Luận văn tốt nghiệp thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất amlodipin besilate trong viên nang apitim 5

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MƠN HĨA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT AMLODIPIN BESILATE TRONG VIÊN NANG APITIM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Cán hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Diệp Chi Sinh viên thực hiện: Võ Mĩ Trinh MSSV:2072115 Chuyên ngành: Hóa học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Năm học 2010 - 2011 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT AMLODIPIN BESILATE TRONG VIÊN NANG APITIM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Lời cam đoan Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Võ Mĩ Trinh Luận văn đại học ngành Hóa học Chuyên ngành: Hóa Học Mã số: 204 Đã bảo vệ đƣợc duyệt Hiệu trƣởng:……………………………… Trƣởng khoa:……………………………… Trƣởng chuyên ngành Cán hƣớng dẫn …………………………… ……………………………… i LỜI CẢM ƠN  Trong suốt quãng thời gian học tập rèn luyện giảng đƣờng Đại học Cần Thơ, đƣợc học hỏi nhiều kiến thức rèn giũa kinh nghiệm, kỹ vô quý báu Và trình thực luận văn giúp tơi có kiến thức chun mơn, kỹ bổ ích thiết thực cho công việc sau Để đạt đƣợc kết trên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:  Quý thầy, cô trƣờng Đại học Cần Thơ nói chung Bộ mơn Hóa, khoa Khoa Học Tự Nhiên nói riêng – thầy, tận tình truyền đạt cho tơi kiến thức q báu bổ ích  Cơ Nguyễn Thị Diệp Chi - giảng viên hƣớng dẫn tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp, cô giúp đỡ, bảo thời gian thực đề tài luận văn  Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban TGĐ công ty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang tạo điều kiện cho thực đề tài  Cô Nguyễn Ngọc Diệp, Nguyễn Thanh Tùng anh chị phịng Kiểm Nghiệm cơng ty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang tạo điều kiện tốt hết lịng giúp đỡ tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp  Cô Lê Thị Bạch - cố vấn học tập, dạy dỗ truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện để thực hoàn thành luận văn  Cha, mẹ - ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng tất ngƣời thân - tạo điều kiện thuận lợi vật chất tinh thần để yên tâm học tập đến ngày  Cuối cùng, xin cảm ơn ngƣời bạn, tập thể lớp Hóa Học – K33, động viên, khích lệ giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Sinh viên thực Võ Mĩ Trinh ii TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập - Tự - Hạnh phúc BỘ MƠN HĨA HỌC - - NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN Cán hƣớng dẫn: Ths NGUYỄN THỊ DIỆP CHI Đề tài: THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT AMLODIPIN BESILAT TRONG VIÊN NANG APITIM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Sinh viên thực hiện: VÕ MĨ TRINH - MSSV: 2072115 Lớp: Cử nhân Hóa Học - Khóa 33 Nội dung nhận xét: a Nhận xét hình thức LVTN: b Nhận xét nội dung LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (Ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Cán hƣớng dẫn iii TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc - - BỘ MƠN HĨA HỌC NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1 Cán phản