Phát hiện đột biến dna ty thể ở bệnh nhân hội chứng melas bằng kỹ thuật giải trình t

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT TOÀN VĂN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DNA TY THỂ BỆNH NH N HỘI CH NG ME AS B NG K THU T GIẢI TR NH T Mã số: Chủ nhiệm đề tài: CN DƯ NG BÍCH TR M ThS THÁI KHƯ NG Tp Hồ Ch Minh th n 5n m DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHI N C U ĐỀ TÀI T STT g g i hT Th i h g hV g i g hủ hi i T g Y Si h h h hủ hi i T g Y Si h h h T g Y Si h h h h MỤC ỤC TV h g 1: T QU T U 1.1 T g h i h g S 1.1.1 Sơ cv c E S 1.1.2 Tr ệu c c ẩ 1.1.3 Đ u trị 1.2 ge hể ặ iể di ủ h ge hể 1.2.1 Hệ e ty t ể 1.2.2 Đặc đ ểm d truy ệ e ty t ể 1.2.3 Tí c ất k đồ ất tốc đ đ t b ế ty t ể 1.2.4 Các bệ đ t b ế e ty t ể 1.3 h i hh h h hi i ge h h h i h g MELAS 1.3.1 Kỹ t uật PCR 1.3.2 Kỹ t uật ả trì tự tự đ 11 h g : VẬT U – P ƯƠ P ÁP 13 2.1 i ợ g ghi 13 2.2 Thi ị – ụ g ụ 13 2.3 ó h 13 2.3.1 Hóa c ất tác c ết DN b e ( DN ) từ máu 13 2.3.2 Hóa c ất PCR 13 2.3.3 Hóa c ất dù tro đ ệ d trê e agarose 13 2.3.4 Hóa c ất dù c o p ả t sạc sả p ẩm PCR 14 2.3.5 Hóa c ất dù c o p ả PCR Cyc e seque c 14 2.3.6 Hóa c ất dù c o q trì tủa sả p ẩm PCR Cyc e seque c 14 2.4 Ph g h 14 2.4.1 T u ậ vật ệu ê c u 14 2.4.2 Tác c ết DN từ mẫu máu 14 2.4.3 T ết kế mồ c o p ả PCR 15 2.4.4 P ả PCR 15 2.4.5 Đ ệ d 16 2.4.6 T sạc sả p ẩm PCR 16 2.4.7 Cycle Sequencing PCR 16 2.4.8 Tủa sả p ẩm cyc e seque c PCR 17 2.4.9 Giải trình tự phân tích kết 17 h g : T QU – UẬ 18 3.1 ặ iể g ủ h h 18 3.2 h hi g 18 3.3 iể i 19 3.3.1 Kết k ểm tra t ô số t uyết mồ 19 3.3.2 Kết k ểm tra tí đặc ệu mồ b Pr mer-Blast 20 3.4 h g P R 21 3.5 gi i h h hi i ge DNA hể h h h i h g MELAS 22 h g V: T UẬ – 25 4.1 25 4.2 i ghị 25 T UT O 26 DANH SÁCH BẢNG BIỂU g 1.1: iể hi g ủ h i h g S g 1.2: Ti h ẩ hẩ h i h g S g 2.1: T h ặ i dụ g h gP R ể h ge mtDNA 15 g 2.2: Th h hầ hó h P R 16 g 2.3: h g h hi P R 16 g 2.4: Th h hầ h h h g i h h hẩ P R 16 g 3.1: ặ iể g ủ h h 18 g 3.2: i h h ủ 19 g 3.3: iể h g h ủ id g h h g PCR 19 DANH SÁCH H NH ẢNH h 1.1: ge hể h 1.2: S di he h ― h h i‖ h 1.3: g ủ h g P R 11 h 1.4: S g gi i h g i di 12 Hình 2.1: Thang DNA 1kb plus 14 h 3.1: Pi eST ặ i 21 h 3.2: Pi eST ặ i 21 h 3.3: i di iể hẩ P R h g ge ủ DNA ty hể 22 h 3.4: gi i h 23 DANH MỤC CHỮ VIẾT T T Cyt C Cytochrome C ddNTP dideoxynucleotide DNA Deoxyribonucleic acid FADH2 Flavin adenine dinucleotide MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and strokelike episodes mtDNA Mitochondrial DNA NAD+/NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PCR Polymerase chain reaction ROS Reactive oxygen species THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHI N C U ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Thông tin chung: -T i: Ph gi i h - ã : hi - hủ hi i: g + i hể h T h h i S h ại: g h 0989850374 Email: bichtram1989tn@gmail.com ThS Th i h g i ị - h ại: 0948847479 h i : ltkhuong@ump.edu.vn ( h ,T ): T g Y Si h h Ph - Thời gi h hi : 25/05/2018 – 25/06/2019 Mục tiêu: Thi i g dụ g h h h i h h gi i h g MELAS ại Vi hể ể h hi Nội dun ch nh: - T h hi ge - Thi i g ại i ủ ặ id g h hể i h i h - Thi i - Ph i h g g ời h gP R h ge ụ i ủ S P R, i h h h h h hẩ P R gi i h ge Kết ch nh đạt ( h  V ( h , ợ g, h , i h -xã h i, g h: h g dụ g, ): S/ S/ , ThS, S…): Không  g h g ( i , h, ă x n): Không  S h/ h g  P e , i i h hữ h ã ă g h (T ể hữ ; h( ã hữ h/ h ; , g g h g , hời gi ): Không Hiệu kinh tế - xã hội đề tài man lại: h, ă x ): Không i ới gi i h h i ới h e ă g gi i  ghi ợ h ể gi , gi  Phạ i ị / nghiê ại h g h ể gi h g ời hẩ , ị h ị h ể gi ): Không hỉ g dụ g i gi g ợ ghi , hh i h ( ị hd ại h ): c hẩ (T dụ g h ợ di g MELAS ó hể h g dụ g g gi g dụ g h h h gi Đ T VẤN ĐỀ i h g S (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and strokeh i h like episodes) g ã gi ợ di ặ g i ã ,h h gx h i hầ hi , ă g h ó id hh i h gi g ẻe i d hi h hi hời gi h h i iể h i i h, g ủ hể, g ủ i h h g, ó hể h i i g h g h d g ại i 3243 , 3251 , T3271C, T3291C, A3252G, A3260G, C3256T gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu, i i i 13513 , 12770 e xid ed e ủ 13514 h hợ ge MT-ND5 mã hóa cho , 583 ge MT-TF mã hóa cho tRNAPhe, G1642A gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal, A5814G gen MT-TC mã hóa cho tRNACys T S, i g ó, he i i i T3271 x iể ge tRNAPhe, tRNAVal, tRNACys, R i , S ểx h T ị h g g h h xé ợ ghi hi h i ghi g h h h h hẩ i h, gầ h i h g g h h h h i h ó hi g h di ELAS ủ h g h h S ghi ầ h h ó, hể ể h h h h h i h h gi i g h g MELAS ị hă ị hi ó, x g dụ g h i h h di hh , h ã hó h i h g h g h hó hă , , i i g g, g h g ó h h h h g g S ó hể g h ghi iể hi g hi i hầ ới g hẩ S h h h gh i h g 7,5% h g h hi hi h ặ i Tại h h h h h 80% hác COXIII, ND1, ND5 h ặ ge h , h h iể hi h hi h giới ã ó hi hi , d i h 3243 h h ợ ó hể gó gi h Chươn : TỔNG QUAN TÀI IỆU Tổn quan hội ch n MELAS 1.1 cv 1.1.1 i h c MELAS g i e e i de ) S (Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and strokeh i h g ã gi ợ di ặ g i ã ,h 1984 Tỷ Phầ S ợ g h hi ầ hầ h i h , ă g h ó id hh i h h h h h iể hi d hi i ă g d g i d i h, h h g ủ hể, ầ ầ i ă h i h h 3243 , g g g S h h ) h g ủ h i h ủ h i h hể ( ại i i g 0,2 : 100000 ại di 3243 gen mã hóa cho tRNALeu ủ h h h 1990 hi ợ S he – 40[2] gi g g i i ại ị h g 3251 , T3271C, T3291C, A3252G, A3260G, C3256T gen MT-TL1 mã hóa cho tRNALeu, i G13513A, A12770G A13514G gen MT-ND5 mã hóa cho ND5 ubiquinone xid ed e ủ h hợ , 583 MT-TF mã hóa cho tRNAPhe, ge G1642A gen MT-TV mã hóa cho tRNAVal, A5814G gen MT-TC mã hóa cho tRNACys T i g ó, he i i i 3243 T3271 x iể h ge h tRNAPhe, tRNAVal, tRNACys, R T h hể ă h h g ă g i g x ới h ầ ă g ă g ợ g S ó hể h g h hi g ợi d x ợ ới h h ă g ủ h i hi , i i ã i g[2] hó x hó g i hh g ủ hữ g ei , h h g iể hi g T ) ó hể h i i g… h ã hó g gi h ầ h ầ h hể ó, hữ g g ời ó h S, g [2], [3],[5] hẩ h h (he e i [4] S ó hể g ể h ể hó g g h g ợ g hữ g dễ d g h hi ủ g h g h g COXIII, ND1, ND5 hoặ ge g gi gh i h g 7,5% h ặ ợ g h S 80% h dụ g x dụ g x hi hi i h hi g g i hi , x iể hi g hỉ h g h hợ ới h h h 1.1.2 Tr ệu c c ẩ i h g ă g , h g S h g g ụ g, g hủ, gi e ợ g gd dị h ã i, h h hẩ ủ d h i ệ âm sà g hợ h , iể h g, S h g i i [2],[5] Bả 1.1: B ểu c Biểu - E S[2] Tần số Gi t quỵ Trí tu sa sút ng kinh Nhiễm toan acid lactic Sợi rách nham nh (Raffed red fibers, RRFs) sinh thi Xu t huy t M t thị l c Nh ầu tái phát Khi m thính Y B nh lý thần kinh ngoại biên M t kh ă g h c t p Suy gi m trí nhớ Nơn m a tái phát Tầm vóc ng n Vơi hóa hạch n n ng kinh rung gi Th i u Th i ý th c g i h g h h ờng Bu n rầu, phi n mu n , ă h ă R i loạn tinh thần i h ờng (type 2) Thối hóa thị giác Thối hóa võng mạc Li t ti n triển M g ới k ă g B h i B h ờng d n truy n tim B nh th n B nh bạch bi n g hiễ hó h , i ≥ 90% 7% – 89% 50% – 74% 25% – 49% < 25% di h h ghi ỳ h ó hể hạ Hình 1.4: Sơ đồ ó hể hạ hi uyê h ợ ầ ả trì 12 tự tự đ đ ệ d mao g ời Chươn II: V T IỆU – PHƯ NG PHÁP Đối tượn n hiên c u 2.1 ghi h g i h h S ại h i hi  Vấ đ y đ c tro B h h h h 2.2 - h h g1 ợ hẩ ghi gờ h g 06/2018 h i h g 01/2019 ê c u: hi h id g ủ ghi i h g i ủ ụ 14 g ghi i h ghi gi i ợ gi i h h ợ g ó hể ợ g ghi h i h gi ụ ghi ợ giữ hỉ dụ g Thiết ị – Dụn cụ Máy NanoDrop2000 gi i - i - h 3500 h - i hi , h g h Genetic Analyzer - di (T h di e ) giữ -It® Imager ủ hã g UVP e d f Mastercycler h - g i di GenomeLab GeXP 2.3 Hóa chất 2.3.1 Hóa c ất tác c ết DNA b e ( DNA) từ máu GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scirntific) g ei e ,d g dị h Buffer WB I Wash Buffer II), d gi i ( g dị h h i Solution), d h g dị h (W h ( lution Buffer) 2.3.2 Hóa c ất PCR Takara TaqTM Hot Start Polymerase (Takara Bio) iP R h 2.3.3 Hóa c ất dù g e g g dị h T g ge tro (P ủ i đ ệ d trê e a arose eg ) 0,5X Ethidium bromide 10mg/ml (Sigma) g dị h di g d e (Sig ) Thang DNA 1kb plus (0,1 µg/µl) (Thermo Scientific) 13 h i h g S Hình 2.1: Thang DNA 1kb plus (Thermo Scientific) 2.3.4 Hóa c ất dù c op ả t ExoSAP- T® P R P d e sạc sả p ẩm PCR (The S ie ifi ) g xonuclease I Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) 2.3.5 Hóa c ất dù c op ả PCR Cyc e seque c BigDye® Terminators V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) Sequencing buffer 5X i x i (h ặ 2.3.6 Hóa c ất dù - c o q trì tủa sả p ẩm PCR Cycle sequencing EDTA-Ethylendiaminetetraacetic - Ethanol 70% Acid 0,5M, pH 8,0 (Promega) - Hi-Di formamide - Ethanol 100% 2.4 Phươn ph p 2.4.1 T u V h i g ợ ) h ậ vật ệu i g ại ủ ê c u ghi g g ại i T 4o 1,5 g/ ó ó g ại i g ữ i g ủ h g ợ x e2 g -80oC 2.4.2 Tác c ết DNA từ mẫu máu ợ h hi g GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit ủ hã g Thermo Scirntific he h g d 14 ủ h x , h ợ ợ 200 μ d g dị h h g 2000 (The ) 2.4.3 T ết kế mồ c o p ả S dụ g hầ i h h ủ g h hi ợ g dị h g h hi PCR CLC Main Workbench v5.5 hi hầ GenBank NC_012920.1) g P R h ge h ó ặ MT-ND1 ủ gen MT-TL1, MT-ND5, MT-TK h iể -20oC ữ h g ẵ hể ( ã dụ g h hầ O ig ợ h g ặ hi ủ i h ze 3.1 h h h (S P) ầ g ó hi x h ợ gS P( i ge xỉ h g hời ặ hi Te h gie , Bả 2.1: Trì ủ g h i ẽ ợ ) ầ S g hợ hi ặ hi h ại tự cặp mồ s d i mtDNA-F1 mtDNA-R1 mtDNA-F2 mtDNA-R2 mtDNA-F3 mtDNA-R3 2.4.4 P ả i ợ g hi iể g T( hi i ác thông eg ed p ả PCR để â bả gen mtDNA T h V h i (5’ – 3’) TACTTCACAAAGCGCCTTCC TGCAGAGTGGGGTTTTGCAG GTCATTCTCATAATCGCCCA TATTGATTGTTAGCGGTGTG CTACGGCGGACTAATCTTCA AAGTACTCTGAGGCTTGTAG g n h h (bp) MT-TL1, MT-ND1 2463 MT-ND5 2887 MT-TK 1831 PCR Thi ặ i ) h ị ó hi iể S P he i e ide h i, ầ 3’ ủ ể h (https://secure.ngrl.org.uk/SNPCheck/snpcheck.htm) giúp e ide i ủ Primer-BLAST dụ g g g hi (https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer), (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) i ặ hi h g g gP R ể h ge g 2.1 ới h h hầ sau: 15 h ụ g i g h g h hi h Bả 2.2: T p ầ Bả óa c ất PCR Tên hóa chất 2.3: C PCR Buffer 1X i h MgCl2 1,5 mM ặ ại 40 h dNTP 0,2 i x i/ g ợ Takara ại Taq polymerase i - 0,1 µM HS 0,5 U 700 e, ú g h ex ể ( h gã ) 4oC 25 phút 13000 ò g/ hú ại - dị h i, h 200 μ e h 13000 ò g/ hú - g i e e hú h dị h Ủ h 17 μ - 48o ( e ủ h i h ) ide e, ex , h h 96oC, phút Ủ iữ h -30o - i, h hi i- i f be 4oC 15 phút - - 70% g hú i gi g gi i h ( ĩ 96 gi g) 2.4.9 Giải trình tự phân tích kết T h h hi h e ide ủ g h g hầ h ge i ge 3500 e e i ầ ze ( i W ụ i ge h h ợ x ied i e h 5.5 h g h ó 17 e , g ủ mtDNA ị h g gi i ) h ẽ ợ gió g ó h Chươn III: KẾT QUẢ – BIỆN U N Đặc điểm l m sàn ệnh nh n 3.1 i h ợ g ghi g ại Sh ặ h i ầ hi ợ 14 h hân ã hẩ h g i iể hi hd Bả 3.2 g V ợ h g, h h g i i g i h h ị ợ h g hiễ ỷ : ữ h i bệ Giới t nh Nam ữ ữ Nam ữ ữ ữ ữ ữ Nam Nam Nam ữ Nam â Tuổi