Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần trong chọn giống lúa chịu ngập chìm

Đối với gen chống chịu ngập cho đến nay các nhà khoa học ở Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế đã xác định được một số các chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen có thể ứng dụng trong chọn giốn[r]

Ứng dụng thị phân tử liên kết gần chọn giống lúa chịu ngập chìm

Vũ Thị Thu Hằng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70

Người hướng dẫn: TS Lưu Thị Ngọc Huyền Năm bảo vệ: 2011

Abstract Tổng quan ảnh hưởng biến đổi khí hậu, nước biển dâng đến sản xuất lúa gạo; vùng trồng lúa Việt Nam có khả bị ngập theo kịch biến đổi khí hậu Nghiên cứu chế tính chống chịu ngập lúa: gen chịu gập lúa chế hoạt động; sinh lý học tính chịu ngập lúa; di truyền tính chịu ngập lúa Tìm hiểu số loại thị phân tử thường sử dụng nghiên cứu Genome chọn giống thực vật, đồng thời nghiên cứu chọn tạo giống chụi ngập giới Việt Nam Nghiên cứu giống lúa cho gen: IR64Sub1 giống lúa nhận gen: AS996 môi trường chịu ngập nước Việt Nam Trình bày phương pháp nghiên cứu: phương pháp lai hữu tính -lai trở lại giống cho nhận gen chịu ngập nước; phương pháp tách chiết ADN tổng số; phương pháp PCR với mồi SSR; phương pháp điện di gel agarose 0,8%; phương pháp điện di gel polyacylamide; phương pháp xử lý số liệu Đưa kết nghiên cứu thảo luận: tách chiết tinh ADN tổng số; khảo sát đa hình hai giống bố mẹ; quy tụ gen chịu ngập chìm SuB1 vào giống lúa AS996

Keywords Di truyền học; Phân tử; Giống lúa chịu ngập chìm; Cây lúa

Content

MỞ ĐẦU

2

Trên giới, an ninh lương thực không vấn đề với nước nghèo mà trở thành vấn đề có tính tồn cầu Dân số giới liên tục tăng (khoảng tỷ người năm 2011) diện tích đất dành cho việc trồng lúa không tăng mà ngày giảm đất chuyển sang sử dụng cho mục đích khác xây dựng khu công nghiệp, trường học, nhà ở, khu du lịch

Bên cạnh đó, dấu hiệu biến đổi khí hậu nhận thấy trái đất nóng lên, băng tan hai cực, bão lũ xảy thường xuyên Ở Việt Nam nhiệt độ trung bình hàng năm tăng 0,10C mực nước biển tăng 2,5 – 3,0 cm năm

trong thập kỷ qua Tính đến cuối kỷ 21, nhiệt độ Việt Nam tăng khoảng 2,30C

và mực nước biển tăng 75 cm tính theo mức trung bình năm 1980 – 1999

Đối với gen chống chịu ngập nhà khoa học Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế xác định số thị phân tử liên kết chặt với gen ứng dụng chọn giống, sử dụng phương pháp MABC để chọn giống chịu ngập chìm Để góp phần tạo giống lúa có khả chịu ngập chìm ứng phó với biến đổi khí hậu thời gian tới, ứng dụng kết nghiên cứu vào sản xuất, thực đề tài: ―Ứng dụng thị phân tử liên kết gần chọn giống lúa chịu ngập chìm” Đề tài đề với mục tiêu cụ thể sau:

- Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ thị phân tử kết hợp lai trở lại để quy tụ gen chịu ngập (Sub1) xác định trước vào giống lúa suất cao trồng phổ biến Việt Nam với thời gian ngắn đáp ứng nhu cầu giống sản xuất Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu

- Giống lúa cho gen: IR64Sub1 giống chịu ngập chìm Giống lúa chống chịu ngập Philippines công nhận Họp Hội đồng thư ký lần thứ 27 ngày tháng năm 2009

Quyết định số 5310 QĐ/BNN-KHCN, ngày 29 tháng 11 năm 2002 Bộ Nông Nghiệp & PTNT

- Một số giống lúa trồng phổ biến Việt Nam Q5c, Q5l, OM5472, FL478, IR64SUB1, AS996, KDDB, BT

2.1.2 Hóa chất thiết bị thí nghiệm

- 372 thị SSR phân bố rải rác trên12 NST (phụ lục 1) - Các vật tư, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng(phụ lục 2) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp lai hữu tính giống lúa cho nhận gen kháng Kết hợp với phương pháp lai trở lại để chọn lọc làm nhanh dòng mang gen kháng gen tối đa giống nhận gen

- Tách chiết tinh ADN theo phương pháp CTAB cải tiến

- Chọn lọc mang gen kháng thông qua phương pháp PCR thị SSR liên kết với QTL quy định tính chịu ngập chìm (Sub1) Chọn lọc gen thông qua phương pháp PCR thị phân bố 12 NST lúa

- Điện di gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide - Điện di gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc

- Điện di gel polyacrylamide không biến tính 6% nhuộm Syber safe

- Phân tích liệu chương trình Graphical Genotyper (Van Berloo, 2008)[89]

Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ADN TỔNG SỐ

4

Hình Kết kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phƣơng pháp CTAB gel agarose 0,8%

Giếng số 1: Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/l), Các giếng từ -17: ADN mẫu nghiên cứu

Kết tách chiết ADN cho thấy phương pháp tách chiết ADN CTAB cho hiệu cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Nồng độ khoảng từ 200 – 300ng/l so sánh với lambda ADN chuẩn nồng độ 200ng/l giếng số Các mẫu ADN không bị đứt gãy, việc loại bỏ RNA RNase tiến hành tốt thể băng điện di gọn, rõ Những mẫu ADN đủ điều kiện để sử dụng cho thí nghiệm sinh học phân tử

3.2 KHẢO SÁT ĐA HÌNH GIỮA HAI GIỐNG BỐ MẸ

Đa hình hai giống lúa phát chiều dài khác đoạn lặp lại khuyếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi SSR

