ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA HỒNG ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGÔ HÀ LINH TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA HỒNG ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGÔ HÀ LINH TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA HỒNG ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS BÙI THANH TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS ĐẶNG KIM THU Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Trong trình nghiên cứu, hồn thành khóa luận với đề tài “Đánh giá khả chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.)”, nhận giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt tình PGS.TS Bùi Thanh Tùng ThS Đặng Kim Thu Bên cạnh giảng dạy tâm huyết thầy cô giáo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội khích lệ, cổ vũ gia đình ln bên cạnh động viên, tạo điều kiện thuận lợi để học tập, nghiên cứu cho việc hồn thành khóa luận Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gửi lời cảm ơn trân trọng tới thầy hướng dẫn tơi khóa luận PGS.TS Bùi Thanh Tùng ThS Đặng Kim Thu – Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng Khoa Y Dược, người khơng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành đề tài mà cịn định hướng cho đường nghiệp tới Nhân dịp này, chân thành cảm ơn Khoa Y Dược trang bị cho sở vật chất cho phép sử dụng dụng cụ, phịng thí nghiệm để hồn thành khóa luận Trong q trình thực tơi nhận giúp đỡ tận tình thầy mơn Dược lý – Dược lâm sàng, Bào chế, Dược liệu – Dược cổ truyền Hóa dược – Kiểm nghiệm Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận Mặc dù thân nỗ lực, cố gắng song khó tránh khỏi hạn chế, thiếu sót Kính mong q thầy, giáo đóng góp thêm ý kiến để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2020 Tác giả khóa luận Ngô Hà Linh Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh tiểu đường 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại đái tháo đường 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh đái tháo đường tuýp 1.1.4 Dịch tễ học 1.1.5 Các biến chứng 1.1.6 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường 1.2 Enzym α-glucosidase chất ức chế enzym α-glucosidase 1.2.1 Tổng quan enzym chất ức chế enzym 1.2.2 Enzym α-glucosidase 1.2.3 Các chất ức chế enzym α-glucosidase 1.3 Q trình oxy hóa thể chất chống oxy hóa 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Các chất chống oxy hóa 1.4 Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tác dụng chống oxy hóa in vitro 11 1.4.1 Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro 11 1.4.2 Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 12 1.5 Tổng quan Hồng đảng sâm 13 1.5.1 Nguồn gốc, phân loại 13 1.5.2 Đặc điểm thực vật 14 1.5.3 Bộ phận dùng 15 1.5.4 Thành phần hóa học 15 1.5.5 Tác dụng công dụng 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 18 2.1.3 Hóa chất, dung mơi 18 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp chiết xuất 19 2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa cao rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH 20 2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao rễ Hồng đảng sâm 21 2.4 Phương pháp xử lí số liệu 22 Chương KẾT QUẢ 24 3.1 Quy trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm 24 3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH 25 3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm 27 Chương BÀN LUẬN 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ĐTĐ Đái tháo đường EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FDA Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) iNOS Nitric oxide synthase cảm ứng (Inducible nitric oxide synthase) IU n-BuOH pNP pNPG Đơn vị quốc tế (International Unit) n-buthanol p-nitrophenol p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid RNS Nitrogen hoạt tính ROS Oxy hoạt tính RSS Sulfur hoạt tính SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) 𝑿 Giá trị