biện 1: Đề tài: THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT AMLODIPIN BESILAT TRONG VIÊN NANG APITIM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Sinh viên thực hiện: VÕ MĨ TRINH MSSV: 2072115 Lớp: Cử nhân Hóa Học - Khóa 33 Nội dung nhận xét: a Nhận xét hình thức LVTN: b Nhận xét nội dung LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (Ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Cán phản biện iv TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - BỘ MƠN HĨA HỌC NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN Cán phản biện 2: Đề tài: THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT AMLODIPIN BESILAT TRONG VIÊN NANG APITIM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP Sinh viên thực hiện: VÕ MĨ TRINH MSSV: 2072115 Lớp: Cử nhân Hóa Học - Khóa 33 Nội dung nhận xét: a Nhận xét hình thức LVTN: b Nhận xét nội dung LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):  Đánh giá nội dung thực đề tài:  Những vấn đề hạn chế: c Nhận xét sinh viên tham gia thực đề tài (Ghi rõ nội dung sinh viên chịu trách nhiệm thực có): d Kết luận, đề nghị điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Cán phản biện v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Phân loại tăng huyết áp (1) Bảng 2.2: Phân loại tăng huyết áp (2) Bảng 2.3: Hiệu việc thay đổi lối sống điều trị tăng huyết áp Bảng 4.1: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn Amlodiopin (HPLC) .29 Bảng 4.2: Chuẩn bị mẫu khảo sát tính tuyến tính Amlodipin (HPLC) .30 Bảng 4.3: Kết khảo sát tính tuyế n tính Amlodipin (HPLC) 31 Bảng 4.4: Khảo sát giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp 32 Bảng 4.5: Kết khảo sát tính đặc hiệu Amlodipin (HPLC) .33 Bảng 4.6: Kế t quả khảo sát độ lặp lại (độ xác) Amlodipin (HPLC) 35 Bảng 4.7: Chuẩn bị mẫu khảo sát độ 36 Bảng 4.8: Kế t quả khảo sát độ (độ phục hồi) Amlodipin (HPLC) .37 Bảng 4.9: Thời gian lƣu Amlodipin besilat Apitim so với chuẩn 39 Bảng 4.10: Kết hàm lƣợng Amlodipin Apitim lô 40 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Cơng thức cấu tạo dạng phẳng Amlodipin besilat Hình 2.2: Công thức cấu tạo dạng không gian Hình 2.3: Một số dạng thuốc chứa hoạt chất Amlodipin 12 Hình 2.4 : Sơ đồ máy HPLC 14 Hình 2.5: Đồ thị phƣơng pháp ngoại chuẩn 17 Hình 2.6: Đồ thị phƣơng pháp nội chuẩn 18 Hình 3.1: Máy HPLC Merck Hitachi 25 Hình 3.2: Cân điện tử AB204-S Mettler Toledo 25 Hình 3.3: Bể siêu âm hòa tan Branson 26 Hình 3.4: Pipet xác 10 ml bình định mức 100 ml, 50 ml .26 Hình 3.5:Viên nang Apitim 27 Hình 3.6: Chất chuẩn Amlodipin besilat .27 Hình 4.1: Đƣờng tuyến tính phƣơng trình hồi quy Amlodipin (HPLC) 31 Hình 4.2: Sắc ký đồ mẫu trắng khảo sát tính đặc hiệu (HPLC) 32 Hình 4.