Giống IR64Sub1 có mang gen chịu ngập Sub1 Nhằm mục đích tìm kiếm thị sử dụng để phát gen chịu ngập cá thể lai tiến hành phản ứng PCR với ADN giống lúa 1.Q5c; 2.Q5l; 3.OM5472; IR64Sub1; 5.FL478; 6.KDDB; 7.AS996, BT Sử dụng 372 thị SSR 12 nhiễm sắc thể kết có 53 thị cho băng đa hình giống AS996 IR64Sub1 nêu bảng

Bảng7 Các thị SSR cho đa hình giống cho nhận gen chịu ngập Tt Tên mồi NS

T Trình tự xi Trình tự ngƣợc

Kích thƣớc RM237 caaatcccgactgctgtcc tgggaagagagcactacagc 130 RM10115 acaagacgaggtaacacgcaagc gcgaaggatcaacgatgatatgg 245 RM7075 tgtgaagcacatccagtgatcc gggatgagtgacacttgttaatgg 317 S01132a caatgacgacgcatgtatgt tgcttgaatgtttttcgagg 196 RM6 gtcccctccacccaattc tcgtctactgttggctgcac 163 RM154 gacggtgacgcactttatgaacc cgatctgcgagaaaccctctcc 271 RM341 caagaaacctcaatccgagc ctcctcccgatcccaatc 172 RM109 gccgccggagagggagagagag ccccgacgggatctccatcgtc 97 RM300 gcttaaggacttctgcgaacc caacagcgatccacatcatc 121 10 RM6318 tgctgcttctgtccagtgag ggatcataacaagtgcctcg 199 11 RM60 agtcccatgttccacttccg atggctactgcctgtactac 165 12 RM3867 tttgactggaacatcgagctc atcccctctacaccgtaccc 120

13 SO3068 gggatgggagaagggaataa gccagctaggatgttgaagg 178

14 RM307 gtactaccgacctaccgttcac ctgctatgcatgaactgctc 174 15 RM124 atcgtctgcgttgcggctgctg catggatcaccgagctcccccc 271 16 R4M13 tacacggtagacatccaaca atgatttaaccgtagattgg 169 17 R4M17 agtgctcggttttgttttc gtcagatataattgatggatgta 169 18 RM3367 ggatccatccatccactgac ggatatgtgctgctgtgtgc 126 19 RM437 acaccaaccagatcagggag tgctcgtcaatggtgagttc 275

20 RM18877 accactgctgcaaagaacattgg gcgagaataagatgagacacaagag

g 190

21 R5M20 ctcgctgtttactgactgg tttgatgtactgcctgctct 175 22 S06061 gtcagtcgaggagtcggaga ggcgtacagcacaaaacaca 178 23 S06065a ccccttcatcattgcaactt agtctctccatcacccgtct 164 24 RM508 ggatagatcatgtgtggggg acccgtgaaccacaaagaac 235 25 RM19840 ttatacacagatgacgcacacg tgggttaagggacacacttagg 200 26 RM3635 cgtgagagcgtgagagacag actttggtgttccctccctc 109

27 RM18 ttccctctcatgagctccat gagtgcctggcgctgtac 157 28 S07053 cgaaactttgggacgaaatg cgtccaccattcactgtcac 223 29 RM149 ggaagcctttcctcgtaacacg gaacctaggccgtgttctttgc 253 30 RM310 ccaaaacatttaaaatatcatg gcttgttggtcattaccattc 105

6

33 RM215 caaaatggagcagcaagagc tgagcacctccttctctgtag 148 34 RM257 cagttccgagcaagagtactc ggatcggacgtggcatatg 147 35 RM316 ctagttgggcatacgatggc acgcttatatgttacgtcaac 192 36 RM23662 gagaggacgatggcactattgg cgaggaacttgattcgcatgg 149 37 RM24013 tccatcttcctctcctagagcttcc ctccctgtcccgagttagtgc 192

38 R9M10 ctttggattcaggggga aacttgaaacggaggcag 135

39 RM7175 acagtaaacgtggtgcctcc agaagtagcctcgaggaccc 105 40 ART5 cagggaaagagatggtgga ttggccctaggttgtttcag 159 41 SC3 gctagtgcagggttgacaca ctctggccgtttcatggtat 165 42 R9M30 cacatggcaccaacctcc gccaagtcattcactactctgg 123 43 RM296 cacatggcaccaacctcc gccaagtcattcactactctgg 123

44 RM228 10 ctggccattagtccttgg gcttgcggctctgcttac 154 45 RM271 10 tcagatctacaattccatcc tcggtgagacctagagagcc 101 46 RM25271 10 agacgctactcccacctgtaacc atatcattgccgcaacacaagc 185 47 S11117C 11 caaccatgtctatgatcgatgt ggctgtctccatgttgaggt 205 48 RM287 11 ttccctgttaagagagaaatc gtgtatttggtgaaagcaac 118 49 RM206 11 atatgagttgctgtcgtgcg caacttgcatcctcccctcc 134 50 RM224 11 atcgatcgatcttcacgagg tgctataaaaggcattcggg 157 51 RM17 12 tgccctgttattttcttctctc ggtgatcctttcccatttca 184 52 RM7558 12 cagtagcaggctcccttttg atcaggaacaccagagacgg 149 53 RM7102 12 ttgagagcgtttttaggatg tcggtttacttggttactcg 169

Tổng số 53 thị cho đa hình giống cho gen (IR64 Sub1) giống nhận gen (AS996) đãđược sử dụng để đánh giá xác định kiểu gen hệ lai

Hình Kết khảo sát đa hình với ADN giống cho nhận gen với thị

RM17; RM186; RM257; RM510

Để lựa chọn gen đích (Sub1) tiến hành khảo sát nhóm thị nằm vị trí gen hai phía gen Sub1 nhiễm sắc thể số Đã xác định hai thị ART5 SC3 cho đa hình Hai thị liên kết chặt với gen Sub1 Chỉ thị ART5 thiết kế từ vùng promoter gen Sub1 vị trí 6,3 Mb thị SC3 ở vị trí 6,6Mb nhiễm sắc thể số 9.