trung bình DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Tên Trang 1.1 Cơ chế hoạt động enzym α-glucosidase 1.2 Nguyên tắc khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 12 1.3 Hình ảnh Hồng đảng sâm 12 1.4 Một số hợp chất phân lập từ rễ Hồng đảng sâm 16 2.1 Mẫu dược liệu Hồng đảng sâm 18 2.2 Sơ đồ chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm 20 3.1 Sơ đồ sản phẩm chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm 24 3.2 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa cao chiết toàn phần phân đoạn cao rễ Hồng đảng sâm nồng độ khác 26 3.3 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa in vitro acid ascorbic 27 3.4 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần phân đoạn rễ Hồng đảng sâm nồng độ khác 28 3.5 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro Acarbose 28 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Trang 1.1 Nguyên nhân ĐTĐ nguyên phát 1.2 Các hợp chất tự nhiên ức chế enzym α-glucosidase 1.3 Các chất chống oxy hóa nội sinh 1.4 Cấu trúc hóa học, ứng dụng số chất chống oxy hóa tổng hợp 10 3.1 Khả chống oxy hóa in vitro dịch chiết tồn phần phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng nồng độ khác 25 3.2 Khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần, phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng nồng độ khác 27 MỞ ĐẦU Trên toàn giới, đái tháo đường ngày tăng tỷ lệ, mức độ ảnh hưởng lên vấn đề sức khỏe khác, nguyên nhân gây tử vong hàng đầu, gây nhiều biến chứng trầm trọng ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống Số lượng người mắc đái tháo đường tăng gấp đơi vịng thập kỉ gần Bên cạnh đó, với việc tăng sử dụng thực phẩm khơng thích hợp, không hoạt động thể lực trẻ em, bệnh ĐTĐ tuýp có xu hướng tăng trẻ em, trở thành vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lòa, suy thận, cắt cụt chi [6] Mặc dù có nhiều tiến điều trị bệnh tiểu đường thuốc tân dược đường uống, việc nghiên cứu phát triển thuốc tiếp tục chi phí cao tác dụng phụ gây cho người bệnh Tại Việt Nam, khuynh hướng quay với thiên nhiên, tìm tịi, phát triển thuốc Đông y thuốc Y học cổ truyền ngày trọng nhiều kết hợp với tiến khoa học kỹ thuật y học Với lãnh thổ trải dài từ Bắc tới Nam, thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, nước ta có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng Việc sử dụng thảo dược y học có nhiều mục đích sở cho cơng nghiệp xanh công dụng thảo dược nhắm đến nhiều đích, hỗ trợ điều trị nhiều bệnh Các nhà khoa học tiến hành nhiều nghiên cứu chứng minh loại thảo dược có tác dụng hạ glucose máu, mang lại nhiều kết khả quan, đưa vào sử dụng lâm sàng Những lồi thảo dược có đặc điểm chứa lượng lớn hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase Đây hai đích thường sử dụng nghiên cứu tác dụng thảo dược hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica) vị thuốc cổ truyền sử dụng phổ biến nhiều nước châu Á Trung Quốc, Nhật Bản,… [45] Từ nhiều loài thuộc chi Codonopsis C.lanceolata, C.pilosula, C.ussuriesis, C subglobosa người ta chiết triterpen glycosid polysaccharid có tác dụng lên hệ miễn dịch giúp điều trị ung nhọt, cải thiện trí nhớ Ở Việt Nam, chi Codonopsis có 34 lồi, loại Hồng đảng sâm Việt Nam Codonopsis javanica sử dụng từ lâu dân gian với nhiều công dụng quý điều hòa huyết áp, tăng cường sinh lực Các nghiên cứu phân lập thành phần hóa học rễ Hồng đảng sâm cho kết có nhiều nhóm chất quý từ tự nhiên axit phenolic, flavonoid, alcaloid, Một số nghiên cứu giới cho thấy Hồng đảng sâm có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn hạ đường huyết qua tìm hiểu Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu chứng minh nhằm phát triển loại thảo dược thành sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Vì vậy, đề tài nghiên cứu khoa học: “Đánh giá khả chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.)” thực nhằm mục tiêu sau: 1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.) Đánh