mắc ệnh i i i 20 i i i i i i i i i i i h i ầ ể i di h i h h h h h , h ghi h ợ di h h i iS i ợ i hh gi ị h h , ei g h 280 g hi ó gi ó ợ hể hi g ời h i.S g h ó g 260 ó g 260 ó – 20 h h i i h h h g hể hi i Pe h i g ủ g ó, hi ghi i e ghi gờ Kết t ch chiết DNA tổn số T h hi h h ầ ghi h Mã số MELAS-Y1 MELAS-Y2 MELAS-Y3 MELAS-Y4 MELAS-Y5 MELAS-Y6 MELAS-Y7 MELAS-Y8 MELAS-Y9 MELAS-Y10 MELAS-Y11 MELAS-Y12 MELAS-Y13 MELAS-Y14 hẩ ới 3.1: Đặc đ ểm âm sà STT 10 11 12 13 14 i h h toan lactate máu Nghiên : ợ h hi h hi , i gi e i g h h hi g h h iể ị ị hụ ợ g (O h hụ g h i h h ủ – Optical density) h ó g 280 i h h ủ g 3.2 18 a Blood g g ại ớ ó g h h Bả 3.2: Đ t sạc DN tổ Độ tinh (A260/A280) 1,88 1,82 1,90 1,96 1,80 1,85 1,83 Mã số MELAS-Y1 MELAS-Y2 MELAS-Y3 MELAS-Y4 MELAS-Y5 MELAS-Y6 MELAS-Y7 T h h ầ 1,8 – 2,0 ể h ghi ợ h hi g ó g 260 i he oạ v Độ tinh (A260/A280) 1,86 1,92 1,87 1,93 1,80 1,82 1,90 MELAS-Y8 MELAS-Y9 MELAS-Y10 MELAS-Y11 MELAS-Y12 MELAS-Y13 MELAS-Y14 h h c từ mẫu máu Mã số ới ỷ hi ậ đ ó 280 i h g h g Kết kiểm tra mồi 3.3 3.3.1 Kết k ểm tra t ô i ẽ h số t u T ,% ặ ợ , ă g Bả T, t uyết mồ iể h ợ g d h h h h i ( e f-di e ) ze ( số h Chiều dài (bp) 20 20 20 20 20 20 g 3.3, h h h : ợ hi ặ hi ủ g d i, hi g số ó g ó (h i i ), h ă g g hầ O ig c op ả PCR g 3.3 t uyết mồ dù G kcal.mol-1) HeteroSelf-dimer dimer -4,64 -6,44 -4,62 -10,24 -5,12 -4,52 -5,25 -5,49 -3,14 N n lượn tự Tm (oC) %GC 58,5 61,1 55,3 53,7 56,9 53,8 h : i g h hi ú ợ ó 3.3: Kết k ểm tra t ô mtDNA-F1 mtDNA-R1 mtDNA-F2 mtDNA-R2 mtDNA-F3 mtDNA-R3 h ă g h h h h he e -di e ỳ) Mồi g Hairpin 50 55 45 40 50 45 0,21 -0,22 -2,25 -1,48 -1,34 0,58 ó hi d i 20 18 30 g ể ó hể i Th g h g, hi e ẽ dễ d g ới d i ủ ủd i h h h hi giữ ặ id i i ặ i hi gP R h i h (Tm): ó h h h hi h 61,1o ; h gen mtDNA ( 19 g h h t 53,7oC) h Th h hầ d g h hi h ẽ ặ ầ : The h g 40% – 60% ợ xe ó% g h ú ó ( i i ): h h ú ới h hi ú h ú Se f-di e : i e) ẽ gi ới hh i h g ầ h i g ẽ h ới g hể i -6 kcal.mol-1 ầ h i T hi , gi ịΔ h P R ix ih ặ g ợ ặ i ẽ óx h g ó ặ P R ầ 3’ h i i ú hi g P R h h gi g hi hi g ih h h h ó ẽ h g -6 kcal mol-1 ặ e ide g ẽ ú g ầ h h h h h h , h h hầ g h g ó hi ó Δ h h h h i ghi i ó gi ịΔ ới h (Se f- h h di e h h h ặ x xỉ -10 kcal.mol-1 ú e e - di e : i ó gi ịΔ ủ ặ V , h g gP R h h h ại i hi hi ủ i ã ợ g 3.3.2 Kết k ểm tra tí đặc ẽ ge ợ ụ i ệu mồ b ợ iể iể ầ ủ ặ g ợ g ặ ụ i h h 3.1 hình 3.2 i hh i h Pr mer-Blast h ặ hi 2d g h hể Ngồi ra, ặ ó hi sinh ặ hi h ại ị hữ g h ă g hi h i ị g hầ ặ hẩ h ầ 3’ h ặ hẩ i h g ụ i iể h ặ hi ủ ụ i ủ gP R h ó ặ ặ ú g g ặ hi i gen i h T hầ h P R 20 h ầ i h ó i h ại ặ hi , h ới ầ 3’ ủ ó hể x