Sau đó, để lựa chọn cá thể tái tổ hợp tiến hành sử dụng 10 thị cho đa hình nhiễm sắc thể số 9, thị nằm hai phía gen Sub1 có khoảng cách gần 1,8 Mb đầu vị trí R9M10 2,8Mb đầu vị trí RM24013 so với gen Sub1 (vị trí gen Sub1 6.3–6.6 Mb 4.4–6.8 cM) (Xu et al 2006)[93]

Những mồi cho đa hình nhiễm sắc thể cịn lại khơng liên kết với gen Sub1 sử dụng để kiểm tra di truyền giống nhận gen Kết đánh giá đa hình tổng kết lại bảng

Bảng Các bƣớc chọn lọc sử dụng thị SSR cho đa hình quần thể lai trở lại

Các bƣớc chọn lọc Các mồi đa hình sử dụng cho quần thể

BC1F1 đến BC3F1

1 Lựa chọn cá thể ART5, SC3

Hình Kết khảo sát đa hình với ADN giống cho nhận gen với thị RM18; RM118; RM152; RM223; RM284

8

mang gen đích (Sub1)

2 Lựa chọn cá thể tái tổ hợp

RM23662, RM316, R9M10, RM24013, RM105, RM7175, RM257, RM215, RM296, R9M30

3 Lựa chọn di truyền nhận gen

RM6, RM17, RM18, RM60, RM109, RM124, RM149, RM154, RM206, RM224, RM228, RM237, RM311, RM287, RM300, RM307, RM310, RM341, RM6318, RM7558, RM10115, RM7102, RM25271, SO6061, SO6065A, SO7053, S1117C, SO1132A, R4M13, R4M17, R5M20, RM7075, SO3068, RM3367, RM3867, RM437, RM508, RM19840, RM3635, RM337, RM7102

3.3 QUY TỤ GEN CHỊU NGẬP CHÌM SUB1 VÀO GIỐNG LÚA AS996 3.3.1 Xác định lai F1

Thế hệ F1 lai tạo 22 cá thể Các cá thể trồng, tách chiết ADN để

xác định lai nhờ trợ giúp thị phân tử

Để xác định cá thể F1 mang gen kháng, tiến hành phản ứng PCR với AND

mẹ (AS996) bố (IR64Sub1) lai F1 với hai thị cho đa hình liên kết chặt

với gen Sub1 SC3, ART5 Kết kiểm tra xác định cá thể mang gen minh họa hình 10

1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Trong tổng số 22 cá thể F1 đánh số từ 1-22 tương ứng từ giếng số đến

giếng số 24, ghi nhận có 11 mẫu ADN 11 cá thể có mang băng: băng đặc trưng cho AS996, băng đặc trưng cho IR64Sub1 cá thể số: 4, 5, 6, 7, 9, 16, 17, 19, 20, 21, 22 Các cá thể chọn làm mẹ để tiến hành lai trở lại với giống nhận gen tạo hệ BC1F1

3.3.2 Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 hệ BC1F1

Dựa đồ vùng QTL chịu ngập thị tốt khu vực Sub1 ART5 thiết kế từ vùng promoter gen SC3 thiết kế phía gen Sub1 NST số sử dụng để lựa chọn cá thể mang gen Phản ứng PCR tiến hành ADN giống lúa AS996, IR64Sub1 lai với hai thị

Tổng số 497 cá thể quần thể BC1F1 đƣợc tiến hành tách chiết ADN kiểm tra có mặt gen đích (Sub1) hai thị liên kết chặt ART5 SC3 Kết đƣợc minh họa hình 11 12

Kết hình 11 thể phân tích cá thể BC1F1 với thị SC3 cá thể dị hợp tử mang băng giống nhận gen giếng số 49 giống cho

Hình 11 Kết sàng lọc cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với thị

SC3.Giếng 1, 26: 25bp ladder, 2-25 27-48: cá thể BC1F1

10

gen giếng số 50 giếng số 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 18, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 48

Giếng số 5, 11, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 41, 46, 47 mang băng giống nhận gen, cá thể không mang gen kháng loại bỏ bước sàng lọc sau

Kết hình 12 thể phân tích cá thể BC1F1 với thị ART5 cá thể dị hợp tử mang băng giống nhận gen giếng số giống cho gen giếng số giếng số 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24,26, 27, 33, 34, 39, 45, 47, 48

Kết thu 165 cá thể BC1F1 dị hợp tử với hai thị ART5 SC3

Những cá thể dị hợp tử mang hai băng giống nhận gen giống cho gen với hai thị ART5 SC3 lựa chọn để chọn lọc cá thể tái tổ hợp Sàng lọc cá thể tái tổ hợp từ 165 cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng 10 thị cho đa hình nhiễm sắc thể số

Kết phân tích để sàng lọc cá thể tái tổ hợp NST

Hình 13 Sàng lọc cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với thịRM23662

Giếng 1,26: 25bp ladder, 2-25 27-48: cá thể BC1F1 giếng 49:AS996,

giếng 50: IR64Sub1

Sàng lọc cá thể BC1F1 với thị RM23662 hình 13 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen giếng số 44 giếng số 46

Sàng lọc cá thể BC1F1với thị RM240113 hình 14 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen giếng số 14, 27, 34, giếng số 46

Tương tự sàng lọc cá thể BC1F1 với thị RM7175 hình 15 cho thấy cá thể

tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen giếng số 2, 6, 10, 11, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 42 giếng số 46