giá tác dụng ức chế enzym anpha-glucosidase in vitro phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.) Cách tiến hành Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase thực theo phương pháp Moradi-Afrapoli F cộng [48] Cụ thể sau:  Chất thử hịa tan DMSO (Dimethyl sulfoxid) pha lỗng đệm phosphate 10 mM (pH 6,8) 50 μL đưa vào giếng khay 96 giếng để có nồng độ 256 μg/mL, 64 μg/mL, 16 μg/mL; μg/mL  Thêm vào giếng 20 μL α-glucosidase (0,5U/mL) 130 μL đệm phosphate 100 mM (pH 6,8), trộn ủ 37°C 15 phút  Thêm vào giếng chất pNPG, ủ tiếp 37°C 60 phút  Đĩa thí nghiệm có chất thử, đệm phosphate pNPG sứ dụng làm chất chứng trắng (blank) Giếng thí nghiệm có DMSO 10%, đệm phosphate, enzym pNPG sử dụng làm đối chứng Thí nghiệm lặp lại lần để đảm bảo xác  Dừng thí nghiệm cách thêm vào 80 μL Na2CO3 0,2M đo OD máy đo ELISA Plate Reader (Bio-Rad) bước sóng λ = 405nm Cách đánh giá kết Công thức đánh giá khả ức chế enzym α-glucosidase mẫu thử: % ức chế = 100 - At Ac × 100 Trong đó:  Ac = A đối chứng = OD đối chứng – OD mẫu trắng đối chứng  At = A mẫu thử = OD mẫu thử - OD mẫu trắng thử Giá trị IC50 tính dựa vào đồ thị phương trình biểu diễn nồng độ % ức chế enzym α-glucosidase cao toàn phần phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm 2.4 Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu lưu trữ phân tích xử lý liệu theo phương pháp thống kê sinh học máy vi tính phần mềm Microsoft Office Excel 2016 phần mềm SigmaPlot 12 (Systat Software, Inc, Mỹ) Các thuật tốn sử dụng:  Giá trị trung bình (𝑋) tính trung bình cộng lần đo  Độ lệch chuẩn (SD) tính cơng thức: ̅(Xi −X ̅ )2 Σ SD = √ 22 n−1  Kết thí nghiệm biểu thị giá trị trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (𝑋 ± SD)  Giá trị IC50 tính hàm số y = ax2 + bx + c, biểu diễn mối tương quan nồng độ mẫu thử phần trăm tác dụng cao chiết nước rễ Hồng đảng sâm, x = 50% y = IC 50 23 Chương KẾT QUẢ 3.1 Quy trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm Rễ Hồng đảng sâm (200g) sau sấy khô, cắt nhỏ chiết xuất lần với ethanol tuyệt đối thu 12,32g cao ethanol Sau đó, giữ lại 2,32g cao ethanol để đánh giá khả chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase in vitro, lấy 10g lại đem hòa tan vào nước cất chiết phân đoạn với n-hexan, ethyl acetat, n-buthanol thu 3,16g cao n-hexan; 5,03g cao ethyl acetat 5,26g cao n-buthanol Kết cho thấy rễ Hồng đảng sâm chứa lượng lớn hợp chất tự nhiên Tách chiết phương pháp dùng dung mơi có độ phân cực từ thấp đến cao giúp tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách chiết hợp chất sau 200g dược liệu Chiết xuất lần Giữ lại 12,32g cao EtOH 2,32g cao EtOH Chiết phân đoạn lần Cao chiết nước 3,16g cao n-hexan Chiết phân đoạn lần Cao chiết nước 5,03g cao ethyl acetat Chiết phân đoạn lần Cao chiết nước 5,26g cao n-buthanol Hình 3.1 Sơ đồ sản phẩm chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm 24 Sau chiết phân đoạn xong, phân đoạn dịch chiết cao tổng đem hịa tan dung mơi methanol nhằm chuẩn bị dung dịch mẫu thử có nồng độ khác cho trình đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tác dụng chống oxy hóa in vitro rễ Hồng đảng sâm 3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm theo phương pháp DPPH Tác dụng chống oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH cao tồn phần phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm thí nghiệm nồng độ 31,25; 62,5; 125; 250; 500 1000 μg/mL Acid ascorbic chất chứng dương sử dụng thí nghiệm Giá trị phần trăm ức chế I (%) cao chiết toàn phần phân đoạn cao chiết nồng độ khác từ rễ Hồng đảng sâm Acid ascorbic trình bày bảng 3.1 hình 3.2 Bảng 3.1 Khả chống oxy hóa in vitro dịch chiết toàn phần phân đoạn dịch chiết cao rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng nồng độ khác Phân đoạn Ethanol n-Hexan EtOAc n-BuOH % ức chế nồng độ (µg/mL) 1000 92,78 ± 3,2 79,46 ± 2,1 97,58 ± 3,3 85,7 ± 1,9 500 250 125 62,5 75,36 59,63 43,25 23,54 ± 