Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm trichoderma và xạ khuẩn streptomyces đối kháng với một số vi nấm gây bệnh trên cây đậu xanh (vigna radiate l ) tại xã điện hồng – điện bàn quảng nam

i ỌC N N ỌC SƢ P M KHOA SINH K ÓA LUẬN TỐT N ỆP ỌC Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces đối kháng với số vi nấm gây bệnh đậu xanh (Vigna radiate L.) xã iện Hồng – iện Bàn - Quảng Nam Sinh viên thực : Bùi Thị Minh Hiệp Chuyên ngành : Cử nhân Sinh Môi Trƣờng Ngƣời hƣớng dẫn : TS ỗ Thu Hà Nẵng, tháng 5/ 2013 ii LỜI CẢM ƠN Em xin trân trọng bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giáo hướng dẫn TS Đỗ Thu Hà tận tình hướng dẫn truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh – Môi trường – Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho em năm học Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln giúp đỡ, động viên em suốt thời gian làm khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Bùi Thị Minh Hiệp iii DAN MỤC CÁC C Ữ V ẾT TẮT CKS : Chất kháng sinh HSCC : Hệ sợi chất HSKS : Hệ sợi khí sinh KS : Kháng sinh MT : Môi trường XK : Xạ khuẩn XKTS : Xạ khuẩn tổng số TP : Thành phố VSV : Vi sinh vật VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định iv DAN Số hiệu MỤC CÁC BẢN Tên bảng bảng Trang 3.1 Thành phần nấm bệnh hại đậu xanh 24 3.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm bệnh gây hại 24 3.3 Lây nhiễm chủng nấm Fusarium NB2 Collectotrichum NB3 lên đậu xanh 26 3.4 Hoạt tính kháng VSVKĐ 14 chủng XK chi Streptomyces 28 3.5 Đặc điểm ni cấy hình thái chủng XK XK 15 30 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 Khả sinh enzym ngoại bào chủngxạ khuẩn XK 2, XK 15 Hoạt tính KS chủng xạ khuẩn tuyển chọn môi trường lên men Sự phát triển chủng nấm Trichoderma sau ngày nuôi cấy môi trường giá đỗ Kết mức đối kháng nấm Trichoderma nấm bệnh Fusarium Mức đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh Collectotrichum Thời gian nuôi cấy hai chủng xạ khuẩn XK XK 15 môi trường dịch thể So sánh khả phát triển nấm Trichoderma qua công thức So sánh khả phát triển xạ khuẩn qua cơng thức Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Collectotrichum sau rắc chế phẩm nấm Trichoderma Số lượng mắc bệnh chết công thức sau lây nhiễm nấm bệnh 31 32 34 35 36 38 40 41 42 44 v DAN Số hiệu hình 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 MỤC CÁC ÌN Tên hình Trang Cách cấy nấm Trichoderma nấm bệnh đĩa petri Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm xạ khuẩn Streptomyces Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm Trichoderma Mơ hình bố trí thí nghiệm giai đoạn 19 Mơ hình bố trí thí nghiệm giai đoạn Hình ảnh phân lập nấm bệnh mơi trường WA Hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm bệnh hại đậu xanh Cuống sinh bào tử bào tử vi nấm bệnh gây hại đậu xanh Nhân sinh khối nấm MT PDA để lây bệnh nhân tạo sau ngày Dịch bào tử chủng nấm NB 02; NB 03; NB 04 Các triệu chứng bệnh lây nhiễm nấm Collectotrichum Fusarium đậu xanh Hình ảnh ống giống số chủng xạ khuẩn có hoạt tính KS Vịng vơ khuẩn hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn XK 02 XK 15 với nấm gây bệnh đậu xanh mơi trường Gauze I Hình ảnh khuẩn lạc chủng xạ khuẩn XK 02 Hình ảnh ống giống chủng xạ khuẩn XK 02 Hình ảnh khuẩn lạc chủng xạ khuẩn XK15 Hình ảnh ống giống chủng xạ khuẩn XK 15 Khả sinh enzym amylaza xenlulaza XK 02, XK 15 Phân lập chủng Trichoderma mơi trường PDA Hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm Trichoderma sau 20 20 22 23 25 25 25 26 27 27 29 29 31 31 31 31 32 33 34 vi Số hiệu hình 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 3.22 3.23 3.24 3.25 3.26 3.27 