ủ Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) i -9 kcal.mol-1 h h ặ hẩ ặ ó, h ó hể h i h g ă g h hụ g Hì 3.1: Kết Pr mer-B Hì g DNA h h h P R Vi i g h ge g ND5, MT-TK i 3.2: Kết Pr mer-B ST cặp mồ Kết phản n PCR 3.4 i ST cặp mồ số ợ x d ủ h h h gP R h h h ại g h g h gi i MT-ND1 h h h g h ể i h h h P R, ợ g ặ hi h hi ge g h ó hi h hợ 21 S i g ặ hi ợ dụ g ầ h h h hi gen MT-TL1, MThỉ i g hữ g g h i ới h ể g P R, ị h i hi h h h hợ i ặ ẽ ủ i ghi ợ g h h h Sg iể g i h ă g ă g , ge dụ g h di hẩ x h h ủ i ủ ụ MT-TL1, MT-ND5, MT-TK ợ MT-ND1 h h g é d i h ỗi ã i h i h MT-TL1 h g ge g ụ i ặ hể i i( h 3.3) S e 1,5% i g õ é, ú g g ó gen MT-ND1, hẩ di h h hẩ ụ P R ẽ P R h i h g ó i h Hì 3.3: Kết đ ệ d k ểm tra sả p ẩm PCR DN ty t ể Các ế â bả m t số vù từ – 3: sả p ẩm PCR t bp 31bp, ế - :c âm, v ế kíc t :t a c 24 3bp, c uẩ (1kb p us) Kết iải trình tự ph t đột iến en DNA ty thể 3.5 e ệnh nh n mắc hội ch n ME AS S d hẩ ó, ể ó i h h P R i ủ h g i i i ợ ã h i h h 22 ge , gi i ợ gi i i he ợ hi g ò P R ợ S ie ifi S h h x h hẩ ủ The dụ g h h ủ h e h h ợ gi i h h hầ gi i x S P-IT® P R P d hể h ò h i h h ủ i ge h h ợ g g i hẩ T P R C h h i h ới hi h ge ụ g ầ g ợ ty hể g ời h ẩ h g 14 hợ g g g h h i e ide ới ỷ 50,0%), h h h h T T 3.4: Kết ã ghi gờ ( hiể hể ó Hì h g ge ị ả trì _012920.1 h i h g g h 3.4 ) 8281 8289 ( h h S, ã h hi g ó6 ( h i g ại ị 3243 i g h 3.4 ) tự DN ( ) đ t b ế m.3243 (B) đ t b ế nucleotide (m.8281_8289delCCCCCTCTA) i 3243 > tRNALeu, d hh g g hợ ó, ó gi h hợ ei hể gi ge MT-TL1 ủ ă g h g h h g h g hể ới ặ i ủ d ợ g e i e i h h hó h i e i ei ă g ủ ã hó g hể, h ỗi h h x hó , ặ ại i g h hợ hể T ( dehydrogenase) IV (cytochrome C oxidase)[1], [2],[5] i h g ã hó h ge hể i ty hể ó ỷ d hữ g ih ị ỗi R h giữ ge ợ g g ã hó ( O ) R g i h ợ xe hể g ời h Á i , e xid e e ide h ặ d ei T T ) x ầ g ide ( 8281_8289de h h g i ợ g h g h 23 Lys ide x g ge i g g ủ h ge hữ h ặ d e ide h g h i g hi h ã hó h i h ó ă g g g i h g i iể hi T h ă hể h g hó i h gi i h h S P R, hú g g i i ã i h gi i ó h hể hẩ h h ới ầ x d gh i h h i h g h h h i h ó hể h h ge S g h ẩ ể ă g ủ hể ợ g hữ g i ợ g h hẩ x g ó ó h i hữ g ã ị h h i g h xé ghi hẩ i ẽ giú h hi Vi g h g ge 24 ủ h gi i S h g gi gi g i P R g hữ g x hó ă g hể ói i g, g dụ g h h ă g ầ h hầ hẩ x g ụ hữ g di , hể[8],[9] S ẽ dụ g x ói h g g g i g ới h di h i h hẩ ei , g ẽ gó h h h i h h i h ể h ể hó ợ g h g xé i h g hể g hh ợ xe giữ dụ g x h h ă g ó hể i i hể g i i Ư g ge iể ủ , Chươn IV: KẾT U N – KIẾN NGH Kết lu n 4.1 Q h ghi , hú g ã hi Nghi i h h : g3 ặ gen MT-TL1, MT-ND5, MT-TK id g h h MT-ND1 ủ gP R h hể ới hi 60oC ặ Ph hi g i i 50,%): m.3243A>G di h g h h i ới