2 Nuôi cấy rễ in vitro mật nhân môi trường lỏng .24 2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH SINH KHỐI TƯƠI VÀ SINH KHỐI KHÔ CỦA RỄ .24 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .25 3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐHST ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO RỄ IN VITRO CÂY MẬT NHÂN 25 3.1.1 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân 25 3.1.2 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo rễ in vitro mật nhân 27 3.1.3 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân 28 3.2 KHẢO SÁT ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA RỄ CÂY MẬT NHÂN IN VITRO .30 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐHST ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA RỄ IN VITRO CÂY MẬT NHÂN 31 3.3.1 Ảnh hưởng NAA IBA 31 3.3.2 Ảnh hưởng IBA KIN 34 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐƯỜNG SUCROSE ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA RỄ IN VITRO CÂY MẬT NHÂN 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : diclorophenoxyacetic acid BA : 6-benzyl adenine IBA : indole 3-butyric acid IAA : indole - acetic acid NAA : α-naphthalen acetic acid KIN : kinetin ĐHST : điều hòa sinh trưởng MS : Murashige Skoog (1962) SH : Schenk Hildebrandt (1972) cs : cộng NXB : nhà xuất L : lít DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân 16 3.2 Ảnh hưởng 2,4 D đến khả tạo rễ in vitro mật nhân 18 3.3 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân 19 3.4 3.5 3.6 Ảnh hưởng NAA IBA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân Ảnh hưởng IBA KIN đến khả tạo rễ in vitro mật nhân Ảnh hưởng đường sucrose đến khả tạo rễ in vitro mật nhân 23 25 26 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 2.1 Cây mật nhân in vitro 14 2.1 Rễ mật nhân in vitro 14 3.1 Rễ mật nhân hình thành sau tuần nuôi cấy môi trường MS + 0,5 NAA 17 Rễ mật nhân hình thành sau tuần nuôi cấy môi 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 trường MS + mg/l 2,4D Rễ mật nhân hình thành sau tuần nuôi cấy môi trường MS + 0,5 mg/l IBA Đường cong sinh trưởng rễ mật nhân nuôi cấy in vitro Nuôi cấy rễ mật nhân máy lắc Sinh khối tế bào rễ mật nhân môi trường bổ sung 0,75mg/l IBA 19 20 21 24 25 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong hàng ngàn năm thực vật xem nguồn dược liệu quan trọng Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính có khoảng 80 % dân số giới sử dụng nguồn dược liệu từ thực vật để điều trị chăm sóc sức khỏe [24] Tuy nhiên dân số ngày tăng, nguồn tài nguyên tái tạo ngày giảm khai thác mức, giảm đất canh tác, điều kiện tự nhiên ngày khắc nghiệt… làm suy giảm thiếu hụt nhanh chóng nguồn tài nguyên thực vật [30, 44] Bên cạnh đó, cơng tác bảo tồn loài dược liệu quý chưa trọng nên chúng phải đối mặt với nguy tuyệt chủng cao [10] Nhu cầu sử dụng sản phẩm tự nhiên y - dược ngày tăng sản lượng chúng trồng tự nhiên lại thấp phải khoảng thời gian lâu thu hoạch [30, 45] Do để sản xuất nguồn dược liệu lớn bền vững, khơng phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên cần có kỹ thuật ni cấy in vitro hỗ trợ nuôi cấy rễ, tế bào, mô, quan… Trong đó, ni cấy rễ bất định nghiên cứu ứng dụng rộng rãi mở nhiều triển vọng Năm 2004, Betsui Fumie cs nghiên cứu sản xuất hợp chất anthocyanyl thông qua nuôi cấy rễ bất định củ cải đường [2] Năm 2010, Xi – Hua Cui cs nghiên cứu sản xuất rễ bất định khảo sát điều kiện tối ưu cho tích lũy phenol, flavonoid rễ bất định Hypericum perforatum L [60] Năm 2008, Nguyễn Trung Thành cs nghiên cứu nhân nhanh rễ nhân sâm khảo sát ảnh hưởng số nhân tố lý hóa lên tích lũy sản phẩm trao đổi chất ginsenosides [56] Năm 2014, Bùi Định Thạch sản xuất saponon từ rễ bất định tam thất vũ diệp [55] Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) xem dược liệu quý Châu Á suy giảm nhanh chóng khai thác mức người [46, 47] Theo nhiều nghiên cứu có nhiều hợp chất hóa học tách chiết từ phận mật nhân, đặc biệt từ rễ chống bệnh tiểu đường, kháng viêm loét, ức chế phát triển khối u ký sinh trùng, kích thích thèm ăn, tăng cường sức khỏe [23, 46] Tuy nhiên, tác dụng bật mật nhân khả tăng cường sức khỏe tình dục cho nam giới, kích thích thể tăng tiết hormon giới a b Hình 3.6 : Sinh khối tế bào rễ mật nhân môi trường bổ sung 0,75mg/l IBA a Sinh khối tươi , b Sinh khối khô 3.3.2 Ảnh hưởng IBA KIN Bên cạnh sử dụng auxin đơn kết hợp chất điều hòa sinh trưởng auxin xytokinin khác tạo hiệu tăng trưởng rễ khác nồng độ thích hợp [6] Khi nồng độ auxin / nồng độ xytokinin lớn lớn, mơ có xu hướng tạo rễ [20] Bảng 3.5 Ảnh hưởng IBA KIN đến khả sinh trưởng rễ in vitro mật nhân Chất ĐHST (mg/l) IBA 0,75 KIN Khả sinh trưởng rễ bất định Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 0,25 1,24a 0,18a 0,5 1,16ab 0,13b 0,75 1,08ab 0,10bc 1,0 0,87b 0,09c Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p