Sử dụng 10 thị lựa chọn đƣợc tổng số 14 cá thể tái tổ hợp, 5/14 cá thể tái tổ hợp mang trao đổi chéo vị trí R9M10 RM24013; 9/14 cá thể tái tổ hợp đầu NST vị trí RM24013 Kết xác định đƣợc đoạn trao đổi chéo mang gen Sub1 hai đầu dƣới gen Sub1 đƣợc chuyển vào dòng BC1F1 Kết 14 cá thể tái tổ hợp đƣợc lựa chọn để tìm cá thể mang di truyền mẹ lớn cá thể số 5, 6, 39, 62, 63, 103, 153, 166, 215, 327, 340, 412, 422, 428

Đối với hệ BC1F1, tổng số 26 thị cho đa hình khơng liên kết với gen Sub1 11 nhiễm sắc thể lại để lựa chọn di truyền nhận gen

Số liệu cá thể đƣợc đƣa vào phân tích chƣơng trình Graphical Genotyper để lựa chọn Các cá thể mang gen đồng hợp tử mẹ nhiều

12

đƣợc lựa chọn để lai tạo hệ BC2F1 Kết đƣợc nêu bảng 10, hình 16, hình 17

Bảng 10 Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen 14 cá thể BC1F1 tái tổ hợp

Cây số 39 62 63 103 153 166 215 327 340 412 422 428 A 66.67 54.17 62.50 41.67 54.17 45.83 58.33 45.83 66.67 58.33 66.67 72.00 75.00 72.00 H 25.00 45.83 37.50 58.33 45.83 33.33 41.67 54.17 33.33 41.67 33.33 24.00 25.00 24.00 R% 79.17 77.08 81.25 70.83 77.08 62.50 79.17 72.92 83.33 79.17 83.33 84.00 87.50 84.00

Từ kết cho thấy 14 cá thể tái tổ hợp có mang gen Sub1 chứa tối đa gen giống nhận gen từ 62,5% đến 87,5% Các cá thể có di truyền cao P422 với 87,5% cịn có cá thể P412 (84%) P428 (84%), P215 (83,33) P39 (81,25)

Kết lựa chọn cá thể BC1F1 có mang vùng gen Sub1 chứa tối đa gen giống nhận gen (R%) khoảng từ 80 - 86% để tiếp tục lai tạo hệ BC2F1 Gen Sub1 gen quy định tới 70% tính chống chịu ngập chìm hầu hết giống lúa nhà khoa học IRRI thử nghiệm từ trước tới

3.3.3 Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 hệ BC2F1

Từ cá thể BC1F1 đƣợc lựa chọn lai tạo đƣợc quần thể hệ BC2F1 với 506 cá thể Tiến hành tách chiết ADN, làm phản ứng PCR với bƣớc nhƣ hệ BC1F1 Kết đƣợc minh họa hình 18 hình 19

Khi phân tích cá thể BC2F1 với thị SC3 cá thể dị hợp tử mang băng giống cho gen giống nhận gen giếng số 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 22, 25, 27, 29, 31, 35, 36, 39

Những giếng lại cá thể cho băng giống nhận gen AS996 cá thể khơng mang gen Sub1.

Khi phân tích cá thể BC2F1 với thị ART5những cá thể dị hợp tử mang băng giống giếng số 3, 5, 10, 16, 18, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 60, 61

Những giếng lại mang băng AS996

Sau bƣớc sàng lọc gen đích với hai thị ART5 SC3 để kiểm tra có mặt gen đích Sub1 cá thể lai thu đƣợc 245 cá thể dị hợp tử mang hai băng giống cho nhận gen

Sau đó,Tiến hành chọn lọc cá thể tái tổ hợp 10 thị kề hai bên gen Sub1 trên nhiễm sắc thể số nêu bảng với 245 cá thể mang gen Kết minh họa từ hình 20 đến hình 22

Sàng lọc cá thể BC2F1 với thị RM316 hình 20 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen giếng số 55, 56, 57, 66

Hình 19 Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với thị ART5 ADN: 1AS996, IR64Sub1, Các giếng ký hiệu từ C67-C328: Các cá thể BC2F1

Hình 20 Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với thị RM316

14

Sàng lọc cá thể BC2F1 với thị RM105 hình 21 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen giếng số 8, 12, 14, 17, 19, 25, 31, 45.51

Sau sàng lọc với 10 thị NST số chọn đƣợc 17 cá thể tái tổ hợp

Kết cá thể có gen nhận gen cao 93,75 % cá thể số P442 -11 P442 -14 Cá thể có gen nhận gen thấp 89,7% cá thể số P39-80 Ngồi ra, cịn có cá thể P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 có gen nhận gen 92,25% Các cá thể có mang gen Sub1 có gen nhận gen cao nhất P442 -11 P442 -14 P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 đƣợc chọn để lai tạo quần thể BC3F1

3.3.4 Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 hệ BC3F1

Tƣơng tự nhƣ với quần thể BC2F1 cho hệ BC3F1 với 445 cá thể Sử dụng hai thị ART5 SC3 hai thị liên kết chặt với gen Sub1 để lựa chọn cá thể mang gen Sub1 hệ BC3F1 Kết đƣợc minh họa hình 23 24

Hình 21 Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với thị RM105

ADN: 1.AS996, IR64Sub1, giếng 3-53: cá thể BC2F1

1

Hình 23 Sàng lọc cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với thị SC3Giếng 1: 25bp

Khi phân tích cá thể BC3F1 với thị SC3 cá thể dị hợp tử mang băng giống cho gen giếng số 49 giống nhận gen giếng số 50 giếng số 3, 5, 6, 8, 10, 14, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 30, 31, 32, 33, 35, 39, 40, 41, 42, 43, 46, 47

Những giếng lại cá thể mang băng giống nhận gen AS996

Khi phân tích cá thể BC3F1 với thị ART5những cá thể dị hợp tử mang băng giống nhận gen giống cho gen giếng số 5, 6, 10, 16, 17, 19, 22, 23, 24, 25, 28, 31, 32, 34, 35, 36, 38, 41, 43, 44, 45, 50, 51

Các giếng lại cá thể cho băng AS996

Lựa chọn cá thể dị hợp tử với hai thị xác định 124 cá thể mang gen Sub1 Sau đó, 124 cá thể mang gen tiếp tục sàng lọc với thị NST số để tìm cá thể tái tổ hợp