1,9 ± 2,3 ± 1,6 ± 0,9 57,36 48,25 31,25 14,6 ± 2,2 ± 1,7 ± 1,1 ± 0,5 86,45 76,24 65,87 46,35 ± 2,2 ± 1,9 ± 1,6 ± 1,5 74,6 60,5 45,8 30,7 ± 2,0 ± 2,1 ± 1,5 ± 0,9 % ức chế nồng độ (µg/mL) 31,25 10,24 ± 0,4 7,84 ± 0,2 35,25 ± 1,2 12,9 ± 0,3 Chất đối chứng 50 20 10 Acid ascorbic 85,68 ± 2,4 52,42 ± 1,4 36,58 ± 0,8 21,2 ± 0,5 5,33 ± 0,2 25 Giá trị IC50 (µg/mL) 186,5 ± 7,4 294,7±10,2 80,6 ± 2,8 159,2 ± 9,1 Giá trị IC50 (µg/mL) 17,2 ± 1,4 EtOH I% n-hexan I% 100 80 60 40 20 0 200 400 600 800 1000 1200 C (µg/mL) C (µg/mL) I% EtOAc I% 120 BuOH 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 200 400 600 800 1000 1200 C (µg/mL) 200 400 600 800 1000 C (µg/mL) Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa cao chiết toàn phần phân đoạn cao rễ Hồng đảng sâm nồng độ khác Từ bảng 3.1 hình 3.2., kết cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro tăng dần theo nồng độ Dịch chiết ethanol toàn phần từ rễ Hồng đảng sâm thể tác dụng chống oxy hóa in vitro với giá trị IC50 tính 186,5 ± 7,4 µg/mL Trong phân đoạn dịch chiết, phân đoạn EtOAc thể tác dụng chống oxy hóa in vitro mạnh với I% nồng độ cao 1000 µg/mL 97,58 %, giá trị IC50 tính 80,6 ± 2,8 µg/mL Tiếp theo phân đoạn n-BuOH với giá trị I% đạt 85,7 % nồng độ cao 1000 µg/mL, giá trị IC50 tính 159,2 ± 9,1 µg/mL Phân đoạn nHexan thể tác dụng chống oxy hóa yếu với giá trị IC50 tính 294,7 ± 10,2 µg/mL Song song với mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương acid ascorbic cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro acid ascorbic hoạt động ổn định thí nghiệm, có giá trị IC50 17,2 ± 1,4 µg/mL thể qua hình 3.3 26 100 Acid ascorbic I% 80 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 C (µg/mL) Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa in vitro acid ascorbic 3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm Tác dụng dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm thí nghiệm nồng độ 31,25; 62,5; 125; 250; 500 1000 μg/mL Acarbose chất chứng dương sử dụng thí nghiệm Giá trị phần trăm ức chế I (%) cao chiết toàn phần phân đoạn cao chiết nồng độ khác từ rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng dương trình bày bảng 3.2 hình 3.4 Bảng 3.2 Khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần, phân đoạn dịch chiết rễ Hồng đảng sâm chất đối chứng nồng độ khác Phân đoạn Ethanol n-Hexan EtOAc n-BuOH Chất đối chứng Acarbose % ức chế nồng độ (µg/mL) 1000 95,23 ± 3,6 68,25 ± 2,6 98,25 ± 3,5 86,3 ± 3,0 500 250 125 62,5 80,23 69,25 51,24 39,25 ± 2,9 ± 2,5 ± 1,8 ± 1,3 58,25 49,2 32,12 15,23 ± 1,9 ± 1,4 ± 1,1 ± 0,4 84,23 73,51 62,32 42,17 ± 2,3 ± 2,0 ± 1,8 ± 1,3 75,6 63,5 46,3 32,6 ± 2,5 ± 2,4 ± 1,3 ± 0,9 % ức chế nồng độ (µg/mL) 31,25 25,14 ± 0,8 8,25 ± 0,3 32,36 ± 1,0 15,6 ± 0,5 50 20 10 85,68 ± 3,2 52,42 ± 1,3 36,58 ± 1,2 21,2 ± 0,8 5,33 ± 0,1 27 Giá trị IC50 (µg/mL) 99,5 ± 4,8 291,4 ± 8,7 80,4 ± 5,9 129,6 ± 6,2 Giá trị IC50 (µg/mL) 156,8 ± 2,8 EtOH I% 100 80 n-Hexan I% 70 80 60 50 60 40 40 30 20 20 10 0 200 400 600 800 1000 1200 200 EtOAc I% 600 800 1000 1200 C (µg/mL) C (µg/mL) 120 400 100 100 BuOH I% 80 80 60 60 40 40 20 20 0 200 400 600 800 1000 1200 200 C (µg/mL) 400 600 800 1000 1200 C (µg/mL) Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao toàn phần phân đoạn rễ Hồng đảng sâm nồng độ khác Acarbose 100I% 80 60 40 20 0 200 400 600 800 1000 C (µg/mL) 1200 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym α-glucosidase in vitro Acarbose 28 Từ bảng 3.2 hình 3.4., kết cho thấy khả ức chế enzym αglucosidase in vitro tăng dần theo nồng độ Dịch chiết ethanol toàn phần, phân đoạn EtOAc n-BuOH từ rễ Hồng đảng sâm có giá trị IC50 99,5 ± 4,8 µg/mL, 80,4 ± 5,9 µg/mL, 129,6 ± 6,2 µg/mL, thể tác dụng ức chế enzym α-glucosidase tốt mẫu chứng Acarbose (giá trị IC50 156,8 ± 2,8 µg/mL) Trong phân đoạn dịch chiết, phân đoạn EtOAc thể tác dụng chống oxy hóa in vitro mạnh với I% nồng độ cao 1000 µg/mL 98,25% Phân đoạn n-Hexan thể tác dụng chống oxy hóa in vitro yếu với giá trị IC50 tính 291,4 ± 8,7 µg/mL Song song với mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương Acarbose cho thấy tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro Acarbose hoạt động ổn định thí nghiệm (hình 3.5.) 