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Amlodipin khảo sát tính đặc hiệu (HPLC) 32 Hình 4.4: Sắc ký đồ mẫu thử Amlodipin khảo sát tính đặc hiệu (HPLC) 33 Hình 4.5: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Amlodipin khảo sát độ lặp lại (HPLC) 35 Hình 4.6: Sắc ký đồ mẫu thử Amlodipin khảo sát độ lặp lại (HPLC) 35 vii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ii Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Chƣơng ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH TĂNG HUYẾT ÁP 2.1.1 Tăng huyết áp[3] 2.1.1.1 Khái niệm huyết áp 2.1.1.2 Khái niệm tăng huyết áp .2 2.1.2 Nguyên nhân tăng huyết áp [3] 2.1.2.1 Tăng huyết áp vô 2.1.2.2 Tăng huyết áp thứ phát 2.1.3 Triệu chứng tăng huyết áp[3] 2.1.4 Cơ chế hình thành tăng huyết áp[3] 2.1.5 Biến chứng bệnh tăng huyết áp[3] 2.1.6 Điều trị bệnh tăng huyết áp[4] 2.1.6.1 Mục tiêu điều trị 2.1.6.2 Cách điều trị bệnh tăng huyết áp 2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AMLODIPIN BESILAT 2.2.1 Tính chất, cơng thức danh pháp[1] 2.2.1.1 Tính chất amlodipin besilat 2.2.1.2 Công thức danh pháp 2.2.2 Dƣợc lý, chế tác dụng, dƣợc động học[2] 10 2.2.2.1 Dƣợc lý, chế tác dụng 10 2.2.2.2 Dƣợc động học 11 2.2.3 Chỉ định chống định 11 2.2.3.1 Chỉ định 11 2.2.3.1 Chống định 11 2.2.4 Liều lƣợng 11 2.2.5 Tƣơng tác thuốc 12 2.2.6 Một số dạng thuốc chứa hoạt chất Amlodipin besilat thị trƣờng [9],[10],[11] 12 2.3 PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC) [1],[6],[7] 13 2.3.1 Nguyên tắc,cấu tạo máy sắc ký lỏng cao áp 13 2.3.2 Các yếu tố thông số đặc trƣng máy sắc ký lỏng cao áp 13 2.3.2.1 Các yếu tố sắc ký lỏng cao áp 14 2.3.2.2 Các thông số đặc trƣng sắc ký lỏng cao áp 15 2.3.3 Định tính định lƣợng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp 15 2.3.3.1 Định tính 15 2.3.3.2 Định lƣợng 16 2.3.4 Ứng dụng sắc ký lỏng cao áp 19 2.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH [8] 20 2.4.1 Tầm quan trọng việc thẩm định 20 2.4.2 Nội dung thẩm định 20 2.4.2.1 Tính tuyến tính (linearity) 21 2.4.2.2 Tính đặc hiệu (specificity) 22 2.4.2.3 Độ lặp lại (repeatability) 22 2.4.2.4 Độ (accuracy) 23 2.4.2.5 Giới hạn phát (LOD) (limit of detection) 24 2.4.2.6 Giới hạn định lƣợng (LOQ) (limit of quantition) .24 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN 25 3.1.1 Địa điểm thực 25 3.1.2 Thời gian thực 25 3.2 PHƢƠNG TIỆN THỰC HIỆN 25 3.2.1 Thiết bị dụng cụ 25 3.2.2 Chuẩn bị hóa chất, dung môi 26 3.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 26 3.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.5 HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM 28 3.5.1 Thẩm định quy trình định lƣợng Amlodipin besilat HPLC .28 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 Sau máy chạy ổn định, tiêm lặp lại lần liên tiếp nồng độ vào máy sắc ký 4.2.3 Kết Bảng 4.3: Kết khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ Amlodipin X (Nồng (g/ml) Y2(DT YTB(DT Peak 1) Peak 2) Peak TB) 20 2664165 2676386 2670275,5 30 3989615 4006645 3998130,0 40 5356498 5336520 5346509,0 50 6713621 6698912 6706266,5 60 8162556 8189036 8175796,0 70 9476386 9342337 9409361,5 TUYẾN TÍNH AMLODIPIN Y (Diện tích peak) độ) Y1(DT 10000000.0 y = 135966x - 67425 R2 = 0.9997 8000000.0 6000000.0 4000000.0 2000000.0 0.0 20 40 60 80 x Nồng độ (mcg/ml) Khảo sát tính tuyến tính nồng độ X (g/ml) diện tích Hình 4.1:Đƣờng tuyến tính phƣơng trình hồi quy Amlodipin peak trung bình YTB  Nhận xét: Trắc nghiệm thống kê:[5] Trắc nghiệm t (phân phối Student): tα = TINV(0.05,1) = 12,7062 > to = - 1,13458219 tα = TINV(0.05,4) = 2,776 < to = 110,1236538 Vậy hệ số (bo= - 67425) hay tung độ gốc ý nghĩa, hệ số (b = 135966) hay độ dốc có ý nghĩa Trắc nghiệm F (phân phối Fischer): Fα = FINV(0.05,1,4) = 7,7086 < F = 12127,21913 Phƣơng trình hồi quy tƣơng thích Và R= R = 0,99985 Vậy khoảng nồng độ: 20 – 70 g/mL nồng độ X diện tích peak Y hồn tồn tuyến tính *Giới hạn phát giới hạn định lượng Amlodipin: Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính Y = 135966x – 67425, tính đƣợc giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp theo bảng 4.4 SVTH: Võ Mĩ Trinh 31 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 Bảng 4.4: Khảo sát giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp Phƣơng trình hồi quy Giới hạn phát Giới hạn định lƣợng LOD=3,3*độ lệch chuẩn/độ dốc LOQ=10*độ lệch chuẩn/độ dốc =3,3*51649,90336/135966 Y= 135966x - 67425 = 1,254 (g/mL) =10*51649,90336/135966 = 3,799 (g/mL) (*) Độ lệch chuẩn = Standard Error (Phụ lục 4) 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đặc hiệu Amlodipin phƣơng pháp HPLC 4.3.1 Mục đích Xác định xác đặc hiệu chất cần phân tích (Amlodipin) khơng ảnh hƣởng có mặt chất khác có mẫu thử 4.3.2 Thực Chuẩn bị mẫu chuẩn Amlodipin besilat, mẫu thử, mẫu trắng Triển khai mẫu sắc ký lỏng hiệu cao theo điều kiện chọn Quan sát sắc ký đồ nhận xét 75 75 75 75 50 50 50 50 10 12 14 Minutes 25 0 25 9.383 25 1.707 25 10 12 14 Minutes Hình 4.2: Sắc ký đồ mẫu trắng khảo sát Hình 4.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Amlodipin tính đặc hiệu (HPLC) khảo sát tính đặc hiệu (HPLC) SVTH: Võ Mĩ Trinh 32 mAU 100 Amlodipin Besilat 100 mAU 100 mAU 100 1.713 mAU 4.3.3 Kết 100 75 75 50 50 Amlodipin Besilat 100 25 9.280 25 0 mAU Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 1.710 mAU GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi 10 12 14 Minutes Hình 4.4: Sắc ký đồ mẫu thử Amlodipin khảo sát tính đặc hiệu (HPLC) Bảng 4.5: Kết khảo sát tính đặc hiệu Amlodipin Mẫu STT Lƣợng cân (mg) Hàm lƣợng TR (phút) S Amlodipin (%) Mẫu trắng 914,0 0 Thử đặc hiệu 948,5 9,280 6858390 102,0 69,5 9,383 6697414 100,0 Chuẩn đặc hiệu H%=100% - 102   100% = 102  Nhận xét: Từ kết hình 4.2, hình 4.3, hình 4.4 bảng 4.5 cho thấy mẫu trắng khơng có peak xuất thời gian lƣu mẫu thử chuẩn H% = Nhƣ vậy, phƣơng pháp có tính đặc hiệu 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát độ lặp lại Amlodipin phƣơng pháp HPLC 4.4.1 Mục đích Xác định giá trị độ lệch chuẩn tƣơng đối phƣơng pháp (RSD ≤ 2%) SVTH: Võ Mĩ Trinh 33 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 4.4.2 Thực  Dung dịch chuẩn: - Cân khoảng 69 mg (cân thực 69,5 mg) Amlodipin besilat chuẩn, cho vào bình định mức 100 mL, hịa tan thêm vừa đủ pha động (dung dịch 1) - Hút xác mL dung dich vào bình định mức 50 mL, thêm pha động vừa đủ Lọc qua giấy lọc 0,45µm, đƣợc dung dịch chuẩn (dung dịch 2)  Dung dịch thử: (Cân chế phẩm mẫu thử) Cân xác khoảng lƣợng bột viên tƣơng ứng với 25 mg Amlodipin cho vào bình định mức 100 mL Thêm khoảng 60 mL dung dịch pha động, lắc kỹ cho vào bể siêu âm khoảng phút, sau cho thêm pha động vừa đủ, lắc Lọc bỏ 30 mL dịch lọc đầu Hút xác 10 mL dung dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, thêm pha động vừa đủ, lắc Lọc qua giấy lọc 0,45 μm Tiến hành chạy mẫu: Sau máy chạy ổn