gi h 4.2 h h hi h i m.8281_8289delCCCCCTCTA h h hân ợ ò h h h i h ng gen ó g g hỉ ó ghĩ h h h ỷ i MT-TL1 i g i hữ S ( hi ă , ó i x g h ị h g di h hi Kiến n hị hi h gi i hó g ủ hP R ể h i ợ g h h 25 ge i ủ hể iể h h ủ TÀI IỆU THAM KHẢO 10 Aharoni S, Traves TA, Melamed E, Cohen S, Silver EL (2010), "MELAS syndrome associated with both A3243G-tRNALeu mutation and multiple mitochondrial DNA deletions", Journal of the neurological sciences 296(1-2): 101-103 Henry C, Patel N, Shaffer W, Murphy L, Park J, Spieler B (2017), "Mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes—MELAS syndrome", The Ochsner Journal 17(3): 296-301 Liou CW, Huang CC, Chee EY, Jong YJ, Tsai JL, Pang CY, Lee HC, Wei YH (1994), "MELAS syndrome: correlation between clinical features and molecular genetic analysis", Acta neurologica scandinavica 90(5): 354-359 Chinnery PF (2014), "Mitochondrial disorders overview" El-Hattab AW, Adesina AM, Jones J, Scaglia F (2015), "MELAS syndrome: clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options", Molecular genetics and metabolism 116(1-2): 4-12 Friedman JR, Nunnari J (2014), "Mitochondrial form and function", Nature 505(7483): 335 Garibyan L, Avashia N (2013), "Research techniques made simple: polymerase chain reaction (PCR)", The Journal of investigative dermatology 133(3): e6 Khan IA, Shaik NA, Pasupuleti N, Chava S, Jahan P, Hasan Q, Rao P (2015), "Screening of mitochondrial mutations and insertion–deletion polymorphism in gestational diabetes mellitus in the Asian Indian population", Saudi journal of biological sciences 22(3): 243-248 LIU CS, CHENG WL, CHEN YY, MA YS, PANG CY, WEI YH (2005), "High Prevalence of the COII/tRNALys Intergenic 9‐bp Deletion in Mitochondrial DNA of Taiwanese Patients with MELAS or MERRF Syndrome", Annals of the New York Academy of Sciences 1042(1): 82-87 Stewart JB, Chinnery PF (2015), "The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease", Nature Reviews Genetics 16(9): 530 26 ... TACTTCACAAAGCGCCTTCC TGCAGAGTGGGGTTTTGCAG GTCATTCTCATAATCGCCCA TATTGATTGTTAGCGGTGTG CTACGGCGGACTAATCTTCA AAGTACTCTGAGGCTTGTAG g n h h (bp) MT-TL1, MT-ND1 2463 MT-ND5 2887 MT-TK 1831 PCR Thi ặ i ) h ị ó hi... ại t? ?? cặp mồ s d i mtDNA-F1 mtDNA-R1 mtDNA-F2 mtDNA-R2 mtDNA-F3 mtDNA-R3 2.4.4 P ả i ợ g hi iể g T( hi i ác thông eg ed p ả PCR để â bả gen mtDNA T h V h i (5’ – 3’) TACTTCACAAAGCGCCTTCC TGCAGAGTGGGGTTTTGCAG... e ghi gờ K? ?t t ch chi? ?t DNA t? ??n số T h hi h h ầ ghi h Mã số MELAS- Y1 MELAS- Y2 MELAS- Y3 MELAS- Y4 MELAS- Y5 MELAS- Y6 MELAS- Y7 MELAS- Y8 MELAS- Y9 MELAS- Y10 MELAS- Y11 MELAS- Y12 MELAS- Y13 MELAS- Y14 hẩ