Giám định bệnh sán lá gan nhỏ O. viverrini bằng chỉ thị di truyền gen nad3 của hệ gen ty thể.

Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -   - TIỂU LUẬN CUỐI KHĨA Mơn học: Cơng nghệ tế bào nâng cao Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến Lớp: K29.CSH.ĐN Ngành: Công nghệ sinh học Đà Nẵng, 3/2015 Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể MỞ ĐẦU Bệnh sán gan nhỏ bệnh truyền nhiễm lây qua đường ăn uống, loài Clonorchis sp lồi Opisthorchis sp gây nên Trong đó, bệnh sán gan nhỏ opisthorchiasis Opisthorchis viverrini gây nên bệnh quan trọng sức khỏe cộng đồng nước Đông Nam Á bao gồm Thái Lan, Lào, Campuchia Việt Nam (IARC, 1994) Những mẫu ký sinh trùng lần Lieper mô tả (1911) Kerr cung cấp, lấy từ tử thi tù nhân nhà tù Chiengmai (phía Bắc Thái Lan) vào năm 1911 Sau này, năm 1955 Sadun nghiên cứu hình thái dịch tễ học loài sán gan Đông Bắc Thái Lan (Sadun cs., 1955) kết luận trường hợp bị nhiễm sán Thái Lan O viverrini gây nên Wykoff cộng xác nhận lại năm 1965 (Wykoff cs., 1965) Ở Việt Nam, sán gan nhỏ O viverrini tìm thấy số tỉnh phía Nam giám định phân tử thị di truyền hệ gen ty thể (Nguyễn văn Chương, 2000; Lê Thanh Hịa cs., 2003; Ngơ Thị Hương cs., 2006) Hơn thập kỷ qua, phương pháp chẩn đốn giám định lồi sinh vật dựa đặc điểm ADN phát triển sử dụng rộng rãi Lợi phương pháp sinh học phân tử cho kết có độ tin cậy cao, cần mẫu vật khơng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển cá thể sinh vật nên phù hợp cho việc chẩn đoán phân loại bệnh ký sinh trùng Với kích thước nhỏ lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống tế bào nên ADN hệ gen ty thể coi đối tượng lý tưởng để khảo sát biến đổi hệ gen phục vụ nghiên cứu giám định, phân loại lập phả hệ quần thể Các gen ty thể chủng, lồi chí lồi có quan hệ gần sinh học có bảo tồn cao, thay đổi nhỏ dấu hiệu giá trị giám định phân loại (Lê Thanh Hoà, 2002) Một gen quan trọng nad3-gen mã hoá cho enzyme nicotinamide dehydrogenase, có độ bảo tồn cao khai thác phục vụ nghiên cứu, giám định, phân loại lập di truyền quần thể (Fernadez cs., 1998) Do tầm quan trọng dịch tễ học phòng bệnh sán gan nhỏ O viverrini Việt Nam, ý nghĩa giám định bệnh thị di truyền hệ gen, em lựa chọn đề tài tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ O viverrini thị di truyền gen nad3 hệ gen ty thể Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể Chương 1: TỔNG QUAN VỀ SÁN LÁ GAN VÀ HỆ GEN TY THỂ 1.1 Tình hình bệnh sán gan nhỏ Việt Nam giới 1.1.1 Tình hình bệnh sán gan nhỏ giới Hình 1.1: Sự phân bố địa lý loài sán gan nhỏ châu Á Bệnh sán gan nhỏ gặp nhiều nước Đông Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia (WHO, 1995) tăng lên nước phát triển di cư người Châu Á (Woolf, A., cs., 1984) Bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini gây nên bệnh phân bố theo địa phương nước Campuchia, Lào, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam, Trung Quốc Năm 1929, Bedier Chesneau phát thấy O viverrini bị nhiễm người Lào Vientian (15%) Takhet (23%) (Bedier, E., Chesneau, P., 1929) Năm 1997, Lào có tới 1,7 triệu người nhiễm, có nơi tỷ lệ nhiễm tới 54,4-100% (Sithithawom cs., 