định, tiêm mẫu chuẩn mẫu thử vào máy sắc ký tính tốn kết theo cơng thức: Hàm lƣợng phần trăm (%) hoạt chất viên đƣợc tính theo cơng thức: X (%)= Rt a P 408,9 100   C%    Rc m 567,1 Trong đó: Rt: Diện tích peak Amlodipin besilat có sắc ký đồ dung dịch thử Rc: Diện tích peak Amlodipin besilat có sắc ký đồ dung dịch chuẩn a: Lƣợng cân chuẩn Amlodipin besilat (mg) C%: Hàm lƣợng phần trăm chuẩn Amlodipin besilat (%) P: Khối lƣợng trung bình bột thuốc nang (mg) m: Lƣợng cân mẫu thử (mg) 408,9 : Phân tử lƣợng Amlodipin 567,1: Phân tử lƣợng Amlodipin besilat 4.4.3 Kết SVTH: Võ Mĩ Trinh 34 75 75 75 75 50 50 50 50 10 12 25 0 14 25 8.957 8.953 25 1.703 25 Amlodipin Besilat 100 mAU mAU 100 Amlodipin Besilat 100 10 12 14 Minutes Minutes Hình 4.5: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Amlodipin Hình 4.6: Sắc ký đồ mẫu thử Amlodipin khảo sát độ lặp lại (HPLC) khảo sát độ lặp lại (HPLC) Bảng 4.6: Kế t quả khảo sát độ lặp lại (độ xác) Amlodipin Lƣợng Mẫu cân STB (mg) Chuẩn KLTB Hàm viên lƣợng (mg) (%) (Xi – X)2 69,5 Xử lý kết Qtn 1= 0,08 6915703,8 99,4 Chuẩn 69,5 Thử 948,6 6858607 98,7 0,25 Qlt= 0,56 Thử 948,8 6950504 98,8 0,16 SD = 0,488 Qtn 2= 0,46 189,6 Thử 948,2 6865634 98,9 0,09 RSD (%) =0,492 Thử 948,4 6879289 99,1 0,01 e %= ± 0,512 Thử 948,3 6899031 99,4 0,04 XTB = 99,2 (%) Thử 948,5 6865379 100 0,64 µ = 99,2 ± 0,512% Trong đó: XTB: giá trị trung bình lần thử nghiệm SD: độ lệch chuẩn RSD: độ lệch chuẩn tƣơng đối e: giới hạn tin cậy µ: khoảng giới hạn SVTH: Võ Mĩ Trinh 35 mAU Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 100 1.703 mAU GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33  Nhận xét: Độ lệch chuẩn tƣơng đối Amlodipin RSD = 0,492% < 2% Vậy phƣơng pháp đạt độ lặp lại (độ xác) 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát độ Amlodipin phƣơng pháp HPLC 4.5.1 Mục đích - Khảo sát độ (độ phục hồi) chuẩn Amlodipin besilat cho vào mẫu thử (chế phẩm) mức: 80%, 100%, 120%, so với nồng độ Amlodipin besilat có sẵn mẫu thử (chế phẩm) - Tính tỷ lệ phục hồi % nồng độ 4.5.2 Thực  Dung dịch chuẩn gốc: Cân khoảng 69 mg (cân thực 69,4 mg) Amlodipin besilat chuẩn, cho vào bình định mức 100 mL, hòa tan thêm vừa đủ pha động đƣợc dung dịch chuẩn gốc  Dung dịch chuẩn: Hút xác mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm pha động vừa đủ Lọc qua giấy lọc 0,45µm, đƣợc dung dịch chuẩn  Dung dịch thử gốc: Cân xác khoảng lƣợng bột viên tƣơng ứng với 25 mg Amlodipin (thực cân 948,4 mg) cho vào bình định mức 100 mL Thêm khoảng 60 mL dung dịch pha động, lắc kỹ cho vào bể siêu âm khoảng phút, sau cho thêm pha động vừa đủ, lắc đƣợc dung dịch thử gốc Chuẩn bị mẫu khảo sát độ theo bảng 4.7 sau đây: Bảng 4.7: Chuẩn bị mẫu khảo sát độ Các mức độ Mức 80% Mức 100% Mức 120% Dung dịch thử gốc (ml) 10 10 10 Dung dịch chuẩn gốc (ml) 100 100 100 Thêm pha động đến vạch (ml) SVTH: Võ Mĩ Trinh 36 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 Tiến hành chạy mẫu: sau máy chạy ổn định, tiêm mẫu dung dịch chuẩn, dung dịch độ 80%, 100%, 120% vào máy sắc ký 4.5.3 Kết Bảng 4.8: Kế t quả khảo sát độ (độ phục hồi) Amlodipin Lƣợng cân Mẫu (mg) Chuẩn 69,4 6956365 Chuẩn 69,4 6937960 Trung bình Tổng lƣợng tìm thấy