Nghiên cứu sản xuất giống in vitro cây cà gai leo (solanum hainanense hance)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG  DƢƠNG THỊ HIỀN MY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT GIỐNG IN VITTRO CÂY CÀ GAI LEO (SOLANUM HAINANENSE HANCE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đà Nẵng – Năm 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƢỜNG  DƢƠNG THỊ HIỀN MY NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT GIỐNG IN VITTRO CÂY CÀ GAI LEO (SOLANUM HAINANENSE HANCE) Ngành: Sƣ phạm Sinh học Ngƣời hƣớng dẫn: TS Võ Châu Tuấn NIÊN KHÓA 2012 - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Dƣơng Thị Hiền My LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật, qua thân tơi trưởng thành nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn, người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình tơi thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Bùi Thị Thơ người giúp đỡ nhiều việc làm quen phát triển kĩ thực hành thí nghiệm giai đoạn đầu thực đề tài khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Đà Nẵng, tháng năm 2016 Sinh viên thực Dương Thị Hiền My MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài .2 Ý nghĩa Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sản xuất thuốc Việt Nam .4 1.2 Các nghiên cứu nhân giống thuốc kĩ thuật nuôi cấy in vitro 1.2.1 Các nghiên cứu giới .6 1.2.2 Các nghiên cứu Việt Nam 1.3 Giới thiệu Cà gai leo .10 1.3.1 Nguồn gốc phân bố 10 1.3.2 Đặc điểm hình thái .10 1.3.3 Giá trị dược liệu 11 1.3.4 Thành phần hoá học 11 1.3.5 Tình hình sản xuất Cà gai leo 11 1.3.6 Những nghiên cứu Cà gai leo 11 1.4 Sơ lƣợc số yếu tố ảnh hƣởng đến trình nhân giống in vitro 13 1.4.1 Môi trường nuôi cấy 13 1.4.2 Điều kiện nuôi cấy 17 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .19 2.2 Nội dung nghiên cứu đề tài .19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .19 2.3.1 Phương pháp khử trùng - Tạo nguyên liệu khởi đầu 20 2.3.2 Phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 20 2.3.3 Phương pháp tạo rễ in vitro .21 2.3.4 Phương pháp đưa đất 21 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 21 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 22 3.1 Đánh giá khả nhân nhanh chồi in vitro Cà gai leo 22 3.1.1 Ảnh hưởng tổ hợp BAP, IBA KIN đến khả nhân nhanh chồi in vitro 22 3.1.2 Ảnh hưởng nguồn mẫu vật đến khả nhân nhanh chồi in vitro .23 3.1.3 Ảnh hưởng pH đến khả nhân nhanh chồi in vitro 25 3.1.4 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả nhân nhanh chồi in vitro 26 3.2 Đánh giá khả tạo rễ in vitro 28 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường MS đến khả tạo rễ in vitro 28 3.2.2 Ảnh hưởng IBA NAA đến khả rễ in vitro 29 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tạo rễ in vitro 30 3.3 Ảnh hƣởng giá thể trồng đến khả sống sót sinh trƣởng Cà gai leo vƣờn ƣơm .32 3.4 Thiết lập quy trình sản xuất giống Cà gai leo in vitro 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 Kết luận 35 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : Diclorophenoxyacetic acid BA : - benzyl adenine BAP : - benzyl amino purine B5 : Gamborg (1968) cs : cộng ĐHST : Điều hòa sinh trưởng IBA : Indole - butyric acid I&Y : Ichihashi & Yamashita KC : Knudson C (1965) KIN : Kinetin LS : Linsmaier and Skoog(1965) MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-naphthalen acetic acid NN : Nitsch & Nitsch(1969) SH : Schenk Hildebrandt (1972) VW : Vacin Went (1949) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 Tên bảng Ảnh hưởng tổ hợp BAP, IBA KIN đến khả nhân nhanh chồi invi tro Ảnh hưởng nguồn gốc mẫu vật đến khả nhân nhanh chồi in vitro Ảnh hưởng