3.28 Tên hình ngày ni cấy môi trường giá đỗ Khả đối kháng số chủng nấm Trichoderma nấm bệnh Fusarium sau 10 ngày nuôi cấy Khả đối kháng số chủng nấm Trichoderma nấm Collectotrichum sau 10 ngày nuôi cấy Cuống sinh bào tử, bào tử ống giống chủng Tri 03 Cuống sinh bào tử, bào tử ống giống chủng Tri 07 Nhân giống xạ khuẩn môi trường A4-H tạo dịch cấp dịch cấp Chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces sản xuất phương pháp lên men xốp môi trường trấu cám Chế phẩm nấm Trichoderma sản xuất phương pháp lên men xốp sau ngày ngày nuôi cấy Khả đối kháng chế phẩm nấm bệnh gây hại đậu xanh Khả đối kháng chế phẩm nấm Trichoderma đốivới nấm bệnh Collectotrichum qua ngày Cây đậu xanh 15 ngày tuổi cơng thức thí nghiệm Nấm Collectotrichum xuất xung quanh gốc đậu xanh CT sau 10 ngày lây nhiễm nấm bệnh Biễu bệnh đậu xanh CT2 sau 10 ngày lây nhiễm nấm bệnh Cây đậu xanh CT 3, CT sau 15 ngày lây nhiễm nấm bệnh Trang 36 37 37 37 39 39 40 40 43 44 45 46 46 MỞ ẦU LÝ DO C ỌN Ề T Khi xã hội ngày phát triển nhu cầu người lương thực, thực phẩm đảm bảo chất lượng nâng cao trở nên cấp thiết Sự tăng trưởng hóa học nơng nghiệp thâm canh sản xuất thay đổi nhiều đến điều kiện mơi trường sinh thái sống Trước tình hình đó, biện pháp phịng trừ sâu bệnh hại phương pháp sinh học nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều Đáng ý nghiên cứu số loại vi sinh vật (VSV) có khả đối kháng với nấm bệnh trồng Vi sinh vật đối kháng ngăn chặn số bệnh hại mà cịn khơng gây ảnh hưởng đến lồi thiên địch xứ tự nhiên không gây ô nhiễm mơi trường Sự bảo tồn lồi thiên địch tự nhiên “chìa khóa” vững để phịng trừ sâu bệnh hại trồng an toàn hiệu quả.Trong tác nhân ý số loại xạ khuẩn Streptomyces nấm Trichoderma có khả đối kháng với vi nấm gây bệnh trồng Ở Việt Nam sử dụng nhiều chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản phân lập số chủng xạ khuẩn nấm Trichoderma có khả chống nấm gây bệnh thực vật Tuy nhiên việc sử dụng chế phẩm lĩnh vực bảo vệ thực vật nước ta mức độ thấp tập quán canh tác quen dùng số hóa chất bảo vệ thực vật định Cây đậu xanh (Vigna radiate L.) loại trồng có giá trị kinh tế cao, đứng hàng thứ ba sau đậu tương lạc Cây đậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn, chu kỳ sinh trưởng kéo dài từ 60-90 ngày Mặt khác, yêu cầu kỹ thuật canh tác đơn giản, vốn đầu tư ít, thu hồi nhanh, trồng nhiều vụ năm nên người dân lựa chọn để canh tác diện tích rộng Trồng đậu xanh cịn có tác dụng cải tạo bồi đưỡng đất, cung cấp nguồn đạm sinh học quan trọng Quảng Nam có khí hậu nóng, mưa nhiều điều kiện thích hợp cho việc trồng đậu xanh Tuy nhiên, phát triển mạnh nấm gây bệnh làm ảnh hưởng đến suất chất lượng thu hoạch Do để khắc phục tình trạng trên, cần có biện pháp sinh học phịng trừ bệnh để kiểm soát gây hại chúng Xuất phát từ lý chọn đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces đối kháng với số vi nấm gây bệnh đậu xanh (Vigna radiate L.) xã Điện Hồng – Điện Bàn - Quảng Nam” MỤC T ÊU N ÊN CỨU Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng nấm Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces để tạo chế phẩm sinh học có khả đối kháng với vi nấm gây bệnh đậu xanh, làm sở cho việc ứng dụng chế phẩm sinh học vào thực tiễn địa phương NỘ DUN N ÊN CỨU Phân lập chủng vi nấm gây bệnh đậu xanh xã Điện Hồng - - Điện Bàn - Quảng Nam - Phân lập, tuyển chon chủng xạ khuẩn Streptomyces nấm Trichoderma có khả đối kháng với vi nấm gây bệnh đậu xanh xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam Lựa chọn mơi trường thích hợp để tạo chế phẩm thơ từ chủng nấm - Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces tuyển chọn Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm thô đối kháng với chủng vi nấm gây - bệnh đậu xanh Ý N ĨA K OA ỌC V T ỰC T ỄN CỦA Ề T - Tuyển chọn lưu giữ chủng xạ khuẩn Streptomyces nấm Trichoderma có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trồng phân lập xã Điện Hồng - Đại Lộc- Quảng Nam - Xác định số môi trường thích hợp có hiệu cao để lên men tạo chế phẩm Góp phần tạo sản phẩm cải tạo đất, chống bệnh cho trồng ứng dụng địa phương C ƢƠN TỔN QUAN T L ỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ X K UẨN 1.1.1 Cấu tạo xạ khuẩn Xạ khuẩn vi khuẩn Gram dương Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành khuẩn lạc Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có lớp: lớp ngồi có sợi bện chặt, lớp tương đối xốp, lớp có cấu tạo tổ ong Khuẩn ty lớp có hoạt tính sinh học khác Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác như: đỏ, da cam, vàng, nâu, tím, xanh … tùy thuộc vào lồi điều kiện mơi trường Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn phân biệt hướng sinh trưởng ngồi mặt mơi trường thạch tạo thành hệ sợi khí sinh (HSKS) hệ sợi chất (HSCC) Phần cuối HSKS thường biến thành cuống sinh bào tử có nhiều loại hình dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc đơn… Bào tử hình thành cuống sinh bào tử với phương pháp phân đoạn hay cắt khúc, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que Hình dạng kích thước cuống sinh bào tử, hình dạng, kích thước bề mặt bào tử tiêu chuẩn quan trọng phân loại xạ khuẩn [21] Xạ khuẩn thuộc loại thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng đường, tinh bột, rượu nhiều chất hữu khác Nguồn nitơ hữu protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vơ nitrat, muối amơn… khả đồng hóa chất loài hay chủng xạ khuẩn khác khác 1.1.2 Tình hình nghiên cứu CKS giới Việt Nam 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu CKS giới Năm 2007 từ mẫu đất phía đơng nam Serbia phân lập lồi XK Streptomyces hygroscopicus sinh CKS nhóm polyen có khả chống lại nấm Botrytis cinerea gây bệnh thối xám hại nho kháng virus Herpes simplex Tại Hàn Quốc phân lập loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất tiêu diệt tụ cầu kháng methicillin cầu khuẩn kháng vancomycin, kháng nấm gây bệnh thực vật Năm 2008 từ mẫu đất nông nghiệp Sarawak, Kuala Lumpur phân lập 62 XK thuộc chi Streptomyces có 37 chủng sinh CKS đối kháng với nhiều VSVKĐ: Fusarium palnivora, Bacillus subtilis, Ralstonia solanacerarum Làm sở để tạo CKS kháng nấm với vi khuẩn, hướng tới nông nghiệp sinh thái bền vững [25] Năm 2011, Thái Lan phân lập chủng XK Streptomyces cavurensis từ đất vùng rễ trồng ức chế chống lại nấm Collectotrichum spp, tác nhân gây bệnh thán thư Đã thu 304 chủng XK có 202 chủng có hoạt tính KS chiếm 73% kháng loại nấm mốc nấm men; 17,8% chống lại loại nấm gây bệnh thán thư [43] Mới nhất, tháng 01 năm 2012 Ấn Độ phân lập xác định đến loài XK Pseudonocardia azurea sp từ vùng đất trầm tích hệ sinh thái rừng ngập mặn Ninzampatnam vùng ven biển phía nam Andhra Pradesh Đây chủng xạ khuẩn tiết CKS azureomycin A B có hiệu chống nấm gây bệnh phạm vi rộng [42] 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu CKS Việt Nam Trường Đại học Tổng Hợp Hà Nội (nay thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội), Đại học Sư Phạm Hà Nội nghiên cứu phân bố, lên men chủng XK sinh CKS có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng từ đất Việt Nam Viện Khoa học Việt Nam nghiên cứu sản xuất khả ứng dụng chế phẩm Biovit, Teravit, Baxitraxin vào chăn nuôi bảo vệ trồng nông nghiệp Trong nhiều năm qua Trường Đại học Dược Xí nghiệp Dược thực hàng trăm thí nghiệm lên men CKS: Clotetraxillin, oxytetraxillin, erythromyxin, neomyxxin, dekamixin, fumajilin… thu kinh nghiệm định công nghệ sinh học công nghệ kháng sinh [11] Năm 2004, Kiều Hữu Ảnh xác định đến lồi chủng xạ khuẩn Streptomyces hygroscopius có khả sinh CKS chống nấm gây bệnh thực vật: 39 nuôi cấy cấp cấp sử dụng môi trường A4-H để nuôi lắc hai chủng xạ khuẩn XK XK 15, làm sở để tạo chế phẩm môi trường chất rắn XK 15 XK 02 XK 02 XK 15 Hình 3.20 Nhân giống xạ khuẩn môi trường A4-H tạo dịch cấp dịch cấp Hình 3.21 Chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces sản xuất phương pháp lên men xốp môi trường trấu cám Sau thu chế phẩm dạng bột tiếp tục thực thí nghiệm khảo sát khả đối kháng chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces với loại nấm Fusarium, Collectotrichum phịng thí nghiệm đĩa petri đậu xanh để kiểm tra khả kháng nấm chế phẩm 3.4.2 Lên men xốp chủng nấm Trichoderma Sử dụng chủng nấm Tri 03, Tri 07, có khả đối kháng mạnh với hai chủng nấm bệnh Fusarium Collectotrichum để tiến hành lên men xốp tạo chế phẩm Kết quan sát sinh trưởng phát triển nấm Trichoderma môi trường lên men xốp cho thấy sau ngày bào tử nấm Trichoderma bắt đầu xuất rãi rác, sang ngày thứ bào tử nấm Trichoderma phủ kín khắp mơi trường lên men xốp 40 Bảng 3.12 So sánh khả phát triển nấm Trichoderma qua công thức Công thức Khả sinh trƣởng 15g trấu + 15g cám gạo 70% 100% 15g trấu + 15g cám bắp 40% 80% Qua bảng 3.12 cho thấy tỉ lệ cám, trấu loại cám thành phần giá thể dùng để lên men xốp có ảnh hưởng đến số lượng bào tử nấm Trichoderma chế phẩm thu Trấu thành phần tạo bề mặt thông thống tạo điều kiện hiếu khí cho phát triển sinh bào tử nấm Trichoderma Tuy nhiên, tỷ lệ trấu nhiều có ảnh hưởng làm giảm số lượng bào tử chế phẩm Đồng thời, nấm Trichoderma phát triển tốt môi trường cám gạo so với cám bắp, điều giải thích dựa vào độ thống khí chất Cám bắp làm giảm độ thơng thống chất so với cám gạo, đưa dịch cấp vào mơi trường trấu : cám bắp, chất có độ kết dính cao nên làm giảm khả phát triển nấm Trichoderma, sau ngày, bào tử nấm phát triển bao phủ 40% môi trường Do đó, chúng tơi lựa chọn cơng thức trấu : cám gạo để lên men xốp tao chế phẩm kháng nấm gây bệnh đậu xanh Hình 3.22 Chế phẩm nấm Trichoderma sản xuất phương pháp lên men xốp sau ngày ngày nuôi cấy Sau thu chế phẩm dạng bột tiếp tục thực thí nghiệm khảo sát khả đối kháng chế phẩm Trichoderma với loại nấm Fusarium, Collectotrichum phịng thí nghiệm đĩa petri cà chua để kiểm tra khả kháng nấm chế phẩm 41 3.5 KẾT QUẢ K ỂM TRA K Ả NĂN Ố K ÁN CỦA C Ế P ẨM X K UẨN STREPTOMYCES V NẤM TRICHODERMA Ố VỚ NẤM BỆN Để đánh giá hiệu khả đối kháng chế phẩm thu được, tiến hành bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đối kháng với nấm bệnh nuôi đĩa petri thí nghiệm đối kháng với nấm bệnh lây nhiễm đậu xanh 20 ngày tuổi 3.5.1 Kết kiểm tra khả đối kháng chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces đĩa petri Sau tạo chế phẩm dạng bột, nhằm kiểm chứng hiệu kháng vi nấm gây bệnh đậu xanh trước thử nghiệm ngồi tự nhiên, chúng tơi tiến hành thử khả đối kháng chế phẩm xạ khuẩn Streptomyces dạng bột đĩa petri phương pháp đục lỗ Tiến hành lấy chế phẩm xạ khuẩn nuôi cấy môi trường trấu, cám nghiền thành bột, đem nuôi môi trường A4-H lỏng thời gian 5-6 ngày Thử hoạt tính với nấm gây hại đậu xanh phương pháp dịch thể để xác định hoạt tính kháng nấm chế phẩm Tóm tắt quy trình: Mơi trường dịch thể A4-H ni lắc 5-6 ngày Chế phẩm xạ khuẩn dạng bột Chiết dịch thử hoạt tính với vi nấm gây bệnh phương pháp đục lỗ Bảng 3.13: So sánh khả phát triển xạ khuẩn qua công thức Thời gian Khả ức chế nấm bệnh chế phẩm xạ khuẩn (mm) nuôi lắc Aspergillus Fusarium Collectotrichum Rhizoctonia 3- ngày 