Sàng lọc, tổng hợp và thử hoạt tính kháng lipase tụy của các dẫn chất xanthin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ TẠ HỒNG THANH SÀNG LỌC, TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG LIPASE TỤY CỦA CÁC DẪN CHẤT XANTHIN Ngành: Dược lý – Dược lâm sàng Mã số: 8720205 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Võ Thị Cẩm Vân PGS.TS Trần Thành Đạo TP Hồ Chí Minh - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người viết Tạ Hồng Thanh BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN Hiện béo phì bệnh mang tính tồn cầu, có nhiều nghiên cứu từ chất có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp tập trung vào ức chế enzym lipase tụy để điều trị béo phì, nhiên chưa có nhiều nghiên cứu nhóm alkaloid đặc biệt phân nhóm xanthin điều trị béo phì Nhận thấy tiềm nhóm chất xanthin điều trị béo phì, đề tài tiến hành sàng lọc ảo docking phân tử với protein 1LPB, tổng cộng 69 chất tiến hành sàng lọc Từ kết thu qua sàng lọc ảo docking phân tử tiến hành tổng hợp dẫn chất xanthin có chất mới, chất tổng hợp lại, sau tiến hành thử hoạt tính dẫn chất tổng hợp chất chuẩn Tổng cộng 11 dẫn chất tiến hành thử hoạt tính kháng lipase in vitro với enzym tụy lợn, phương pháp thử sử dụng chất diện hoạt Triton X-100 Kết thử hoạt tính kháng lipase đánh giá qua thông số IC50 xác định mối tương quan nồng độ chất ức chế hoạt tính enzym Kết thu đáng ngạc nhiên có dẫn chất T45, T41, T43, T44 có giá trị IC50 thấp hứa hẹn sử dụng làm chất khởi nguồn cho nghiên cứu tiếp theo, T45 có giá trị IC50 8,52 ± 0,83 μM, hứa hẹn sử dụng làm chất khởi nguồn cho nghiên cứu thuốc điều trị béo phì ABTRACT Obeysity and overweight is globally disease There are many researches of naturally compounds and synthetic substances focused on the inhibition of pancreatic lipase enzymes for the treatment of obesity However, there are not many studies of alkaloids group, especially xanthine group for obesity treatment Recognizing the potential of xanthine in the treatment of obesity, the research conducted a virtual screening with molecular docking with 1LPB protein, total of 69 substances were screened From the results obtained by virtual screening with molecular docking, synthetic xanthine derivatives were synthesized, including new ones, synthesized ones Then, synthetic derivatives and standard substances were tested in vitro against lipase activity with pig pancreatic enzyme, Triton X-100 trial method Results of lipase activity assay were evaluated by IC50 parameters and determined the correlation between inhibitor concentration and enzyme activity The results are surprising given that the T45, T41, T43, T44 derivatives have a low IC50 value, especially T45 has an IC50 value of 8.52 ± 0.83 μM and promise to be lead compound for further studies MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH VẼ vi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vii DANH MỤC CÁC BẢNG vii ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 BỆNH BÉO PHÌ .3 2.1.1 Thừa cân béo phì 2.1.2 Nguyên nhân dẫn đến thừa cân béo phì 2.1.3 Hậu thừa cân béo phì 2.1.4 Điều trị bệnh béo phì 2.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ LIPASE TỤY 10 2.2.1 Lipase tụy q trình tiêu hóa chất béo 10 2.2.2 Độ đặc hiệu chất .11 2.2.3 Cấu trúc chức .12 2.3.4 Nhóm hợp chất methylxanthin 18 2.4 MƠ HÌNH DOCKING 21 2.4.1 Tổng quan sàng lọc ảo thiết kế thuốc 21 2.4.2 Docking 23 2.5 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG LIPASE TỤY .24 2.5.1 Định lượng hoạt tính enzym lipase tụy 24 2.5.2 Thử nghiệm hoạt tính kháng lipase phương pháp đo quang 25 3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .25 i 3.2 MƠ HÌNH DOCKING PHÂN TỬ CÁC DẪN CHẤT METHYLXANTHIN TRÊN ENZYM LIPASE TỤY Ở NGƯỜI 29 3.2.1 Lựa chọn chuẩn bị cấu trúc mục tiêu tác động 29 3.2.2 Chuẩn bị cấu trúc ligand 29 3.2.3 Tiến hành docking ligand vào mục tiêu tác động 30 3.2.4 Re-docking ligand đồng kết tinh .31 3.2.5 Phân tích kết docking .31 3.3 TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT METHYLXANTHIN 33 3.3.1.Nguyên tắc tổng hợp 33 3.3.2 Cách tiến hành tổng hợp 34 3.3.3 Tinh chế 35 3.