Hình 25 Sàng lọc cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với thị 7175

Giếng1:25bp ladder, 4-45:Các cá thể BC3F1, giếng 2,46 :AS996, giếng3,47: IR64Sub1

Hình 24 Sàng lọc cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với thị ART5 giếng 1, 27:

16

Sàng lọc cá thể BC3F1 với thị RM7175 hình 25 cho thấy tất cá

thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen

Sàng lọc cá thể BC3F1với thị RM24013 hình 26 cho thấy tất

các cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen

Sàng lọc từ 10 thị cho đa hình NST số với 124 cá thể Kết chọn 22 cá thể tái tổ hợp Những cá thể tiếp tục chọn lọc di truyền giống nhận gen Sử dụng 19 thị 11 nhiễm sắc thể cịn lại Thí nghiệm minh họa hình số 28 đến hình số 30

Sàng lọc cá thể BC3F1ở hình 3.26 với thị RM10115 NST số Chỉ

thị S11117C NST số 11 nhận thấy tất cá thể mang băng đồng hợp tử giống nhận gen AS996

Hình 28 Sàng lọc cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với thịRM10115 (trái)Giếng1,25: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3: IR64Sub1 4-24:các cá thể BC3F1

S1117C (phải)giếng1: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3: IR64Sub1 4-24:các cá thể BC3F1 Hình 26 Sàng lọc cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với thị RM24013

Sàng lọc cá thể tái tổ hợp BC3F1ở hình 29 với thị R4M17 NST số

còn cá thể giếng số 3, 4, 5, mang băng giống cho gen Chỉ thị R5M20 NST số cá thể mang băng đồng hợp tử giống nhận gen

Sàng lọc cá thể BC3F1ở hình 30 với thị RM341 NST số thị

RM228 NST số 10 nhận thấy tất cá thể mang băng đồng hợp tử giống nhận gen AS996

Số liệu cá thể đƣợc đƣa vào phân tích chƣơng trình Graphical Genotyper để lựa chọn cá thể BC3F1 Các cá thể mang gen đồng hợp tử mẹ nhiều đƣợc lựa chọn để lai cho lai tạo hệ BC4F1

1: chrom1 2: chrom2 3: chrom3 4: chrom4 5: chrom5 6: chrom6 7: chrom7 8: chrom8 9: chrom9 10: chrom1011: chrom11 12: chrom12 15

45 57 144 164 176 177 178 189 201 216 239 251 252 255 318 320 321 354 356 357 404 Consensus

Legend A B H

Hình 31 Biểu đồ 12NST 22 cá thể hệ BC3F1 (AS996/IR64 Sub1) Hình 29 Sàng lọc cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với thị R4M17 R5M20

18

Kết xác định đƣợc hai cá thể P422-14-164 P422-14-178 có gen nhận lên đến 96.29% so với AS996 ban đầu, cá thể số 422-14-177 tốt với 100% alen từ AS996 tổng số 53 thị sử dụng Tất cá thể mặt đƣợc dùng để tự thụ cho gen Sub1 đồng hợp tử BC3F2, đồng thời tiếp tục lai tạo quần thể BC4F1

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

1/ Khảo sát đa hình hai giống bố mẹ AS996xIR64Sub1 thu đƣợc 53 thị đa hình tổng số 372 thị Xác định đƣợc 11 cá thể mang gen Sub1 từ 22 cá thể F1 từ tổ hợp lai AS996 x IR64Sub1

2/ Kết sàng lọc 497 cá thể BC1F1 thu đƣợc 165 cá thể mang gen Sub1, từ đó chọn lọc đƣợc 14 cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 chứa tối đa gen giống nhận gen từ 62,5%- 87,50% Trong đó, cá thể có gen giống nhận gen cao nhất P422 với 87,50%

3/ Kết sàng lọc 506 cá thể BC2F1 thu đƣợc 245 cá thể mang gen Sub1, xác định đƣợc 17 cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 hai số 17 cá thể chứa gen giống nhận gen cao nhất là cá thể P442 -11 P442 -14 đạt 93,75 %

4/ Kết sàng lọc 445 cá thể BC3F1 thu đƣợc 124 cá thể mang gen Sub1 có 22 cá thể tái tổ hợp Dịng BC3F1 có di truyền nhận gen cao P422-14-177 với 100% alen từ AS996 tổng số 53 thị phân tích

Kiến nghị

References

Tài liệu tiếng Việt

1 Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T., Bùi Chí Bửu Bùi Bá Bổng (2001), Chọn giống nhờ Marker Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, tr 44 - 58 Bộ Tài ngun Mơi trường (2009), ―Chương trình mục tiêu quốc gia ứng phó với

biến đổi khí hậu‖ Kịch biến đổi khí hậu, nước biển dâng cho Việt Nam, Hà Nội tháng năm 2009

3 Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn (2009), Quy hoạch sử dụng đất lúa cho từng vùng nước

4 Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nơng thơn (2010), Số liệu ước tính USDA

5 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2000), Những nguyên tắc chọn giống trồng, Di truyền phân tử I, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh

6 Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại môi trường lúa, Nxb Nông nghiệp TPHCM

7 Lưu Minh Cúc, Nguyễn Thị Kim Liên, Vũ Thị Thu Hằng, Nguyễn Quang Đàm, Phạm Thị Minh Hiền, Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang (2010) ―Khảo sát đa dạng di truyền số giống lúa nếp thị phân tử SSR‖ Tạp chí khoa học cơng nghệ nông nghiệp Việt Nam số (19), trang 2-6

8 Nguyễn Văn Cường, Tổng quan BĐKH tác động chúng đến hoạt động người, Viện Nghiên cứu Đào tạo Phát triển Công nghệ

9 Trịnh Đình Đạt (2006), Cơng nghệ sinh học tập 4, Nxb Giáo dục

10 Nguyễn Thị Lan Hoa, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thanh Quân, Phạm Thị Hoa, Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Thị Tân Phương, Trịnh Minh Hợp, Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Thị Thanh Thủy (2009), ―Phân tích xác định thị phân tử đa hình phục vụ lập đồ nhóm liên kết genome xác định vị trí gen kháng bệnh xanh lùn cỏ (Gossypium arboreum L.)‖, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Việt Nam, (1), tr 69-74