12 5-7 ngày 20 19 14 19 Qua bảng 3.13 cho thấy, chế phẩm sau nuôi lắc mơi trường dịch thể có khả sinh chất kháng sinh môi trường nuôi cấy, đối kháng với chủng nấm gây bệnh đậu xanh Trong q trình ni, thời gian ni cấy yếu tố định đến khả sinh chất kháng sinh chế phẩm, thời gian 3-4 ngày nuôi cấy, thời kỳ chủng xạ khuẩn sinh trưởng mạnh 42 mơi trường sau bắt đầu tiết nhiều chất kháng sinh môi trường, khoảng 5-7 ngày thời gian mà lượng chất kháng sinh đủ để diệt nấm bệnh Vì vậy, trình sử dụng chế phẩm thực tiễn, cần cung cấp vào đất giai đoạn đầu, lúc khả kháng bệnh cao hơn, tỉ lệ nhiễm bệnh thấp NB1 NB2 NB4 Hình 3.23 Khả đối kháng chế phẩm nấm bệnh gây hại đậu xanh đĩa petri sau ngày nuôi cấy 3.5.2 Kết kiểm tra khả đối kháng chế phẩm nấm Trichoderma nấm Collectotrichum (gây bệnh thán thư) đĩa petri Kết theo dõi khả đối kháng chế phẩm nấm Trichoderma nấm bệnh Collectotrichum thể qua bảng 3.14 Bảng 3.14 : ƣờng kính khuẩn lạc nấm bệnh Collectotrichum sau rắc chế phẩm nấm Trichoderma ƣờng kính khuẩn lạc ƣờng kính khuẩn lạc nấm nấm bệnh Fusarium đối bệnh Fusarium rắc chế chứng (mm) phẩm (mm) 20 20 38 30 69 30 76 26 95 Ngày nuôi Hiệu ức chế 100% Qua kết bảng 3.14 cho thấy: ngày đầu tiên, nấm Collectotrichum phát triển bình thường Sang ngày thứ 2, sau rắc chế phẩm Trichoderma, nấm 43 Trichoderma chế phẩm phát triển đan xen sợi nấm vào nấm Collectotrichum xuất rãi rác bào tử thể tính đối kháng nhẹ làm nấm Collectotrichum phát triển chậm lại Sang ngày thứ 3, nấm Collectotrichum không phát triển thêm nữa, bào tử nấm Trichoderma mọc khắp đĩa, nấm Trichoderma ký sinh lên nấm Collectotrichum hạn chế tối đa phát triển nấm bệnh làm đường kính nấm bệnh không tăng thêm, sợi nấm bệnh thưa dần Ngày thứ 4, bào tử nấm Trichoderma mọc mạnh , ký sinh lên nấm bệnh nhiều hơn, diện tích nấm bệnh bị thu hẹp dần Đến ngày thứ 5, bào tử nấm Trichoderma mọc mạnh, phủ kín khắp đĩa thạch, nấm bệnh bị ức chế hoàn toàn Hiệu ức chế sau ngày nuôi cấy đạt 100% Hình 3.24 Khả đối kháng chế phẩm nấm Trichoderma đốivới nấm bệnh Collectotrichum qua ngày 3.5.3 Kết kiểm tra khả đối kháng chế phẩm nấm bệnh Collectotrichum gây bệnh đậu xanh Do thời gian điều kiện làm luận văn có hạn nên chúng tơi chọn thử nghiệm khả đối kháng chế phẩm đậu xanh với nấm bệnh Collectotrichum gây bệnh thán thư Chỉ tiêu theo dõi ghi nhận số bệnh thán thư, số đậu xanh chết nấm bệnh thời điểm 3, 10 15 ngày sau lây nhiễm nấm bệnh Kết theo dõi trình thí nghiệm sau: 44 - iai đoạn 1: kết chưa lây nhiễm nấm bệnh thể qua hình 3.25 Hình 3.25 Cây đậu xanh 15 ngày tuổi cơng thức thí nghiệm Qua hình 3.25 cho thấy: đậu xanh công thức xanh tốt Cây đậu xanh CT 3, CT phát triển nhanh tốt so với hai cơng thức CT 1, CT đất CT 3, CT xử lý chế phẩm Trichoderma chế phẩm xạ khuẩn, nấm Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces: bên cạnh tác động qua lại quần thể nấm đối kháng nấm bệnh, có tác động trực tiếp lên phát triển trồng, hoạt động sống, sản sinh men phân hủy glucoza, xenluloza Nhờ men mà chất hữu có đất phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất dinh dưỡng dạng dễ hấp thụ cho trồng, tạo điều kiện cho trồng sinh trưởng phát triển tốt - iai đoạn 2: sau lây nhiễm nấm bệnh Collectotrichum, nấm bệnh đưa vào đất CT 2, CT CT Kết nghiên cứu khả đối kháng chế phẩm dạng bột nấm bệnh Collectotrichum đậu xanh 15 ngày tuổi trình bày bảng 3.15 hình 3.26 Bảng 3.15: Số lƣợng mắc bệnh chết công thức sau lây nhiễm nấm bệnh Thời gian Chỉ tiêu theo dõi Số có xuất vết đen, bị vàng Sau ngày Số chết Số có xuất vết đen, Sau 10 bị vàng ngày Số chết Số có xuất vết đen, Sau 15 bị vàng ngày Số chết Số công thức CT CT CT CT 18 0 0 31 12 0 35 50 26 50 