1997) Thái Lan coi trung tâm dịch tễ O viverrini, có khoảng triệu người bị nhiễm sán gan (Jongsukusntigul Imsomboon, 1997) 1.1.2 Tình hình bệnh sán gan nhỏ Việt Nam Hình 1.2: Sự phân bố địa lý loài sán gan nhỏ Việt Nam Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể Cũng giới, bệnh sán gan nhỏ Việt Nam liên quan đến tập quán sinh hoạt, đặc biệt nơi có tập tục ăn gỏi cá Bệnh sán gan nhỏ xác định phân bố 18 tỉnh, thành phố: Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam, Thái Bình, Hải Phịng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Hịa Bình, Hà Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa thiên Huế, Quảng Nam, Bình Định, Phú Yên, Đắc Lắc, Gia Lai, có nơi tỷ lệ nhiễm tới 37% Nam Định, Phú Yên Riêng nhiễm O viverrini tìm thấy chủ yếu số tỉnh phía Nam Hiện xác định tỉnh lưu hành O viverrini Phú Yên (tỷ lệ nhiễm 36,9%), Bình Định (tỷ lệ nhiễm 11,9%), Đắc Lắc (tỷ lệ nhiễm 7,6%), Đà Nẵng (tỷ lệ nhiễm 0,3%), Quảng Nam (tỷ lệ nhiễm 4,6%), Khánh Hoà (tỷ lệ nhiễm 1,4%), Thừa Thiên Huế (phát ca bệnh) (Nguyễn Văn Chương, Nguyễn Văn Đề, 1996, 1997, 2003) Bằng hình thái học Opisthorchis viverrini Nguyễn Văn Chương, Nguyễn Văn Đề cộng năm 1997 xác định Phú Yên công bố năm 2000 giám định thị di truyền hệ gen ty thể (Lê Thanh Hoà cs., 2003; Nguyễn Văn Đề cs., 2004; Ngô Thị Hương cs., 2006) 1.2 Giới thiệu sơ lược hệ gen ty thể 1.2.1 Một số khái niệm Gen đơn vị di truyền chứa đoạn ADN giới hạn mã khởi đầu mã kết thúc Gen cho sản phẩm khơng cho sản phẩm Hệ gen tập hợp chuỗi nucleotit phân bố phân đoạn dài ngắn khác gọi nhiễm sắc thể (NST) (đối với hệ gen cá thể bậc cao) vòng acid deoxyribonucleic (ADN) khép kín (đối với hệ gen cá thể bậc thấp) Plasmid yếu tố di truyền nằm NST, chép cách độc lập bên tế bào sinh vật ADN chúng ADN mạch vòng, sợi kép, có mang gen cần thiết cho việc chép plasmid cần thiết cho chức khác plasmid Các plasmid dùng nhiều thí nghiệm ADN tái tổ hợp, có mang gen bền vững với kháng sinh Nhờ chọn lọc phân tử ADN tái tổ hợp cách dễ dàng Chúng lại có trọng lượng nhỏ nhiều so với ADN vật chủ nên dễ dàng tinh 1.2.2 Ty thể hệ gen ty thể Ty thể (mitochondrial) loại tế bào quan (organelle) đặc biệt tế bào, nằm tế bào chất tế bào có nhân thật (Eucaryota) Chức ty thể sử dụng loại enzyme chuyển hoá chúng sản xuất, thực q trình oxy hố-khử để sản xuất lượng dạng ATP cung cấp cho hoạt động tế bào Chính thế, ty thể xem nhà máy lượng tế bào ADN ty thể vịng ADN khép kín, có kích thước khoảng 13-40 kb tuỳ lồi, có đặc điểm đặc trưng tồn dạng đơn bội, không xảy trình tái tổ hợp di truyền theo dịng mẹ Hơn nữa, hệ gen ty thể khơng lớn lắm, lại khơng có cấu trúc q phức tạp có tỷ lệ biến đổi nucleotide cao hệ gen nhân từ 10-15 lần Với đặc điểm trên, hệ gen ty thể đối tượng lý tưởng thuận lợi việc chẩn đoán phân loại nhiều loài ký sinh trùng, xác định mối quan hệ họ hàng quan hệ tiến hoá sinh vật Do đó, việc nghiên cứu đặc điểm sinh vật sở hệ gen ty thể ngày trở nên phổ biến giới (Lê Thanh Hoà cs., 2007) Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể Hệ gen nhân Hệ gen ty thể Hình 1.3: Hệ gen nhân hệ gen ty thể tế bào Trong tế bào động vật tồn song song hai hệ gen: hệ gen nhân hệ gen ty thể Hai hệ gen có sản phẩm riêng hoạt động có tính chất vừa độc lập vừa tương tác Dĩ nhiên hệ gen ty thể chịu ảnh hưởng điều hòa hệ gen nhân Hệ gen nhân có tế bào động vật, nhiễm sắc thể dạng thẳng, ADN sợi kép, kích thước lớn (vài trăm đến vài nghìn megabase) Hệ gen ty thể gồm nhiều tế bào, nằm tế bào chất ADN sợi kép, dạng vịng, kích thước 13-25 kb (ở động vật), 40 kb (ở thực vật) Màng Màng Nếp gấp Khoang 0,5-1mm Hình 1.4: Cấu trúc ty thể Ty thể hệ gen ty thể phận quan trọng tế bào, có hình gậy hình hạt Dưới kính hiển vi điện tử, người ta thấy ty thể phận có tổ chức cao Ty thể có hai màng phân biệt rõ rệt: màng nhẵn, bao quanh ty thể, màng có đoạn có nếp gấp chạy vào trung tâm làm thành mào (cristae) Khoang trung tâm gọi chất Kích thước thay đổi tùy loại tế bào Trong tế bào có 200-300 ty thể hoạt động (Lê Thanh Hồ, 2002) Hình 1.5: Cấu trúc hệ gen ty thể động vật Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể Hệ gen ty thể động vật bao gồm vịng ADN khép kín chứa khoảng 13-25 nghìn nucleotit gồm 12-13 gen cho sản phẩm Protein, gen ARN Ribosome (rARN), 22 gen ARN vận chuyển (tARN) số tiểu phần khác Các chuỗi giao gen thường ngắn (tuy nhiên có vùng khơng mã hóa dài), với ba khởi đầu cho việc chép số lồi có liên quan đến tính ổn định cấu trúc bậc Cho đến có 130 hệ gen ty thể động vật từ đơn bào đến đa bào phân tích đầy đủ gần đầy đủ Điều thuận lợi to lớn cho việc sử dụng hệ gen ty thể nghiên cứu (Lê Thanh Hoà, 2002) Trật tự gen ty thể thường ổn định qua thời gian dài Sự khác biệt thành viên họ thường Trong khác biệt rõ ràng xảy loài cao hơn, đặc biệt lớp phả hệ Điều thuận lợi cho việc nghiên cứu chẩn đốn, giám định lồi sinh học phân tử với thị di truyền hệ gen ty thể Do kích thước gen nhỏ lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống tế bào, ADN hệ gen ty thể gọi đối tượng lý tưởng để khảo sát biến đổi hệ gen phục vụ nghiên cứu chẩn đoán, phân loại sinh vật Các gen ty thể lại có biến đổi nhanh hệ gen nhân tế bào 10-15 lần nên thuận lợi cho việc nghiên cứu Các gen ty thể chủng, loài chí lồi có quan hệ gần sinh học có bảo tồn cao, thay đổi nhỏ dấu hiệu giá trị giám định phân loại Nghiên cứu hệ gen ty thể cịn có tầm quan trọng chẩn đốn, điều trị phịng chống bệnh, có nhiều bệnh người động vật có liên quan tới biến đổi ty thể Đối với ký sinh trùng, hiểu biết đầy đủ hệ gen ty thể cịn có giá trị định hướng phịng chống Đặc biệt tìm kiếm hóa chất, hóa dược điều trị bệnh ký sinh trùng thực nghiệm loài vacxin hệ 1.2.3 Gen nad3 (nicotinamide dehydrogenase) Loài sán gan nhỏ O viverrini Phú Yên (OvPY4) giám định đoạn gen có chiều dài khoảng 1,3kb, đoạn gen bao gồm toàn gen nad3 mà chúng tơi dùng để phân tích, so sánh H V A D Q FM cob nad4 atp6 nad2 N P I K nad1 S1 W T cox1 nad3 nad4L OvF ~1,3kb O viverrini OvR Hình 1.6: Sơ đồ minh họa vị trí cặp mồi bám Chức gen nad3 tổng hợp NADH cung cấp điện tử cho chu trình hoạt động tế bào Đặc điểm gen nad3 có hệ số bảo tồn cao hệ gen ty thể, đột biến, đột biến 3-4/357 nucleotide (Ngô Thị Hương cs., 2006) Từ đặc điểm cho thấy gen nad3 dùng để làm số liệu so sánh việc giám định, chẩn đốn lồi sán gan nhỏ O