20

12 Lê Thị Ánh Hồng (2002), Bệnh học phân tử thực vật, Nxb Nông nghiệp

13 Hội thảo Biến đổi Khí hậu, Kịch biến đổi khí hậu nước biển dâng cho việt nam, Hội An, 31/7/2009 phần II

14 Lưu Thị Ngọc Huyền (2003), Nghiên cứu lập đồ gen kháng rầy nâu giống lúa CR203 ứng dụng chọn giống, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam

15 Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang, Lưu Minh Cúc, Phạm Thị Minh Hiền, Vũ Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Trang, Đinh Văn Thành (2010), ―Chỉ thị phân tử trợ giúp chọn giống lúa kháng rầy nâu‖ Tạp chí khoa học cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam số (19), trang 11-17

16 Nguyễn Thị Lang (2002), Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học, Nxb Nông nghiệp, TPHCM

17 Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu (2004), ―Ứng dụng marker phân tử đánh dấu gen mùi thơm lúa‖, Di truyền học Ứng dụng (2)

18 Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gen chọn giống trồng. Anh tuấn

19 Lã Tuấn Nghĩa (2011), chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ơn có suất chất lượng cao thị phân tử, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, 2+3/2011

20 Nguyễn Đức Ngữ, ―Biến đổi khí hậu khơ hạn, hoang mạc hóa‖ Báo cáo Hội thảo BĐKH toàn cầu giải pháp ứng phó Việt Nam, Hà Nội, 26-29/2/2008 21 Nguyễn Kỳ Phùng, Bùi Chí Nam, Đánh giá tác động nước dâng biến đổi khí hậu

đến dải ven biển tỉnh khánh hòa, Hội ĐTM Việt Nam Phân viện Khí tượng Thủy văn Mơi trường phía nam

22 Susmita Dasgupt, Benoit Laplante, Craig Meisner, David Wheeler, Jianping Yan (2007),Ảnh hưởng mực nước biển dâng cao nước phát triển Phân tích so sánh, Bài nghiên cứu Chính sách Ngân hàng Thế giới 4136 tháng năm 2007

24 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Bài giảng công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, Viện Sinh học Nông nghiệp, tr 61

25 Lê Anh Tuấn (2009), Tổng quan nghiên cứu biến đổi khí hậu hoạt động thích ứng miền Nam Việt Nam, Viện Nghiên cứu Biến đổi Khí hậu – Trường Đại học Cần Thơ

Tài liệu tiếng Anh

26 Abdelbagi M Ismail, Evangelina S Ella, Georgina V Vergara and David J Mackill (2009), Mechanisms associated with tolerance to flooding during germination and early seedling growth in rice (Oryza sativa), Annals of Botany 103: 197–209 27 Armour J.A L and Jeffreys A J (1992) ―Biology and application of human

minisatellite loci‖ Curr Opin Genet Dev 2, pp 850 - 856

28 Bert Collard and David Mackill (2005), Marker assisted breeding for rice improvement, MAB lecture of plant breeding genitics and Biotechnology division, IRRI

29 Botstein D., White R.L., Skolnick.M and Davis R.W (1980) ―Construc tion of a genetic linkage mapin man using restriction fragement length polymorphisms‖ Amer J Hum Genet 32, pp 314 - 331

30 Caldo, RA and Sebastian, LS (1998), ―Molecular diversity of philippine improved rice varieties and their progenitors using RAPD and SSR markers‖, Agricultural biotechnology, 72, pp 79 - 81

31.Chang TT, JT Armenta-Soto, CX Mao, R Peiris, and C Loresto (1985), ―Genetic studies on the components o drought resistance in rice (Oryza sativa L.)‖, Paper presented at the ins Rice Genetics symposium, 27-3 May 1985 IRRI Los Banos, Philippines

22

33 Chen X M., Line R F., Leung H (1998), "Genome scanning for resistance gene analogs in rice, barley and wheat by high- resolution electrophoresis", Theor Appl Genet., 97, pp 345-355

34 C N Neeraja, R Maghirang-Rodriguez, A Pamplona, S Heuer, B C Y Collard E M Septiningsih, G Vergara, D Sanchez, K Xu, A M Ismail, D J Mackill (2007), ―A marker-assisted backcross approach for developing submergence-tolerant rice cultivars‖, Theor Appl Genet (2007) 115:767–776

35 Choudhury MA (1975), ―Genetics and breeding of deepwater rice‖, In Proceeding of the Int Seminaron deepwater rice 197, Bang ladesh pp 83-86

36 Church, J.A., Gregory, J.M., Huybrechts, P., Kuhn, M., Lambeck, K., Nhuan, M.T., Qin, D., Woodworth, P.L., (2001) ―Changes in sea level‖ In: Houghton, J.T., Ding, Y., Griggs, D.J., Noguer, M., van der Linden, P.J., Xiaosu, D (eds.), Climate Change 2001, The Scientific Basis Cambridge University Press, Cambridge, pp 639-693

37 Collard BCY and Mackill DJ (2008), ―Marker assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century‖ Phil Trans Roy Soc Lond B Biol Sci 363: 557—572

38 Collard B.C.Y, Vera-Cruz C.M., McNally K.L., Virk P.S., and Mackill D.J (2008), ―Rice Molecular Breeding Laboratories in the Genomics Era: Current Status and Future Considerations‖ Internat J Plant Genomics, vol 2008, article ID 524847, pp.25

39 Cruz, R.V., H Harasawa, M Lal, S Wu, Y Anokhin, B Punsalmaa, Y Honda, M Jafari, C Li and N Huu Ninh (2007) Asia Climate Change 2007: Impacts, Adaptation and Vulnerabilit, Contribution of Working Group II to the Fourth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change, M.L Parry, O.F Canziani, J.P Palutikof, P.J van der Linden and C.E Hanson, Eds., Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp.469-506