50 50 45 Qua bảng 3.15 cho thấy: sau ngày lây nhiễm nấm bệnh: đậu xanh cơng thức phát triển bình thường, CT có 18 xuất vàng chiếm 36% Sau 10 ngày lây nhiễm chủng nấm bệnh: đậu xanh CT 1, CT CT phát triển bình thường, xanh tốt Cây đậu xanh CT bị còi cọt, chậm phát triển có tượng vàng lá, xuất đốm đen Quan sát thân, rễ bị vàng dễ dàng nhận thấy đám nấm Collectotrichum quanh gốc gây bệnh xuất Hình 3.26: Nấm Collectotrichum xuất xung quanh gốc đậu xanh CT sau 10 ngày lây nhiễm nấm bệnh Sau 15 ngày lây nhiễm nấm bệnh: đậu xanh CT CT phát triển bình thường, xanh tốt vượt trội Ở CT xuất bị vàng lá, xuất vệt đốm đen xung quanh giống triệu chứng bệnh Collectotrichum gây nên, đất trồng có sẵn mầm bệnh Cây CT số bị héo lá, thối vùng gốc khô héo (26 cây) 35 bị đốm đen, héo rũ (chiếm 70,00%) Các cịn lại khơng phát triển thêm chiều cao, thân nhỏ dễ đổ ngã Ở CT CT 4, đậu xanh phát triển xanh tốt, tốc độ phát triển gần tương đương nhau, số lượng nhiều, thân cao lớn 46 Sau thời gian nhiễm bệnh, rễ bị mục khô héo Các vết bệnh xuất nhiều đậu xanh Hình 3.27 Biễu bệnh đậu xanh CT2 sau 10 ngày lây nhiễm nấm bệnh Hình 3.28 Cây đậu xanh CT 3, CT sau 15 ngày lây nhiễm nấm bệnh Qua kết nghiên cứu cho thấy chế phẩm Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces dạng bột xử lý đất trước gieo trồng có khả đối kháng với nấm bệnh Collectotrichum gây bệnh thán thư tốt Bên cạnh đó, chế phẩm cịn kích thích, tạo điều kiện cho trồng phát triển tốt hơn, xử lý đất chế phẩm Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces trước gieo trồng phịng trừ nấm bệnh tăng cường phát triển cho Như vậy, theo điều kiện sinh thái đất trồng màu tỉnh Quảng Nam kết khả đối kháng nấm Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces, chế phẩm nấm cho thấy: Nếu sử dụng chế phẩm cho vào đất trước gieo trồng hạn chế nấm bệnh gây hại rau, màu 47 KẾT LUẬN V K ẾN N Ị KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu chúng tơi có số kết luận sau: 1.1 Phân lập 04 chủng vi nấm gây hại đậu xanh thuộc chi, bao gồm chi Aspergillus, Fusarium, Collectotrichum Rhizoctonia 1.2 Phân lập 14/32 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh tiếp tục tuyển chọn chủng: XK 02 XK 15 có hoạt tính kháng sinh mạnh để nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học diệt nấm gây bệnh đậu xanh 1.3 Phân lập 09 chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng với nấm gây bệnh đậu xanh, nghiên cứu khả đối kháng với nấm bệnh Fusarium, Collectotrichum tiến hành chọn chủng nấm Tri 03 Tri 07 để nhân sinh khối tạo chế phẩm 1.4 Nhân giống chủng xạ khuẩn XK 02 XK 15 nấm Tri 03 Tri 07 môi trường trấu : cám thu chế phẩm dạng bột Tiến hành đối kháng thử nghiệm chế phẩm tạo phòng thí nghiệm với nấm bệnh đậu xanh ứng dụng thử nghiệm chế phẩm đậu xanh điều kiện tự nhiên cho kết tốt, sở khoa học để ứng dụng vào thực tiễn K ẾN N Ị 1.1 Tiếp tục nghiên cứu điều kiện giữ giống xạ khuẩn nấm Trichoderma để giữ nguyên hoạt tính thời gian dài 1.2 Nghiên cứu chất mang tối ưu để tạo chế phẩm có hoạt tính mạnh nhất, bảo quản lâu dài mang hiệu kinh tế cao 1.3 Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm, ứng dụng đối kháng với nấm bệnh nhiều trồng khác 48 T T L ỆU T ẾN L ỆU T AM K ẢO V ỆT [1] Kiều Hữu Ảnh (1999), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr 32 - 35 [2] Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2005) Giáo tình nấm học, Đại học Cần Thơ [3] Burgess L.V, Knight T.E, Tesorio L., Phan Thúy Hiền (2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam, Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210pp, ACIAR [4] Tạ Kim Chi (1996), Nghiên cứu số chủng vi nấm diệt côn trùng gây hại