29 Chương BÀN LUẬN Hiện nay, đái tháo đường bệnh lý gây ảnh hưởng lên nhiều vấn đề sức khỏe khác, phát sinh nhiều biến chứng trầm trọng, ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Số lượng người mắc đái tháo đường tăng gấp đơi vịng thập kỉ gần ngày trẻ hóa qua năm Bệnh ĐTĐ gây nên nhiều biến chứng nguy hiểm, nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tim mạch, mù lịa, suy thận, cắt cụt chi [6] Chính hậu ĐTĐ gây khơng cho cá nhân người bệnh mà tạo nên gánh nặng cho tồn xã hội, hệ thống y tế, tài quốc gia nhà khoa học giới nỗ lực tìm kiếm phương pháp phòng điều trị hiệu bệnh ĐTĐ, ngăn ngừa biến chứng nâng cao chất lượng sống Bên cạnh việc nghiên cứu phát triển tân dược, nhà khoa học tiến hành nhiều nghiên cứu chứng minh loại thảo dược có tác dụng hạ glucose máu, dược liệu có khả chống oxy hóa ức chế enzym α-glucosidase Rễ Hồng đảng sâm có tác dụng dược lý tốt, sử dụng nhiều y học cổ truyền Hồng đảng sâm thường dùng để bồi bổ sức khỏe, dùng loại thuốc bổ, giúp bổ tỳ, ích khí, tân khát Tuy nhiên, Việt Nam, rễ C.javanica thường xuyên bị khai thác lấy rễ củ để làm thuốc Nạn phá rừng làm nương rẫy trực tiếp làm cho khu phân bố tự nhiên bị thu hẹp nhanh chóng Trữ lượng tự nhiên bị giảm sút nhiều Từ nhiều năm nay, Hồng đảng sâm loài thuộc chi Codonopsis liệt vào Sách Đỏ Việt Nam đối tượng ưu tiên bảo tồn [1] Chính thế, để bảo vệ nguồn dược liệu mang tính đặc hữu khu vực nên có nhiều nghiên cứu Việt Nam nhằm bảo tồn, nhân giống phát triển C.javanica loài khác thuộc chi Codonopsis [14, 17] Trong bệnh ĐTĐ, trình tăng glucose huyết thể sản sinh nhiều gốc tự làm suy yếu hệ thống phòng thủ chống oxy hóa nội sinh Do đó, việc sử dụng chất chống oxy hóa để phịng ngừa làm suy giảm triệu chứng bệnh ĐTĐ biện pháp thường cân nhắc sử dụng Phương pháp quét gốc tự DPPH sử dụng rộng rãi để giá khả chống oxy hóa in vitro có nhiều ưu điểm phương pháp khác Kết nghiên cứu cho thấy tác dụng chống oxy hóa phương pháp thu dọn gốc tự DPPH cao chiết toàn phần cao chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm phụ thuộc vào nồng độ: nồng độ cao chiết tăng tác dụng quét gốc tự tăng theo dựa theo đồ thị dựng hình 3.2 Cao chiết phân đoạn EtOAc rễ Hồng đảng sâm có quét gốc tự DPPH cao với IC50 80,6±2,8 μg/mL Kết nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa Hồng đảng sâm nghiên cứu nảy tương đồng với nghiên cứu giới loài chi Codonopsis Sang-Min Jeon cộng có nghiên cứu lồi khác chi Codonopsis Codonopsis lanceolata tác dụng chống oxy hóa in vitro lồi thơng qua chiết cao áp hấp q trình lên men có hiệu so với cách chiết xuất thông thường [41] Chang-Seon Yoo Sung-Jin Kim chứng minh chiết xuất methanol Codonopsis pilosula có tác dụng chống oxy hóa in vivo rõ rệt thơng qua ức chế q trình oxy hóa iNOS protein [51] Judy Yuet-Wa Chan 30 cộng nghiên cứu tác dụng chống đái tháo đường chống oxy hóa mơ hình chuột mắc bệnh tiểu đường cơng thức có tên gọi SR10, bao gồm rễ Astragali, rễ Codonopsis Cortex Lycii Kết cho thấy SR10 có hiệu việc giảm mức đường huyết điều trị mãn tính cách cải thiện chức tế bào beta Các hoạt động biểu enzyme chống oxy hóa, catalase superoxide dismutase tăng lên điều trị SR10 Hơn nữa, SR10 không cho thấy tác dụng gây độc thể [34] Enzym α-glucosidase enzym nằm màng đường ruột, tham gia vào bước cuối q trình tiêu hóa Enzym xúc tác cho trình phân hủy đường disaccaride sucrose hay maltose thành monosaccharide glucose, chất ức chế enzym làm giảm trình hấp thu đường từ quan tiêu hóa vào máu Các chất ức chế enzym α-glucosidase sử dụng làm thuốc tân dược acarbose, voglibose, thường gây nên số tác dụng không mong muốn đau bụng, tiêu chảy, Trong nghiên cứu này, acarbose sử dụng làm chất đối