Lƣợng Tỉ lệ (%) Hàm lƣợng chuẩn S (%) 99,4 6947162,5 Lƣợng có sẵn Lƣợng thêm vào Lƣợng Lƣợng Lƣợng Lƣợng Lƣợng tổng tìm cân hoạt cân hoạt thấy (mu) chất (ms) chất (mg) (mg) (mg) (mg) (mg) 6244454 4,4690 948,4 2,4810 69,4 1,9996 1,9880 99,4 6241124 4,4666 948,4 2,4810 69,4 1,9996 1,9856 99,3 6251269 4,4738 948,4 2,4810 69,4 1,9996 1,9928 99,7 S 80% TB 4,4698 mu/100ml.Hút ms/100ml.Hút 10ml /100ml 4ml/ 100ml tìm lại (mg) 1,9888 Độ (%) 99,5 7008249 5,0156 948,4 2,4810 69,4 2,4994 2,5346 101,4 7000416 5,0100 948,4 2,4810 69,4 2,4994 2,5290 101,2 7006662 5,0145 948,4 2,4810 69,4 2,4994 2,5335 101,4 100% TB 5,0133 mu/100ml.Hút ms/100ml.Hút 10ml/100ml 5ml/100ml 2,5323 101,3 7704294 5,5137 948,4 2,4810 69,4 2,9993 3,0327 101,1 7709018 5,5171 948,4 2,4810 69,4 2,9993 3,0361 101,2 7678546 5,4953 948,4 2,4810 69,4 2,9993 3,0143 100,5 120% TB SVTH: Võ Mĩ Trinh 5,5087 mu/100ml.Hút ms/100ml.Hút 10ml/100ml 6ml/100ml 3,0277 100,9 37 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33  Nhận xét: Độ trung bình ĐTB= 99,5%  101,3%  100,9%  100,6% Tỉ lệ phục hồi thực nghiệm là: 99,5% (ở mức 80%), 101,3% (ở mức 100%), 100,9% (ở mức 120%) ĐTB = 100,6%, nằm giới hạn cho phép tỉ lệ phục hồi lý thuyết (98% - 102%) Vậy phƣơng pháp đạt độ 4.6 Thí nghiệm 6: Áp dụng phƣơng pháp để định lƣợng Amlodipin viên nang Apitim lô Cty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang sản xuất 4.6.1 Mục đích Xác định hàm lƣợng Amlodipin có viên nang Apitim 5mg 4.6.2 Thực Cân 20 viên, đổ bột ra, lau nang Cân 20 nang rỗng, xác định khối lƣợng trung bình bột thuốc nang, nghiền thành bột mịn Pha dung dịch thử: Cân xác khoảng lƣợng bột viên tƣơng ứng với 25 mg (cân viên) Amlodipin cho vào bình định mức 100 mL Thêm khoảng 60 mL dung dịch pha động, lắc kỹ cho vào bể siêu âm khoảng phút, sau cho thêm pha động vừa đủ, lắc Lọc bỏ 30 mL dịch lọc đầu Hút xác 10 mL dung dịch cho vào bình định mức 50 mL, thêm dung dịch pha động vừa đủ, lắc Lọc qua màng lọc Milipore 0,45 μm Pha dung dịch chuẩn: Cân khoảng 69 mg (cân thực 69,1 mg) Amlodipin besilat dùng làm chuẩn cho vào bình định mức 100 mL Thêm khoảng 60 mL dung dịch pha động, lắc kỹ cho vào bể siêu âm khoảng phút, sau cho thêm pha động vừa đủ, lắc Hút xác mL dung dịch cho vào bình định mức 50 mL, thêm dung dịch pha động vừa đủ, lắc Lọc qua màng lọc Milipore 0,45 μm Tiến hành: Điều kiện sắc ký: - Tiến hành máy sắc ký HPLC: Merck Hitachi - Cột Lichrospher RP18e (25 cm x mm ID, μm) - Pha động: Acetonitril – Methanol – Dung dịch pH 3,0 ( 15 : 35: 50) - Detector UV - Vis: 237 nm - Tốc độ dịng: ml/phút - Thể tích bơm: 20 μl SVTH: Võ Mĩ Trinh 38 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 Triển khai hệ thống sắc ký chạy ổn định, lần lƣợt tiêm dung dịch chuẩn thử vào máy Hàm lƣợng phần trăm (%) hoạt chất viên đƣợc tính theo cơng thức: X (%)= Rt a P 408,9 100   C%    Rc m 567,1 Trong đó: Rt: Diện tích peak Amlodipin besilat có sắc ký đồ dung dịch thử Rc: Diện tích peak Amlodipin besilat có sắc ký đồ dung dịch chuẩn a: Lƣợng cân chuẩn Amlodipin besilat (mg) C%: Hàm lƣợng phần trăm chuẩn Amlodipin besilat (%) P: Khối lƣợng trung bình bột thuốc nang (mg) m: Lƣợng cân mẫu thử (mg) 408,9 : Phân tử lƣợng