viverrini Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể 1.3 Tầm quan trọng việc nghiên cứu bệnh sán gan nhỏ phương pháp sinh học phân tử 1.3.1 Giới thiệu chung Sinh học phân tử lĩnh vực quan trọng để khám phá hệ gen bên trong, nghiên cứu cấu trúc, mối tương quan biểu kiểu gen (genotype) đối tượng Như vậy, nói đến sinh học phân tử nghĩa nói đến cấu trúc gen di truyền kỹ thuật nhằm phục vụ cho trình nghiên cứu thực nghiệm lĩnh vực Phương pháp sinh học phân tử ứng dụng ngày rộng rãi có hiệu lĩnh vực sinh học Đó việc sử dụng kỹ thuật ADN (trước hết kỹ thuật PCR) kỹ thuật protein để xác định chuỗi gen hay chuỗi amino acid gen, lập đồ gen khu vực định hệ gen loài cần chẩn đốn để so sánh đối chiếu với lồi khác, nhằm xác định xác lồi mong muốn Có nhiều phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử, trước hết phải kể đến phương pháp di truyền học tế bào, phương pháp hợp lai ADN-ADN, phương pháp hợp lai ADN phóng xạ, phương pháp phân tích biến thái phân đoạn ADN kỹ thuật enzyme giới hạn (RFLP), nhiều phương pháp sử dụng phản ứng PCR (polymerase chain reaction) phối hợp PCR với phương pháp ADN Tính xác so sánh cấu trúc trật tự nucleotit hệ gen cá thể khác cho phép có phân biệt xác đặc tính di truyền học cá thể, kể sản phẩm gen chúng bị ảnh hưởng tương tác môi trường đồng loại Ngày nay, khảo sát phân tích cấu trúc ADN cá thể để so sánh coi phương pháp tối ưu nghiên cứu sinh vật nói chung ký sinh trùng nói riêng, đặt hướng mới: hướng giám định, phân loại nghiên cứu tiến hoá phương pháp sinh học phân tử, phương pháp ADN Phương pháp ADN có độ nhạy tính xác cao, đặc biệt chẩn đốn phát biến chủng, chí cá thể đồng chủng, vùng ADN nghiên cứu không cho sản phẩm gen (non-coding region), hay số gen trạng thái im lặng (silent genes) Phương pháp ADN cịn bao qt phương pháp Protein, cấu trúc gen chuỗi nucleotide xác định cấu trúc protein dễ dàng xác định để đánh giá so sánh Sự phát triển kỹ thuật máy tính điện tử (computational technology), kết hợp với kỹ thuật ADN (DNA technology) hình thành nên lĩnh vực khoa học nghiên cứu ứng dụng gọi Sinh-tin học (Bioinformatics) cho phép ứng dụng phương pháp cách hiệu rộng rãi Tuy nhiên phương pháp sinh học đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, tốn cần nhân viên kỹ thuật có trình độ cao Như vậy, việc chẩn đoán, giám định phân loại nhiều loại sinh vật, kể ký sinh trùng dựa vào phương pháp truyền thống chính, trước hết phương pháp hình thái học chiếm vị trí quan trọng Các phương pháp sinh học phân tử bước đầu ứng dụng chẩn đoán phân loại lập phả hệ sinh vật Các số liệu xác phương pháp sinh học phân tử cho phép ứng dụng hướng làm thay đổi phần hệ thống phân loại có Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể 1.3.2 Tầm quan trọng việc nghiên cứu bệnh sán gan nhỏ phương pháp sinh học phân tử Hiện nay, Việt Nam giới việc phòng chống bệnh ký sinh trùng gây có vai trị quan trọng cho việc chăm sóc sức khỏe người dân Tổ chức y tế giới (WHO, 1995) đưa chương trình y tế lớn nhằm chống lại bệnh lý ký sinh trùng gây ra: chương trình phịng chống sốt rét, chương trình phịng chống bệnh giun, sán Các chương trình tốn hiệu chưa mong muốn Trong có vấn đề