pH đến khả nhân nhanh chồi in vitro Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả nhân nhanh chồi in vitro Trang 22 24 25 26 3.5 Ảnh hưởng môi trường MS đến khả tạo rễ in vitro 28 3.6 Ảnh hưởng IBA NAA đến khả rễ in vitro 29 3.7 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả rễ in vitro 31 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến khả sống sót sinh trưởng Cà gai leo sau tuần 32 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Tên hình 2.1 Cây Cà gai leo ngồi tự nhiên 3.1 Ảnh hưởng tổ hợp BAP, IBA KIN đến khả nhân nhanh chồi invi tro 3.2 Ảnh hưởng nguồn gốc mẫu vật đến khả nhân nhanh chồi in vitro 3.3 Ảnh hưởng pH đến khả nhân nhanh chồi in vitro 3.4 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả nhân nhanh chồi in vitro Trang 19 23 25 26 28 3.5 Ảnh hưởng môi trường MS đến khả tạo rễ in vitro 29 3.6 Ảnh hưởng IBA NAA đến khả rễ in vitro 30 3.7 Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả rễ in vitro 32 3.8 Ảnh hưởng giá thể đến khả sống sót sinh trưởng Cà gai leo sau tuần 3.9 Quy trình sản xuất giống Cà gai leo in vitro 33 34 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, với phát triển xã hội, dân số tăng nhanh, nhu cầu người nguồn dược liệu ngày tăng Thảo dược nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để chế biến sản xuất loại thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh phục hồi sức khỏe người Nguồn dược liệu người sử dụng tổng hợp nhiều đường khác tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật, song nguồn dược liệu khai thác từ thực vật người sử dụng từ lâu ngày có nhu cầu lớn [16] Với phát triển công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật áp dụng vào lĩnh vực : nhân giống in vitro, dung hợp tế bào trần, tạo sinh khối tế bào thực vật hệ lên men… việc nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật theo hướng tạo nguồn nguyên liệu ổn định cung cấp cho trình tách chiết hoạt chất sinh học đóng vai trị quan trọng việc sản xuất dược chất ngành dược phẩm [38] Trong Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) lồi dược liệu có giá trị kinh tế cao Cây dùng trị phong thấp, sâu răng, đau nhức đầu gân xương, cảm cúm, ho, ho gà, dị ứng Cây dùng trị rắn độc cắn, giải độc rượu, bia, chống say tàu xe [16] Hiện Cà gai leo nghiên cứu chứng minh có tác dụng điều trị viêm gan virus, xơ gan ung thư gan.… Từ năm 1980 đến nay, nhà khoa học Việt Nam có nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh lồi có tác dụng tốt với bệnh viêm gan, đặc biệt viêm gan virus B mãn tính thể hoạt động xơ gan Cà gai leo Viện dược liệu chứng minh có tác dụng chống viêm, bảo vệ gan, hạn chế hình thành xơ tổ chức thuốc “Haina” bào chế từ cà gai leo thử nghiệm lâm sàng (tại bệnh viện 103) Kết thử nghiệm lâm sàng sản phẩm chứa cà gai leo bệnh viện cho thấy bệnh nhân sau sử dụng sản phẩm cải thiện đáng kể triệu chứng chán ăn, mệt mỏi, vàng da, men gan trở bình thường nhanh sau tháng Đặc biệt sau tháng sử dụng, hầu hết bệnh nhân giảm nồng độ virus máu rõ rệt, chí ghi nhận trường hợp âm tính virus [10] 28 3.2 Đánh giá khả tạo rễ in vitro 3.2.1 Ảnh hưởng môi trường MS đến khả tạo rễ in vitro Chồi in vitro chiều dài 1,5 cm tách từ cụm chồi nhân nhanh cấy lên mơi trường MS có bổ sung 0,7 mg/L IBA nhằm kéo dài chồi [11] Sau sinh trưởng tuần có chiều dài cm ni cy trờn mụi trng ẳ MS, ẵ MS, MS tạo rễ Sau tuần nuôi cấy kết trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng môi trường MS đến khả tạo rễ in vitro Mơi trường Số rễ khống (rễ/chồi) ¼ MS Chiều dài rễ (cm) Tỉ lệ phát sinh rễ (%) 2,86a 1,79a 75,00 ½ MS 1,64b 1,44b 62,12 MS 0,62c 0,55c 58,30 Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p