chứng dương để đánh giá khả ức chế enzym α-glucosidase Kết nghiên cứu đề tài cho thấy cao chiết EtOH toàn phần, phân đoạn EtOAc n-BuOH rễ Hồng đảng sâm có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mạnh so với chứng dương acarbose Ngoài ra, tác dụng ức chế enzym α-glucosidase in vitro cao chiết toàn phần cao chiết phân đoạn rễ Hồng đảng sâm phụ thuộc vào nồng độ (hình 3.4) Hướng nghiên cứu loài việc điều trị bệnh ĐTĐ tiến hành phân tách hợp chất cao chiết để phân lập hợp chất có tác dụng ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 cao Kết nghiên cứu cao chiết rễ C.Javanica đề tài tương đồng với nghiên cứu trước loài chi Codonopsis Kai He cộng chứng minh Codonopsis pilosula có khả hạ đường huyết chuột bị tiểu đường streptozotocin việc ức chế tốt enzym α-glucosidase [38] Suk Whan Jung cộng nghiên cứu rễ Codonopsis lanceolata có chứa hợp chất tangshenoside β-adenosine có tác dụng ức chế α-glucosidase in vitro yếu với IC50 lần 1,4 9,3 mM [42] Một số hợp chất phân lập từ rễ Hồng đảng sâm có tiềm điều trị ĐTĐ bệnh mắc kèm stress oxy hóa gây Các nghiên cứu nghiên cứu in vitro in vivo từ loại dược liệu khác từ dược chất tinh khiết Taraxerol, β-sitosterol, α-spinasterol chứng minh có tác dụng chống đái tháo đường chống oxy hóa xem xét nghiên cứu lâm sàng để phát triển thuốc điều trị bệnh tiểu đường biến chứng tiểu đường gây bệnh thận đái tháo đường [36, 43] Ngoài ra, Abdullateef Isiaka Alagbonsi cộng cho thấy adenosine mục tiêu điều trị điều trị bệnh tiểu đường tuýp khả hạ đường huyết chuột mắc không mắc bệnh tiểu đường [26] Ayman Mahmoud cộng chứng minh hesperidin đóng vai trò đầy hứa hẹn điều trị bệnh tiểu đường biến chứng nhờ tác dụng điều hòa chất vận chuyển glucose, tiết độ nhạy insulin, stress oxy hóa, q trình viêm, hấp thu glucose ngoại biên, hấp thu glucose ruột sản xuất glucose gan [47] 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nghiên cứu đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro phân đoạn dịch chiết từ rễ Hồng đảng sâm thu phân đoạn EtOAc có tác dụng tốt với giá trị IC50 = 80,6 ± 2,8 µg/mL, xếp sau phân đoạn n-BuOH, EtOH n-Hexan Nghiên cứu đánh giá phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym α – glucosidase in vitro tốt với giá trị IC50 = 80,4 ± µg/mL so với phân đoạn dịch chiết cịn lại từ rễ Hồng đảng sâm Ngoài ra, hai phân đoạn n-BuOH EtOH cho thấy khả ức chế enzym α – glucosidase in vitro với IC50 129,6 ± 6,2 99,5 ± 4,8 µg/mL KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thêm phương pháp tách chiết thành phần hóa học rễ Hồng đảng sâm dung môi khác để thu hàm lượng chất có tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym α – glucosidase cao Kết thu qua nghiên cứu có ý nghĩa định hướng nghiên cứu sâu thành phần hóa học rễ Hồng đảng sâm, phân đoạn dịch chiết EtOAc, nhằm phân tách, tinh chế hoạt chất có tiềm điều trị đái tháo đường tuýp nghiên cứu khoa học, ứng dụng lâm sàng 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Nguyễn Tiến Bân, Trần Đình Lý, Nguyễn Tập cộng (2007), Sách đỏ Việt Nam (phần II - Thực vật), NXB Khoa học tự nhiên công nghệ Đàm Trung Bảo (2001), "Các gốc tự do", Tạp chí Dược học, 6, tr 29-30 Bệnh viện Bạch Mai (2017), "Đái tháo đường", Hướng dẫn chẩn đoán điều trị bệnh nội khoa, NXB Y học, tr 411-416 Bộ Y tế (2009), "Bệnh học", Đái tháo đường, NXB Giáo Dục, tr 179 - 191 Bộ Y tế (2012), "Hormon thuốc điều trị rối loạn nội tiết", Dược lý học tập 2, NXB Y học, tr 303-304 Bộ Y Tế (2017), "Hướng dẫn chẩn đoán điều trị đái tháo đường típ 2" Hồng Minh Chung (2003), "Định lượng số chất khoáng Đảng sâm Việt Nam, dịch chiết men bia chế phẩm SMC", Tạp chí dược liệu, 8(1), tr 21 - 23 Hoàng Minh Chung (2006), "Nghiên cứu bào chế Chế phẩm trà tan "Thảo Sâm Đơng Đơ" dùng cho cộng đồng", Tạp chí nghiên cứu y dược, 46(6), tr 109-113 Hoàng Minh Chung (2009), "Sesquiterpen Đảng sâm trước sau chế biến ", Tạp chí dược liệu, 14(3), tr 163 - 166 Hồng Minh Chung (2010), "Phân