kháng thuốc ký sinh trùng, xác định phân bố, vùng dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh… cịn gặp nhiều khó khăn Việt Nam nước nằm vùng nhiệt đới, thuận lợi cho ký sinh trùng phát triển Hơn điều kiện kinh tế, y tế cịn có nhiều khó khăn, cộng với tập quán sinh hoạt lạc hậu vùng nông thôn, vùng xa, điều kiện vệ sinh chưa đảm bảo, tỷ lệ mắc bệnh ký sinh trùng Việt Nam cao có bệnh sán gan Mặt khác, nằm vùng dịch tễ, bao bọc xung quanh nước có tỷ lệ nhiễm bệnh sán gan nhỏ cao: Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Philippine nên việc phòng chống bệnh sán gan nhỏ quan trọng cấp thiết Chúng ta biết hậu sán gan gây cho người bị nhiễm trầm trọng: xơ gan, ung thư gan, ung thư đường mật Đây vấn đề gây nên tổn thất lớn sức khỏe kinh tế cho gia đình xã hội Việc sử dụng phương pháp sinh học phân tử mà cụ thể ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán phân loại bệnh sán gan nhỏ nói riêng bệnh ký sinh trùng nói chung có ý nghĩa to lớn Nhờ phương pháp mà người ta chẩn đốn từ sớm, xác tác nhân gây bệnh Ngay bệnh nhân chưa có triệu chứng (người lành mang trùng) Điều giúp cho nhà điều trị học lựa chọn phương pháp điều trị hiệu tốn nhất, góp phần ngăn chặn hậu xấu bệnh gây Việc xác định cấu trúc gen hay nhiều gen đặc trưng sán gan nhỏ giúp cho nhà sinh học xác định sản phẩm cụ thể gen Đây sở cho việc sản xuất kháng nguyên đặc hiệu, sử dụng cho phương pháp chẩn đoán miễn dịch học Phương pháp sinh học phân tử giúp cho nhà dịch tễ học xác định cách xác tỷ lệ mắc bệnh, loại ký sinh trùng gây bệnh, vùng phân bố ký sinh trùng từ đề chương trình phịng chống phù hợp hiệu Trong chẩn đoán bệnh sán gan, phương pháp PCR sở, tảng cho việc tiếp cận với phương pháp kỹ thuật chẩn đoán Từ đây, mở rộng việc ứng dụng việc chẩn đốn bệnh lý khác bệnh vi khuẩn, virus: lao, viêm gan, HIV chí việc chẩn đoán sớm bệnh ung thư Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể Chương 2: NGUYÊN, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu phương pháp thu nhận mẫu Nguyên liệu nghiên cứu mẫu sán gan nhỏ trưởng thành có kích thước 1,2 x 0,1 cm, màu vàng nhạt, thu nhận người, xác định O viverrini mặt hình thái học Cách thu nhận mẫu tiến hành sau: chọn bệnh nhân có tiền sử có ăn gỏi cá diếc sống, sau cho xét nghiệm phân Những bệnh nhân xét nghiệm có trứng sán gan nhỏ điều trị liều Distocid (6 viên), sau đãi phân bệnh nhân để tìm sán trưởng thành Mẫu sán định loại dựa vào đặc điểm hình thái học, rửa nước muối sinh lý nhiều lần, trước chuyển vào cồn 70% bảo quản -850C 2.2 Vật liệu 2.2.1 Thiết bị dụng cụ  Máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D)  Máy PCR (máy PTC-100) MJ Research Inc  Máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), có kèm theo máy vi tính  Máy tính phần mềm tin-sinh học  Thiết bị dùng để điện di kiểm tra sản phẩm PCR hãng Bio-Rad  Máy ổn nhiệt, máy lắc tế bào  Laminair cấy vô trùng  Bộ pipetman (10l, 20l, 200l, 1000l) đầu côn loại, ống Eppendorf loại, đĩa Petri, lọ đựng môi trường, ống ni vi khuẩn  Máy Vortex 2.2.2 Hố chất  Bộ kit tách chiết ADN tổng số, “QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA)” hoá chất hãng Qiagen cung