Amlodipin 567,1: Phân tử lƣợng Amlodipin besilat 4.6.3 Kết Định tính: Bảng 4.9: Thời gian lƣu Amlodipin besilat Apitim so với chuẩn Mẫu Số lô 041210 010111 030111 SVTH: Võ Mĩ Trinh Lƣợng cân (mg) TR (phút) Chuẩn 69,1 8,050 Chuẩn 69,1 8,040 Thử 954,5 8,033 Thử 953,8 8,033 Thử 953,8 8,030 Thử 953,6 8,037 Thử 944,2 8,020 Thử 944,8 8,027 Trung bình 8,045 8,033 8,034 8,023 39 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33  Nhận xét: Từ kết bảng 4.9 cho thấy thời gian lƣu mẫu thử lô tƣơng ứng với thời gian lƣu chuẩn Amlodipin besilat Vậy mẫu thử có chứa hoạt chất Amlodipin besilat Định lượng: Bảng 4.10: Kết hàm lƣợng Amlodipin Apitim lô Khối Lƣợng Số lô Mẫu cân S (mg) 041210 010111 030111 HL chuẩn viên TB (%) (mg) Chuẩn 69,1 7370816 Chuẩn 69,1 7409472 Trung bình lƣợng HL HLTB Amlodipin Amlodipin (%) (%) 99,4 7493629,5 Thử 954,5 7656138 Thử 953,8 7559469 Thử 953,8 7615562 Thử 953,6 7562710 Thử 944,2 7424916 Thử 944,8 7372423 190,8 190,6 188,8 102,56 101,34 101,95 101,34 101,30 99,49 98,73 101,32 99,11  Nhận xét: Từ kết bảng 4.10 cho thấy việc định lƣợng Amlodipin thành phẩm thuốc Apitim phƣơng pháp HPLC thu đƣợc hàm lƣợng đạt yêu cầu (90% – 110%) SVTH: Võ Mĩ Trinh 40 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua trình khảo sát việc định lƣợng hoạt chất Amlodipin besilat viên nang Apitim phƣơng pháp HPLC, đƣợc kết sau:  Đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp: - Có tƣơng quan tuyến tính rõ rệt nồng độ diện tích peak, với R = 0,99985, thuộc khoảng 0,99 ≤ R ≤ - Giới hạn phát hiện: 1,254 g/ml - Giới hạn định lƣợng: 3,799 g/ml - Phƣơng pháp có tính đặc hiệu, với H% = 0, thỏa mãn điều kiện H% ≤ 1% - Phƣơng pháp đạt độ xác, với RSD = 0,492% thỏa mãn điều kiện RSD ≤ 2% - Độ đạt yêu cầu, với ĐTB = 100,6 %, thuộc khoảng 98%≤ ĐTB ≤ 102%  Áp dụng phƣơng pháp HPLC để định tính định lƣợng hoạt chất Amlodipin besilat viên nang Apitim lô (041210, 010111, 030111) Công ty cổ phần Dƣợc Hậu Giang sản xuất, hàm lƣợng thu đƣợc đạt yêu cầu (90% - 110%)  Định lƣợng Amlodipin besilat phƣơng pháp HPLC có số ƣu điểm sau: phƣơng pháp phù hợp với điều kiện phịng kiểm nghiệm, cho độ nhạy cao, đạt độ xác độ tin cậy cao 5.2 KIẾN NGHỊ Ngày nay, với tiến không ngừng khoa học cơng nghệ, nên có nhiều phƣơng pháp để định lƣợng hoạt chất Amlodipin besilat dƣợc phẩm: [12] - Phƣơng pháp cực phổ - Phƣơng pháp Von – Ampe vòng - Phƣơng pháp Von – Ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân - Phƣơng pháp sắc ký khí SVTH: Võ Mĩ Trinh 41 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 Vì thời gian thực có hạn điều kiện phịng thí nghiệm nên chúng tơi tiến hành khảo sát định lƣợng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp Tiếp tục khảo sát phƣơng pháp khác Qua thời gian thực đề tài tốt nghiệp Phịng Kiểm Nghiệm Cơng ty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang giúp em củng cố kiến thức học trƣờng, có đƣợc kinh nghiệm quý báu cách sử dụng trang thiết bị giúp em biết cách xử lý mẫu phân tích, biết cách kiểm tra quy trình phân tích định lƣợng, giúp em thành thạo thao tác làm thí nghiệm Qua đó, em nhận thấy việc tạo điều kiện cho sinh viên thực đề tài Phòng Kiểm Nghiệm bổ ích tạo tảng giúp chúng