lập, nhận dạng dẫn xuất glycosid Đảng sâm Việt Nam", Tạp chí dược liệu, 15(3), tr 182 - 186 Trần Thanh Hà, Hà Vân Oanh Đỗ Thị Hà (2016), "Thành phần hóa học phân đoạn chiết n-butanol rễ loài đảng sâm Việt Nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f) ", Tạp chí Dược học, 56(4) Trần Thanh Hà, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Thị Hà cộng (2014), "Thành phần hóa học rễ đảng sâm", Tạp chí Dược Liệu, 19, tr 211-215 Pham Thanh Huyen, Nguyen Quynh Nga, Phan Van Truong cộng (2014), "Study on Morphological and Microscopic Characteristic of Codonopsis javanica (Blume) Hook f & Thoms in Vietnam", Journal of Medicinal Materials-Hanoi, 19(5), tr 263-268 Đinh Đoàn Long Phạm Thanh Huyền (2017), "Sử dụng thị ADN (RAPD-PCR) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng cơng tác bảo tồn phát triển Việt Nam", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 33, tr 32-39 Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nguyễn Văn Mùi (2015), Enzyme học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, 361 Nguyễn Thị Thanh Nga (2012), Đánh giá đa dạng di truyền số loài dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) kỹ thuật AND mã vạchĐại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Tập (2007), Cẩm nang thuốc cần bảo vệ Việt Nam, NXB Y học Hoàng Thị Thúy (2019), Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase tác dụng chống oxy hóa dịch chiết bơ (Persea americana Mill.), Khoa Y Dược - ĐHQGHN Mai Thế Trạch (2007), Nội tiết học đại cương, NXB Y học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh 21 22 23 24 Bùi Thanh Tùng, Đặng Kim Thu, Hải PT cộng (2018), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase phân đoạn dịch chiết Lựu (Punica granatum Linn)", Tạp chí Y Dược cổ truyền Việt Nam, 5(18), tr 59-63 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Vol Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học kỹ thuật Đỗ Quốc Việt, Trần Văn Sung Nguyễn Thanh Thủy (2006), "Sơ nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết Chuối hột (Musa balbisiana Colla.) chuột thực nghiệm", Tạp chí Dược học, 5, tr 8-10 Tài liệu tiếng Anh 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Kun-Ning Chen, Wen-Huang Peng, Chien-Wen Hou cộng (2013), "Codonopsis javanica root extracts attenuate hyperinsulinemia and lipid peroxidation in fructose-fed insulin resistant rats", journal of food and drug analysis, 21(4), tr 347-355 Abdullateef Isiaka Alagbonsi, Toyin Mohammed Salman, Hussein Mofomosara Salahdeen cộng (2016), "Effects of adenosine and caffeine on blood glucose levels in rats", Nigerian Journal of Experimental and Clinical Biosciences, 4(2), tr 35 Antonio Blanco Gustavo Blanco (2017), "Enzymes", Medical Biochemistry, tr 153-175 Halliwell B (1994), "Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence?", The Lancet, 344(8924), tr 721-724 Padavala Ajay Babu, Gadde Suneetha, Radha Boddepalli cộng (2006), "A database of 389 medicinal plants for diabetes", Bioinformation, 1(4), tr 130 John W Baynes (1991), "Role of oxidative stress in development of complications in diabetes", Diabetes, 40(4), tr 405-412 D John Betteridge (2000), "What is oxidative stress?", Metabolism-Clinical and Experimental, 49(2), tr 3-8 Márcio Carocho Isabel CFR Ferreira (2013), "A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives", Food and chemical toxicology, 51, tr 15-25 Anitra C Carr Balz Frei (1999), "Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans", The American journal of clinical nutrition, 69(6), tr 1086-1107 Judy Yuet‐Wa Chan, Fung‐Chun Lam, Ping‐Chung Leung cộng (2009), "Antihyperglycemic and antioxidative effects of a herbal formulation of Radix Astragali, Radix Codonopsis and Cortex Lycii in a mouse model of type diabetes mellitus", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 23(5), tr 658-665 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Chun Whan Choi, Yeon