41 Emes MJ, CP Wilkins, PA Smith, K Kurkanchanakul, K Hawker, WA Charlton, EG Cutter (1988), ―Starch utilization by deep water rice during submergence‖, In; Proceedings of the 1987 International DeepWater Rice Workshop, 20-30 Oct, Bangkok, Thailand IRRI, Philippines pp 319-326

42 Frisch M., Bohn M and Melchinger A.E (1999), ―Comparision of selection strategies for marker-assisted backcrossing of a gene‖, Crop Sci, 39, pp.1295-1301 43 Grant M R., et al (1995), ―Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual

specificity disease resistance‖, Science, 269: 843-846

44 Hamada H and Kakunaga T (1982), ―Potential Z-DNA forming sequences are highly dispersed in Human genome”, Natural 298:396 – 398

45 Haque QA, D HilleRisLambers, NM Tepora, QD de la Cruz (1989), ‗Inheritance of submergence tolerance in rice‖, Euphytica 41: 247-251

46 Hoanh, C.T., H Guttman, P Droogers and J.Aerts (2004), ―Will we produce sufficient food under climate change? Mekong Basin (South-east Asia)‖, Climate Change in Contrasting River Basins: Adaptation Strategies forWater, Food, and Environment, J.C.J.H Aerts and P Droogers, Eds., CABI Publishing,Wallingford, pp.157-180

47 IPCC (2007) The 4th assessement report of the Intergovernmental Panel on Climate Change http://en.wikipedia.org/wiki

48 Ishikawa R., Morishima H., Kinoshita T., Harada T and Nuzeki M (1991) ―Linkage analysis of nine Isozyme gens on the conventional linkage map in rice‖ Jpn J Breed 41, pp 265 - 272

49 Inouye J, and VT Xuan 1973 On the growth habits of floating single and double - Transplanting rice plants in South Vietnam I Mesocotyl elongation in darkness Ipn J Trop Agric 17 (2): 75 - 80

24

51 Jackson BR and BS Vergara (1979), ―Progress in deepwater rice research in proceeding of the 1978 int‖, deepwater rice workshop, Aug 17-19, 1978, Calentta, India, pp – 12

52 Jena S, Sahoo P, Mohanty S, Das AB (2004 ) ―Identification of RAPD markers, in situ DNA content and structural chromosomal diversity in some legumes of the mangrove flora of Orissa‖, Genetica, 122; No 3; pp 217-226

53 Julia Bailey-Serres, Takeshi Fukao, Pamela Ronald, Abdelbagi Ismail, Sigrid Heuer, David Mackill (2010), Submergence Tolerant Rice: SUB1’s Journey from Landrace to Modern Cultivar, This article is published with open access at Springerlink.com

54 Kadam SS, J Singh, SL Mehta (1973), ―Changes in isoenzymes in embryo and endosperm of normal and opaque-2 Zea mays during inhibition‖, Phytochemistry 12: 1221-1225

55 K M Iftekharuddaula, M A Newaz, M A Salam, H U Ahmed, M A A Mahbub, E M Septiningsih, B C Y Collard, D L Sanchez, A M Pamplona, D J Mackill (2010), Rapid and high-precision marker assisted backcrossing to introgress the SUB1 QTL into BR11, the rainfed lowland rice mega variety of Bangladesh, Springer Science+Business Media B.V 2010

56 Krishnayya GR, RM De, SB Lodh (1990) ―Physiological basis for submergence tolerance in rice‖ Oryza 27:286-290

57 Lang NT (1999) ―QTL mapping for salt tolerance in rice Final report‖ Japan Fellowship

58 Mackill D J and Bonman J M (1992), "Inheritance of blast resistance in near- isogenic lines of rice", Phytopathol., 82, p p.746-749

59 Mazaredo AM and BS Vergara (1982), ―Physiological differences in rice varieties tolerant of and susceptible to complete submergence‖, In proceeding of the 1981 int deepwater rice workshop. IRRI, Los Banos Philippines pp 327-342

61 Ministry of Natural Resources and Environment (MONRE) (2009), Climate change, sea level rise scenarios for Vietnam, Hanoi, pp 34

62 Mishra SB (1995), Genetics of submergence tolerance and elongation ability of flood-prone rice Plant Breeding, Genetics and Biochemistry Division IRRI, Philippines pp.16

63 Mohanty HK, GS Khush (1985), ―Diallel analysis of submergence tolerance in rice, Oryza sativa‖, Theo Appl Genet70: 467-473

64 Mohanty HK, B Suprihatno, GS Khush, WR Coffman, and BS Vergara (1982) ―Inheritance of submergence tolerance in deepwater rice‖, In: Proceeding of the 1981 int deepwater rice workshop IRRI, Los Banos Philippines, pp.121-134 65 Mohan M, Nair S, Bhagwat A, Krishna TG, Yano M, Bhatia CR, Saki T (1997),

―Genom mapping, molecular markers and marker- assisted selection in crop plants‖, Molecular Breeding3: 87 - 103

66 Murty KG, KK Nanda (1974), ―Changes in peroxidase isoenzymes of Phaseolus mungo hypocotyl cutting rooting‖, Phytochemistry 13:1089-1093

67 Nandi S, PK Subudhi, D Senadhira, NL Manigbas, S sen-Mandi, N Huang (1997), ―Mapping QTLs for submergence tolerance in rice by AFLP analysis and selective genotyping‖ Mol Gen Genet, 255: 1-8

68 Napvi N I., Bonman J.M., Mackil D J., Nelson F J .and Chattoo B B (1995) ―Identification of RAPD markers linded to a major blast resistance gene in rice‖, Mol Breed. 1:341 – 348

69 Oka HI (1975), ―Floating rice, an ecotype adapted to deepwater paddies‖, Review from the viewpoint of breeding, pp 277-287 from rice in Asia National Institute of genetics Mishima, Japan