em có định hƣớng nghề nghiệp tƣơng lai SVTH: Võ Mĩ Trinh 42 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ Y tế, (2009), Dược Điển Việt Nam IV [2] Bộ Y tế, (2004), Dược thư quốc gia Việt Nam, Tái lần thứ [3] Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh, Khoa Dƣợc, Bộ môn Nội, Bệnh học nội khoa, NXB Y học, Chi nhánh Thành Phố Hồ Chí Minh (2009) [4] Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh, Khoa Dƣợc, Bộ mơn Nội, Điều trị học nội khoa, NXB Y học, Chi nhánh Thành Phố Hồ Chí Minh (2009) [5] Huỳnh Kim Liên (2010), Bài giảng phương pháp thống kê hóa học [6] Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao, NXB Y Học [7] Nguyễn Thị Diệp Chi (2008), Các phương pháp phân tích đại [8] Nguyễn Thị Diệp Chi (2008), Kiểm nghiệm thực phẩm dược phẩm [9] http://en.wikipedia.org/wiki/Amlodipine [10] http://amlodipinebesylate.net/ [11] http://www.dhgpharma.com.vn/1/index.php?view=product&ID=3&lang=vn [12] http://news.vnu.edu.vn/tncn_3_10/10.pdf SVTH: Võ Mĩ Trinh 43 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Giá trị tƣơng ứng với độ tin cậy P số bậc tự f = n – ( t chuẩn Student) P f 0,9 0,95 0,99 6,31 12,7 63,7 2,92 4,3 9,92 2,35 3,18 5,84 2,13 2,78 4,6 2,01 2,57 4,03 1,94 2,45 3,71 1,89 2,36 3,5 1,86 2,31 3,36 1,83 2,26 3,25 10 1,81 2,23 3,17 Phụ lục 2: Giá trị Q tƣơng ứng với độ tin cậy P số lần đo n n 0,9 0,89 0,68 0,56 0,48 0,43 0,4 P 0,95 0,94 0,77 0,64 0,56 0,51 0,48 0,99 0,99 0,89 0,76 0,7 0,64 0,58 Phụ lục 3: Cơng thức tính Qtn, giới hạn tin cậy e giá trị thực M xn - xn+1 Qtn = xmax - xmin xn : giá trị nghi ngờ (thƣờng giá trị lớn hay nhỏ nhất) xn+1 : giá trị lân cận + Nếu Qtn > Qlt tức Qtn > 0,56 : mắc sai số thô  loại bỏ giá trị xn + Nếu Qtn  Qlt tức Qtn  0,56 : không mắc sai số thô  giá trị xn đƣợc giữ lại e% =  t SD n Giá trị thực M nằm khoảng M = x  e% SVTH: Võ Mĩ Trinh 44 GVHD: Ths Nguyễn Thị Diệp Chi Luận văn tốt nghiệp – Hóa Học K33 Phụ lục 4: Các thơng số phƣơng trình hồi quy tuyến tính xử lý Excell SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.999835123 R Square Adjusted R Square Standard Error 0.999670272 0.99958784 51649.90336 Observations ANOVA MS Significance F 4.07746E-08 Df SS Regression 3.23519E+13 Residual 10670850070 2.67E+09 Total 3.23626E+13 Coefficients Standard Error t Stat Intercept -67424.57619 59426.78889 -1.13458 0.319931 -232419.7933 97570.64093 X Variable 135966.2443 1234.668843 110.1237 4.08E-08 F 3.24E+13 12127.22 P-value Lower 95% 132538.254 Upper 95% 139394.2346 Phụ lục 5: Các phiếu kết kiểm nghiệm SVTH: Võ Mĩ Trinh 45 ... định phƣơng pháp định lƣợng hoạt chất Amlodipin besilat viên nang Apitim phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) - Áp dụng định tính định lƣợng hoạt chất Amlodipin besilat lô viên nang Apitim Công... 6899443 8,980 51 36 1,37388 6909093 8,967 51 27 1,37 655 6914633 8,967 51 25 1,3 651 0 69 157 18 8, 953 51 19 1,38412 69236 65 8, 953 51 20 1,38213 6931671 8, 953 51 12 1,38397 69 157 03,8 8,962 51 23,167 1,378... 56 7,1: Phân tử lƣợng Amlodipin besilat 4.4.3 Kết SVTH: Võ Mĩ Trinh 34 75 75 75 75 50 50 50 50 10 12 25 0 14 25 8. 957 8. 953 25 1.703 25 Amlodipin Besilat 100 mAU mAU 100 Amlodipin Besilat 100