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ CẤU TRÚC SẢN PHẨM 35 3.4.1 Cảm quan tính chất vật lý 35 3.4.2 Sắc ký lớp mỏng 35 3.4.3 Phổ IR 36 3.4.4 Phổ 1H-NMR 36 3.5 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG LIPASE TỤY IN VITRO 37 3.5.1 Nguyên tắc 37 3.5.2 Cách tiến hành 37 3.6 ĐỊA ĐIỂM, PHẦN MỀM, NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 41 3.6.1 Nguyên liệu .41 3.6.2 Thiết bị 42 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 4.1 KẾT QUẢ DOCKING 43 4.1.1 Kết docking orlistat chọn khoang gắn kết Protein 1LPB 43 4.1.2 Kết docking dẫn chất methylxanthin 46 4.2 KẾT QUẢ TỔNG HỢP .52 i 4.2.1 Tổng hợp methylxanthin từ theophyllin dẫn xuất halogen 52 4.2.2 Tổng hợp methylxanthin phương pháp khác 62 4.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH 67 4.3.1 Kết xây dựng đường chuẩn PNP xác định hoạt tính enzym 67 4.3.2 Kết thử hoạt tính kháng lipase dẫn chất methylxanthin 69 4.4 BÀN LUẬN 71 4.4.1 Sàng lọc hoạt tính dẫn chất methylxanthin mơ hình sàng lọc ảo docking 71 4.4.2 Tổng hợp dẫn chất methylxanthin từ nguyên liệu đầu vào theophyllin .72 4.4.3 Thử hoạt tính ức chế dẫn chất methylxanthin tổng hợp để đánh giá hoạt tính in vitro mối tương quan hoạt tính in vitro sàng lọc ảo 72 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .73 5.1 KẾT LUẬN 73 5.2 ĐỀ NGHỊ .74 TÀI LIỆU THAM KHẢO .75 PHỤ LỤC PL1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu viết tắt Ý nghĩa CTPT Công thức phân tử DMSO Dimethylsulfoxid FDA Food and Drug Administration IC50 Inhibitory concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%) IR Infrared (Hồng ngoại) MW Molecular weight (Khối lượng phân tử) MUP Methoxyundecylphosphinic acid NMR Nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PDB Protein Data Bank p-NPP p-nitrophenyl palmitat PNP p-nitrophenol PLT Pancreatic triglyceride lipase UV Ultraviolet (Tử ngoại) to Nhiệt độ s Singlet (Đỉnh đơn) d Doublet (Đỉnh đôi) dd Đỉnh đôi, đôi t Triplet (Đỉnh ba) m Multiplet (Đa đỉnh) T41 Dyphyllin T43 Theophyllin-7-acetaldehyd T45 Acephyllin T46 Doxophyllin T47 7-Benzyl-1,3-dimethyl-3,7-dihydro-1H-purin-2,6-dion T44 7-(2-((4-acetylphenyl)imino)ethyl)-1,3-dimethyl-3,7dihydro-1H-purin-2,6-dion T48 7-Allyl-1,3-dimethyl-3,7-dihydro-1H-purin-2,6-dion T42 Etophyllin T49 7,8-Dibenzyl-1,3-dimethyl-3,7-dihydro-1H-purin-2,6dion i DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 2.1 Q trình tiêu hóa hấp thu chất béo .10 Hình 2.2 Cấu trúc tinh thể phức hợp PLT-colipase cấu dạng khác 13 Hình 2.3 Bề mặt phức hợp PTL-lipase trạng thái mở đóng 15 Hình 2.4 Cấu trúc chung dẫn chất nhóm methylxanthin .18 Hình 2.5 Cấu trúc hợp chất nhóm methylxanthin 19 Hình 2.6 Hình minh họa hiệu đáp ứng liều caffein, theophyllin, theobromin với hoạt động enzym lipase tụy người 20 Hình 2.7 Sơ đồ nghiên cứu thuốc dựa vào cấu trúc mục tiêu 22 Hình 3.8 Phương pháp tổng hợp dẫn chất methylxanthin………………… .33 Hình 3.9 Phương pháp tổng hợp theophyllin-7-acetaldehyd 33 Hình 3.10 Phương pháp tổng hợp imin 34 Hình 3.11 Phương pháp tổng hợp 8-clorotheophylin 34 Hình 4.12 Cấu trúc 3D khoang Ligand 1LPB chất đồng kết tinh BOG 44 Hình 4.13 Tương tác Orlistat 1LPB 46 Hình 4.14 Tương tác caffein với 1LPB 51 Hình 4.15 Tương tác T52, chất có điểm số docking tốt với 1LPB 52 Hình 4.16 Tương tác dyphyllin 1LPB 53 Hình 4.17 Tương tác T47 1LPB 55 Hình 4.18 Tương tác T49 1LPB 57 Hình 4.19 Tương tác T42 1LPB 59 Hình 4.20 Tương tác T48 1LPB 61 ... hành thử hoạt tính dẫn chất tổng hợp chất chuẩn Tổng cộng 11 dẫn chất tiến hành thử hoạt tính kháng lipase in vitro với enzym tụy lợn, phương pháp thử sử dụng chất diện hoạt Triton X-100 Kết thử. .. PNP xác định hoạt tính enzym 67 4.3.2 Kết thử hoạt tính kháng lipase dẫn chất methylxanthin 69 4.4 BÀN LUẬN 71 4.4.1 Sàng lọc hoạt tính dẫn chất methylxanthin mơ hình sàng lọc ảo docking... 4.4.2 Tổng hợp dẫn chất methylxanthin từ nguyên liệu đầu vào theophyllin .72 4.4.3 Thử hoạt tính ức chế dẫn chất methylxanthin tổng hợp để đánh giá hoạt tính in vitro mối tương quan hoạt