Hee Choi, Mi-Ran Cha cộng (2010), "Yeast αglucosidase inhibition by isoflavones from plants of Leguminosae as an in vitro alternative to acarbose", Journal of agricultural and food chemistry, 58(18), tr 9988-9993 Rajnish Gupta, Anil K Sharma, MP Dobhal cộng (2011), "Antidiabetic and antioxidant potential of β‐sitosterol in streptozotocin‐induced experimental hyperglycemia", Journal of diabetes, 3(1), tr 29-37 Jing-Yu He, Na Ma, Shu Zhu cộng (2015), "The genus Codonopsis (Campanulaceae): a review of phytochemistry, bioactivity and quality control", Journal of natural medicines, 69(1), tr 1-21 Kai He, Xuegang Li, Xin Chen cộng (2011), "Evaluation of antidiabetic potential of selected traditional Chinese medicines in STZ-induced diabetic mice", Journal of ethnopharmacology, 137(3), tr 1135-1142 Kelly E Heim, Anthony R Tagliaferro Dennis J Bobilya (2002), "Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships", The Journal of nutritional biochemistry, 13(10), tr 572-584 Federation ID (2019), IDF Diabetes Atlas 9th Edition, 9th, International Diabetes Federation Sang-Min Jeon, So-Young Kim, In-Hye Kim cộng (2013), "Antioxidant activities of processed Deoduck (Codonopsis lanceolata) extracts", Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, 42(6), tr 924-932 Suk Whan Jung, Ae Jin Han, Hae Jin Hong cộng (2006), "alphaglucosidase inhibitors from the roots of Codonopsis lanceolata Trautv", Agricultural Chemistry and Biotechnology, 49(4), tr 162 Ritu Khanra, Niloy Bhattacharjee, Tarun K Dua cộng (2017), "Taraxerol, a pentacyclic triterpenoid, from Abroma augusta leaf attenuates diabetic nephropathy in type diabetic rats", Biomedicine & Pharmacotherapy, 94, tr 726-741 Sunil Kumar, Smita Narwal, Vipin Kumar cộng (2011), "α-glucosidase inhibitors from plants: A natural approach to treat diabetes", Pharmacognosy reviews, 5(9), tr 19 Chia-Ying Li, Hong-Xi Xu, Quan-Bin Han cộng (2009), "Quality assessment of Radix Codonopsis by quantitative nuclear magnetic resonance", Journal of Chromatography A, 1216(11), tr 2124-2129 Camilo López-Alarcón Ana Denicola (2013), "Evaluating the antioxidant capacity of natural products: A review on chemical and cellular-based assays", Analytica chimica acta, 763, tr 1-10 Ayman M Mahmoud Omnia E Hussein (2014), "Hesperidin as a promising antidiabetic flavonoid: the underlying molecular mechanism", Int J Food Nutr Sci| Volume, 3(3), tr Fahimeh Moradi-Afrapoli, Behavar Asghari, Soodabeh Saeidnia cộng (2012), "In vitro α-glucosidase inhibitory activity of phenolic constituents from aerial parts of Polygonum hyrcanicum", DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 20(1), tr 37 49 50 51 Kenjiro Tadera, Yuji Minami, Kouta Takamatsu cộng (2006), "Inhibition of α-glucosidase and α-amylase by flavonoids", Journal of nutritional science and vitaminology, 52(2), tr 149-153 Marian Valko, Dieter Leibfritz, Jan Moncol cộng (2007), "Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease", The international journal of biochemistry & cell biology, 39(1), tr 44-84 Chang-Seon Yoo Sung-Jin Kim (2013), "Methanol extract of Codonopsis pilosula inhibits inducible nitric oxide synthase and protein oxidation in lipopolysaccharidestimulated raw cells", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 12(5), tr 705710 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGÔ HÀ LINH TRANG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA HỒNG ĐẢNG SÂM (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... trình thực khóa luận Mặc dù thân nỗ lực, cố gắng song khó tránh khỏi hạn chế, thiếu sót Kính mong q thầy, giáo đóng góp thêm ý kiến để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng... Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội khích lệ, cổ vũ gia đình ln bên cạnh động viên, tạo điều kiện thuận lợi để học tập, nghiên cứu cho việc hồn thành khóa luận Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