cấp  Bộ kit dùng cho phản ứng PCR hãng Invitrogen cung cấp  Dung dịch đệm điện di TAE 1X bột agarose  Bộ kit tách dòng “TA-cloning Kit” hãng Invitrogen cunng cấp  Môi trường LB lỏng môi trường LB agar 1,5%  Môi trường dinh dưỡng SOC cung cấp với “TA-cloning Kit”  Kháng sinh kanamycin (50 mg/ml), X-gal, cồn tuyệt đối  Bộ kit tách plasmid tái tổ hợp, “QIAprep Spin Miniprep Kit” hãng Qiagen cung cấp  Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình trình tự  Bộ kit dùng để tinh sản phẩm PCR giải trình trình tự Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể 2.2.3 Dung dịch sử dụng biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.coli môi trường nuôi cấy chọn lọc tế bào biến nạp  Dung dịch: dung dịch giàu dinh dưỡng SOC: - trypton: 20g/l; dịch chiết nấm men: 5g/l; NaCl: 10mM; KCl: 2,5mM; MgCl2: 10mM; MgSO4: 10mM; glucozơ: 20mM  Môi trường: Môi trường LB (Luria-Bertani): 1% Trypton; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl Môi trường chọn lọc: môi trường LB đặc: thành phần môi trường LB bổ sung thêm agar 1,5%, Kanamycin (tỉ lệ 1:1 so với thể tích mơi trường LB), X-gal (tỉ lệ 2:1 so với thể tích mơi trường LB) Mơi trường ni cấy: tương tự môi trường chọn lọc không bổ sung agar 2.2.4 Các dung dịch dùng điện di ADN gel agarose  Dung dịch đệm TAE đặc 50X (100ml): Tris-kiềm: 24,2%; Axit axetic: 5,71ml; EDTA 0,5M (pH8,0): 10ml  Đệm tra mẫu (6X) (loading dye): Bromophenol blue: 0,25%; Xylen cyanol FF: 0,25%; Glycerol: 30%  Dung dịch nhuộm gel: ethidium bromide (EtBt): 0,5 mg/ml 2.3 Phương pháp nghiên cứu (có phụ lục chi tiết)  Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu vật  Phương pháp điện di gel agarose  Phương pháp khuyếch đại invitro ADN phản ứng trùng hợp polymerase (PCR)  Phương pháp tinh sản phẩm PCR  Phản ứng nối ADN ngoại lai vào plasmid  Phương pháp sốc nhiệt biến nạp vectơ vào tế bào nuôi cấy chúng môi trường thạch  Phương pháp chọn lọc khuẩn lạc nuôi cấy môi trường lỏng  Phương pháp tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp  Phương pháp xử lý ADN plasmid enzyme cắt hạn chế  Phương pháp giải trình trình tự Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể PHỤ LỤC Quy trình giám định bệnh sán gan Cơng nghệ ADN tái tổ hợp Thu, bảo quản mẫu vật Xử lý chuẩn bị mẫu vật Tách chiết ADN/ARN tổng số Kiểm tra ADN/ARN tổng số Qui trình PCR/RT PCR Kiểm tra sản phẩm PCR/RT PCR Tinh sản phẩm PCR/RT PCR Nối sản phẩm PCR/RT PCR vào plasmid vectơ Chuyển nạp nuôi cấy môi trường thạch Chọn lọc khuẩn lạc nuôi cấy môi trường lỏng Tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp Kiểm tra ADN plasmid tái tổ hợp Qui trình PCR giải trình trình tự Tinh sản phẩm PCR giải trình trình tự Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học 20 Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể Giải trình trình tự Các bước thực 2.1 Xử lý chuẩn bị mẫu vật Mẫu sán sau thu nhận, bảo quản, trước đem tách chiết ADN tổng số rửa cồn nhiều lần nước cất vô trùng cắt nhỏ mẫu để dễ nghiền Nghiền nhỏ mẫu chày inox khử trùng cách rửa sạch, nhúng cồn 70% đốt lửa đèn cồn nhiều lần 2.3 Tách chiết ADN tổng số ADN tổng số mẫu vật riêng biệt tách chiết QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA) Nguyên lý tách chiết ADN tổng số Mẫu vật đem tách phải nghiền nhỏ để dễ tách chiết Để tách chiết hệ gen nhân hệ gen ty thể cần phải phá vỡ mơ Huyễn dịch thu gồm thành phần protein có ARN nên cần phải tách bỏ chúng Loại bỏ protein cách bổ sung Enzyme proteinase K có tác dụng phân huỷ Protein, bổ sung RNase có tác dụng phá huỷ ARN Sau cần phải phá vỡ màng tế bào thu hệ gen nhân hệ gen ty thể, phá vỡ màng tế bào ngồi ADN cịn có thành phần khác nguyên sinh chất nên cần phải tách riêng ADN, loại bỏ thành phần khác cách kết tủa ADN ethanol rửa giải thu ADN cho lọc màng lọc tích điện dương Cách tiến hành - Mẫu vật sau xử lý nghiền tiếp 180µl dung dịch ATL (ATL buffer) chày inox thành dung dịch đồng - Bổ sung 20µl Proteinase-K (50mg/ml) - Bổ sung 4µl RNase-A (100mg/ml) ủ 550C - Thêm 200µl AL, lắc mạnh ủ 700C 30 phút - Thêm 200µl Ethanol (96-100%), vontex 15-20 giây - Toàn hỗn dịch chuyển lên màng lọc cột lọc (QIAamp Spin Column), ly tâm 13000 vòng/phút phút, loại bỏ phần dung dịch bên - Thêm 500µl dung dịch AW1 vào cột lọc để rửa ADN bám vào màng, ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch - Thêm 500µl dung dịch AW2 vào cột lọc để rửa tiếp ADN bám vào màng, ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học 21 Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể - Chuyển sang ống eppendorf mới, ADN tổng số thơi 100 µl dung dịch AE, ly tâm 13000 vòng/phút phút Thu ADN tổng số Kí hiệu mẫu OV1 genomic bảo quản -20oC sử dụng 2.4 Kiểm tra ADN tổng số Cơ sở lý thuyết ADN tổng số kiểm tra điện di gel agarose 0,8-1% Điện di thực cách đưa mẫu axit nucleic vào gel đặt điện áp vào Trạng thái trì chất nhuộm đánh dấu (thường xanh bromphenol) bổ sung vào mẫu trước đưa vào gel chạy tới đầu cuối gel Các axit nucleic gel thường hiển thị nhuộm ethidium bromide quan sát ánh sáng tia tử ngoại Các axit nucleic lên dạng băng màu trắng chụp ảnh ghi nhận lại Kích thước băng ADN so sánh với thị di truyền (DNA marker) cho vào lúc với sản phẩm PCR lỗ riêng biệt, cạnh lỗ dùng phát sản phẩm PCR ADN marker hay dùng ADN thực khuẩn thể Lamda, có chiều dài 43 kb, cắt enzyme giới hạn HindIII ADN thực khuẩn thể Lamda HindIII cắt thành phân đoạn có độ dài sau: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb 0,125kb Trên thực tế hiển thị thạch agarose, nhìn băng, cịn băng có chiều dài 0,125kb khó phát Nhờ thị di truyền người ta xác định độ dài đoạn PCR sản phẩm Cách tiến hành Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học 22 Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể - Chuẩn bị gel agarose 1%: lấy 0,4 g thạch agarose nguyên chất cho vào cối đong thuỷ tinh chịu nhiệt, đổ vào 40 ml đệm TAE 1lần (1×TAE) Cho vào lị vi sóng đặt nóng chảy phút cho agarose tan chảy hết Bổ sung µl ethidium bromide vào Đổ thạch tan chảy vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều vào đổ ngập lược khoảng 0,5 cm để nguội nhiệt độ phòng Khi nguội, lược tạo thành giếng mẫu vật vào kiểm tra - Dìm ngập khay có thạch hộp điện di chứa đệm TAE lần (đệm cung cấp ion cho điện trường hoạt động) - Tra mẫu: lấy 5µl sản phẩm, trộn thị màu (Thường xanh