Việt Nam khả ứng dụng, luận án PTS, Viện công nghệ Sinh học, Trung tâm Khoa Học Tự nhiên Công nghệ quốc gia, Hà Nội [5] Bùi Xuân Đồng (1982), Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam, Tập I, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [6] Egorov, N.X Thực hành VSV học (Người dịch Nguyễn Lân Dũng, 1983), NXB Mir.Matxcova, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội [7] Đỗ Thu Hà, (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh CKS chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam - Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội, tr.40 - 61 [8] Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội [9] Đỗ Tiến Hoàng (2007), Nghiên cứu bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum) hại số trồng cạn vụ hè thu năm 2007 vùng Gia Lâm - Hà Nội thử nghiệm chế phẩm sinh học phịng trừ bệnh, Khoa Nơng học - ĐH Nông Nghiệp Hà Nội [10] PGS.TS Phạm Thị Ánh Hồng, ThS.Đinh Minh Hiệp (2005), Điều tra khảo sát phân bố chủng nấm Trichoderma thành phố Hồ Chí Minh 49 tỉnh Đơng Nam Bộ, Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam năm 2005 [11] Lê Gia Hy, Nguyễn Đình Lạc, Ngơ Đình Quang Bính, Cao Minh Kiểm, Nguyễn Quỳnh Châu, Phạm Kim Duy, Lê Thanh Bình, (1983), Nghiên cứu sản xuất ứng dụng Biovit chăn nuôi, Báo cáo tổng kết đề tài 48-01-03-03, Viện Khoa học Công nghệ [12] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh [13] Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề (1998), Giáo trình bệnh nơng nghiệp, Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội [14] KS Dương Hữu Thời, PTS Dương Thanh Liêm, PTS Nguyễn Văn Uyển (1982) Cây họ Đậu nhiệt đới làm thức ăn gia súc NXB TPHCM, tr 78 [15] Trần Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng (1995), “Kết nghiên cứu bước đầu nấm đối kháng Trichoderma”, Tuyển tập Cơng trình nghiên cứu Bảo vệ Thực vật 1990-1995, tr 202-210 [16] Trần Thị Thuần (1998), “Hiệu đối kháng nấm Trichoderma nấm để phòng trừ bệnh hại trồng bệnh hại trồng”, Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật 4, tr.35-38 [17]Nguyễn Ngọc Tú Nguyễn Thị Hương Giang (1997), Bảo vệ trồng từ chế phẩm từ vi nấm, Nhà xuất Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh, tr.111-153 50 T L ỆU T ẾN NƢỚC N O [18] Andre Drenth and Barbara Senlall (2008), Practical guide to detection and identification of Phytophthora, CRC for Tropical Plant Protection Brisbane Australia, Version [19] Arie Altman (1998), Agricutural biotechnology, Marcel Dekker, Inc- New York- Basel HongKong, p.263-275 [20] von Arx JA (1957), Die Arten der Gattung Colletotrichum Cda Phytopathol, Zeitschrift, pp 413-468 [21] Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol.4 (1989) [22] Bertrand, K.G and Jack, J P (1998) Molecular biotechnology principles and application of recombinant DNA, 2nd edition, ASM Press Washington, D C.potential for biocontrol Ann Rev Phytopath, 23: 23-54 [23] Burgess, L.W and Summerell, B.A (1992), Mycogeography of Fusarium: survey of Fusarium species in subtropical and semi-arid grasslands soils in Queensland, Mycological Research 96: 780-784 [24] Chet R.J., and Baker K F (1980), The Nature and Practice of Biological Coltrol of plant Pathogens, American Phythopathological Society, St Paul, MN 539 pp [25] Crawford D.L., Lunch J.M., Whipps J.M., Ousley M.A.,(2008), “Isolation and characterization of actinomycetes antagonists of fungal root pathogen”, Appl Environ Microbiol 1993, 59, pp 3899-3905 [26] C-T Lo, EB Nelson, GE Harman (1996), Biological control of turfgass diseases with a rhizosphere competent strain of Trichoderma harzianum, Plant Dis 80, pp 736-714 [27] Elad Y (2000) Trichodema harzianum T39 preparation for biocontrol of plant diseases – control of Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum and Cladosporium fulvum Biocontrol Science and Technology 10: 499–507 51 [28] Esposito, E and Silva, M D (1998), Systematics and enviromental application of the genus Trichoderma, Crical reviews in Microbiology 24 (2): 89-98 [29] G F Gauze T.P Prebrazenskai M.A Sresnicora P P Terekhova (1983), 158 [30] Harman, G E and Kubicek, C P (ed) (1998), Trichoderma and Gliocladium, Vol I, Basic biology, taxonomy and genetics, p.6-10, 64-69 [31] Harman, G E and Kubicek, C P (ed) (1998), Trichoderma and Gliocladium, Vol II, Enzymes, biological control and commercial applcations, p.131142 [32] Harman, G E (2000), Myths and dogmas of biocontrol Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22, Plant Dis., pp 84 [33] Harindran J., Chakraborty KK., Naik SR (1999), “Preparation relative toxicity and therapeutic, efficacy in mice rats of liposomal HA-1-92, a new oxohexaene polyene macrolide antibiotic”, National Library of medicine, Internet information, pp 131-132 [34] Krasilnhirov’s (1958) Marwal of systematic Bacteriology and Streptomycetes (1957) [35] Klein D, Eveleigh DE (1998), Ecology of Trichoderma , In: Kubicek CP, Harman GE, editors, Trichoderma and Gliocladium, Vol 1, Basic Biology, Taxonomy and Genetics, London: Taylor and Francis Ltd, pp 57–74 [36] L KREDICS et al (2003), Trichoderma Strains with Biocontrol Potential, Food Technol, Biotechnol, pp 37–42 [37] Newman D.J, Cragg G.M, Snader K.M (2003), “Natural products as ourees of new drugs over the period”, J Nat Prod, 66, pp 1022 - 1037 [38] Papavizas (1985), Trichoderma and Gliocladium: Biology, ecology, and [39] Shirling E.B, Gotilieb D (1966), “Methods for characterization of Streptomyces spectes”, International Bacteriology, 16(3), pp 313 - 340 Journal of Systematic 52 [40] S B Ilic, S S Konstantinovic, Z B Todorovic, M L Lazic (2007), “Characterization and Antimicrobial Activity of the Bioactive Metabolites in Streptomycetes Isolates”, ISSN 0026-2617, Microbiology, 76(4), pp 421- 428 [41] Trerner, H.D, Buckus E.J (1963), “System of color wheels for Streptomyces taxonomy”, Appl Microbiol, 11, pp 335 - 338 [42] Usha K M., Vijayalakshmi M., Sudhakar P., Sreenivasulu K (2012), “Isolation, Identification and molecular Characterization of Rare Actinomycetes from Mangrove Ecosystem of Nizampatnam”, Malaysian Journal of Microbiology, 8(2), pp 83-91 [43] Watanalai Panbangred, (2011), “Identification of actinomycetes from plant rhizospheric soils with inhibitory activity against Colletotrichum spp., the causative agent of anthracnose disease”, BMC Reasearch Notes, 4, pp 98 [44] Y Igarashi, T Iwashita T Fujita, H Naoki, T yamakawa, R Yoshida, and T Furuma (2003), Cletheramycin, a new inhibitor of polyen tobe growth with antifungal activity from Streptomyces hygroscopicus TP- A0623.II Physico - chemical properties and structure determination, National Library of medicine, Internet information, pp 90 - 92 53 ... phát từ l? ? chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces đối kháng với số vi nấm gây bệnh đậu xanh (Vigna radiate L. ) xã Điện Hồng – Điện. .. cho vi? ??c ứng dụng chế phẩm sinh học vào thực tiễn địa phương NỘ DUN N ÊN CỨU Phân l? ??p chủng vi nấm gây bệnh đậu xanh xã Điện Hồng - - Điện Bàn - Quảng Nam - Phân l? ??p, tuyển chon chủng xạ khuẩn Streptomyces. .. Streptomyces nấm Trichoderma có khả đối kháng với vi nấm gây bệnh đậu xanh xã Điện Hồng - Điện Bàn - Quảng Nam L? ??a chọn mơi trường thích hợp để tạo chế phẩm thơ từ chủng nấm - Trichoderma xạ khuẩn Streptomyces