70 Rai RSV, KS Murty (1976), Effect of submergence on some physiological changes in rice seedlings, Ind J Exp Biol 14:369-370

26

72 Ramiah K, and K Ramaswami (1941), ―Floating habit in rice‖, Indian J Agric Sci 11: 1-8

73 S Abdolhamid Angaji , Endang M Septiningsih, D J Mackill, Abdelbagi M Ismail (2009), QTLs associated with tolerance of flood during germination in rice (Oryza sativa), Springer Science+Business Media B.V 2009

74 Saha Ray PK, D HilleRisLambers, NM Tepora (1993), ―Combination of stem elongation ability with submergence tolerance in rice‖ Euphytica 68:11-16

75 Saghai Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW (1984) ―Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location , and population dynamics‖, Proc Natl Acad Sci USA (81): 8014-8018

76 Sarkar RK, Panda D, Reddy JN, Patnaik SSC, Mackill DJ, Ismail AM (2009), ―Performance of submergence tolerant rice genotypes carrying the Sub1 QTL under stressed and non-stressed natural field conditions‖ Indian J Agric Sci. in press

77 Septiningsih EM., Pamplona AM., Sanchez DL., Maghirang-Rodriguez R, Neeraja CN, Vergara GV, Heuer S, Ismail AM, Mackill DJ (2009), Development of submergence-tolerant rice cultivars: The Sub1 gene and beyond, Ann Bot 103:151-160

78 Singh S, Mackill DJ, Ismail AM (2009), Responses of SUB1 rice introgression lines to submergence in the field: Yield and grain quality, Field Crops Res 113: 12–23 79 Setter TL, I Waters, H Greenway, BJ Atwell, T Kupkanchanakul (1987),

―Carbohydrates status of terrestrial plants during flooding In: Crawford RMM (Ed.)‖, Plant Life in Aquatic and Amphibious Habitats British Ecological Society Symposium, No Blackwell Scientific Publications, Oxford 411-433

81 Setter TL, E Ellis, EV Laureles, ES Ella, D Senadhira, SB Mishra, S Sarkarung, S Datta (1997), Physiology and genetics of submergence tolerance in rice, Annals of Botany 79:67-77

82 Sripongpankul K (1998), Gene mapping andquantitative trait loci analysis of flood tolerance in rice (Oryza sativaL.) PhD Thesis University of The Philippines, Los Banos (UPLP), IRRI, Philippines,pp 137

83 Suprihatno B, WR Coffman (1981), ―Inheritance of submergence tolerance in rice (Oryza sativa L.)‖, SABRAO 13, pp.98-108

84 Takeshi Fukao and Julia Bailey-Serres (2008), Submergence tolerance conferred by Sub1A is mediated by SLR1 and SLRL1 restriction of gibberellin responses in rice, Department of Botany and Plant Sciences, Center for Plant Cell Biology, University of California, Riverside, CA 92521, This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/

0807821105/DCSupplemental

85 Takeshi Fukao, Kenong Xu, Pamela C Ronald, and Julia Bailey-Serresa (2006), ―A Variable Cluster of Ethylene Response Factor–Like Ge Regulates Metabolic and Developmental Acclimation Responses to Submergence in Rice‖, The Plant Cell, Vol 18, 2021–2034

86 Thach TD (1994) The genetic association between elongation ability and submergence tolerance in rice (Oryzsativa L.,. MSc Thesis, Central Luzon State University, Nueva Ecija, Philippines pp.65

87 Thomson M.J., Ismail A.M., McCouch S.R., Mackill D.J (2009), ―Abiotic Stress Adaptation in Plants: Physiological, Molecular and Genomic Foundation‖, Marker Assisted Breeding Chapter 20 Springer Science & Business Media: 451-469 88 Thomson MJ, Marjorie DO, James E, Rahman MA, Sajise AG, Adorada AL, Raiz

ET, Blumwald E, Seraj ZI, Singh RK, Gregorio GB & Ismail MA (2010),

Characterizing the Saltol Quantitative Trait Locus for Salinity Tolerance in Rice

28

89 Van Berloo R (2008), GGT 2.0: versatile software for visualization and analysis of genetic data,. J Hered 99:232–236

90 Wang Z., Second G and Tanksley S.D (1992), ―Polymorphism and phylogenetic relationship among species in the Genus Oryza as determined by analysis of nuclear RFLPs‖ Theor Appl Genet 83, pp 565 - 581

91 Williams J.G, et al (1990), "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic marker", Nucleic Acid Research, 18, 6531-6535

92 Wassmann, R., Hien, N X., Hoanh, C T., and Tuong, T P (2004), ―Sea level rise affecting the Vietnamese Mekong Delta: Water elevation in the flood season and implications for rice production‖, Climatic Change. 66, 89-107

93 Wu K.S and Tanksley S.D (1993), ―Abuudance, polymorphism and genetic mapping of microsatellite in rice‖ Mol Gen Genet 241, pp 225 - 235

94 Xu K, DJ Mackill (1995), ―RADP and RFLP mapping of a submergence tolerance locus in rice‖, Rice Genetics Newsletter 12: 244-245

95 Xu K, Xu X, Fukao T, Canlas P, Maghirang-Rodriguez R, Heuer S, Ismail AM, Bailey-Serres J, Ronald RC, Mackill DJ 2006 Sub1A is an ethylene-response-factor-like gene that confers submergence tolerance to rice Nature 442:705-708 96 Yamada N (1959), Physiological basis of resistance of rice plant against overhead

flooding, [in Japanese, English summary] Bull, National Institute Agricultural Science Ser No 9: pp.110

97 www.combatclimatechange.ie 98 http://www.nature.com 99 http://www Nongthon.com.vn 100 www.gramene.org

http://en.wikipedia.org/wiki Jena S, Sahoo P, Mohanty S, Das AB www.gramene.org http://www.ricegenetics.com www.philrice.gov.ph