Bromophenol glycerol) với mẫu tra riêng biệt vào giếng thạch - Tra thị phân tử: giếng riêng biệt khác cho 10 µl (0,5µg) thị phân tử (DNA marker) (ADN thực khuẩn thể Lamda cắt enzyme giới hạn HindIII) - Chạy điện di 100-120V 25-30 phút - Rửa gel nước cất, sau soi qua tia cực tím chụp ảnh 2.5 Qui trình PCR DEDENATURATION ON 93°C - DENATURATI 95°C 93°C - 95°C ANNEALI NG 37°C - 65°C 25-35 CYCLES 25-40 cycles DENATURATI ON 93°C - 95°C EXTENSI ON 72°C Cơ sở lý thuyết PCR phản ứng sinh hóa phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm trình chép ADN với tham gia loại enzyme ADN-polymerase chịu nhiệt, có đoạn ngắn ADN sợi làm mồi dùng đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi bổ sung với Vì để khởi đầu trình tổng hợp ADN cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ dài 6-30 nucleotit) Đoạn gắn kết với ADN làm khuôn điểm khởi đầu chép enzyme ADN-polymerase điều khiển để tổng hợp nên sợi ADN đặc Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học 23 Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể thù Các sợi ADN mạch đơn tạo theo cách đơn giản nâng nhiệt lên 900C (92-980C) mà thường chuỗi xoắn kép ADN bung Phản ứng PCR thực máy MJ Thermal cycler PCT-100 (MJ Research, USA) Thành phần chủ yếu phản ứng PCR, gồm: - ADN làm khuôn - Hai đoạn mồi để xác định điểm bắt đầu tổng hợp ADN - Enzyme chịu nhiệt ADN-polymerase (hiện dùng phổ biến Taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus) - Hỗn hợp tất tiền chất deoxynucleotit (ở dạng dNTP) - Môi trường đệm cung cấp ion Magiê (Mg2+) nước tinh khiết (khơng có ADNaza, ARNaza ) (Dung tích tổng số cho phản ứng PCR thơng thường 50l 20l) Có giai đoạn (3 bước điều chỉnh nhiệt độ) cho chu kỳ: - Bung liên kết ADN: thực nhiệt độ 90-980C vài giây đến vài phút Tại nhiệt độ này, phân tử ADN mạch kép bị tách tạo nên sợi đơn dùng để làm khuôn cho đoạn mồi bám vào enzyme taq polymerase xúc tác tổng hợp - Mồi bám (hay gọi ủ với mồi): Sau bước 1, nhiệt độ hạ xuống 37-680C để đoạn mồi bám vào với trình tự bổ sung tương ứng phân tử ADN làm khuôn - Tổng hợp (hay gọi kéo dài): Nhiệt độ nâng lên 68-720C (thông thường 720C) vài chục giây đến vài chục phút để sợi ADN vừa tổng hợp xoắn vào tạo nên ADN sợi kép, sản phẩm PCR Cứ vậy, phản ứng xảy 25-35-40 chu kỳ tiếp tục chu kỳ cuối Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ trì 720C 5-10 phút cho tất sợi đơn ADN có phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR Cuối nhiệt độ hạ xuống 40C để bảo quản sản phẩm Cách tiến hành phản ứng PCR Học viên: Trần Huỳnh Hải Yến – Lớp: K29.CSH.DN ngành Công nghệ sinh học 24 ... nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể Chương 1: TỔNG QUAN VỀ SÁN LÁ GAN VÀ HỆ GEN TY THỂ 1.1 Tình hình bệnh sán gan nhỏ. .. ngành Công nghệ sinh học Tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ Opisthorchis viverrini thị di truyền gen nad3 hệ hen ty thể Hệ gen nhân Hệ gen ty thể Hình 1.3: Hệ gen nhân hệ gen ty thể tế b? ?o.. . viverrini Việt Nam, ý nghĩa giám định bệnh thị di truyền hệ gen, em lựa chọn đề tài tiểu luận: Giám định bệnh sán gan nhỏ O viverrini thị di truyền gen nad3 hệ gen ty thể Học viên: Trần Huỳnh