Bài viết trình bày về vi khuẩn Salmonella typhimurium được phân lập từ nước thải, nhận từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, được nuôi trên môi trường nước pepton.
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ NGHIÊN CỨU GEN CĨ VAI TRÕ CHẨN ĐỐN VI KHUẨN SALMONELLA TYPHIMURIUM Hà Thị Quyến1, Hoa Thị Minh Tú2 Trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngày nay, nghiên cứu phát triển phương pháp sinh học phân tử để phát loài vi khuẩn gây bệnh tồn môi trường thực phẩm phổ biến phương pháp lai miễn dịch phương pháp dựa ADN (lai ADN-ADN, lai ADN-ARN, DNA array, PCR ), có chẩn đốn dựa lai phân tử PCR phát triển ứng dụng rộng rãi lĩnh vực thực phẩm môi trường Các chẩn đoán dựa DNA dựa nguyên tắc xác định xem có mặt hay vắng mặt gen đặc trưng cho lồi vi khuẩn (hay cịn gọi gen có vai trị chẩn đốn) (Center for food safety & Applied Nutrition, 2001) Đối với định hướng phát triển phương pháp phân tử chẩn đốn vi sinh vật gây bệnh bước phân lập, tạo dịng gen đích bước khởi đầu khơng thể thiếu Nhờ có ngun liệu gen đích tinh sử dụng cho nghiên cứu phục vụ cơng tác chẩn đốn, giám sát vệ sinh, an tồn, đồng thời phát triển kit sử dụng chẩn đoán, phát nguyên bệnh Các loài vi khuẩn gây bệnh tồn nguồn nước sinh hoạt, môi trường nuôi trồng thủy sản, thức ăn, Từ lây nhiễm vào nguồn thức ăn cho người động vật gây nên ngộ độc thực phẩm Trong số vi khuẩn phải kể đến vi khuẩn phổ biến Salmonella spp, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,… (Phan 2001; Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, 2003) Trong đó, vi khuẩn Salmonella tìm thấy nơi có động vật sinh sống nước, đất, côn trùng, bề mặt nhà máy, nhà bếp, phân động vật, thịt sống, gia cầm sống, đồ hải sản tươi sống,… Hầu hết typ huyết có khả nhiễm vào động vật máu nóng số nhỏ gây bệnh cho người Salmonella gây nhiều triệu chứng bệnh sốt thương hàn, nhiễm trùng máu, viêm ruột kết nhiễm trùng quan nội tạng (Zhou et al., 1999) Để gây bệnh, Salmonella cần phải xâm nhiễm thành công vào bên thành ruột, thích nghi vơ hiệu hố hệ thống phịng vệ vật chủ, sau nhân lên phát tán đến mơ đích (Fierer and Guiney 2001) Salmonella mang cụm gen inv (invasion) giúp cho trình xâm nhiễm vào thành ruột người động vật, mở đầu tiến trình gây bệnh invA gen ln có mặt hệ thống gen inv Gen invA có vai trị việc xâm nhiễm vào tế bào biểu mơ chứng minh có mặt rộng rãi 245 chủng Salmonella spp khác phân lập từ người, gà, nước thải Do vậy, gen invA thường chọn gen đích việc phát Salmonella spp (Galan et al., 1992; Ohl and Miller 2001) I PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vi khuẩn Salmonella typhimurium phân lập từ nước thải, nhận từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, nuôi môi trường nước pepton Khuếch đại gen đích PCR ADN vi khuẩn Salmonella typhimurium tách chiết sau: (1) Ly tâm huyền dịch vi khuẩn, loại bỏ dịch nổi; (2) Cặn tế bào hoà lại dung dịch đệm TE 10:1 (Tris.Cl + EDTA); (3) Bổ sung SDS 10% (sodium dodecyl sulfate) 897 TIỂU BAN ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ BẢO TỒN proteinaza K , đảo đều, ủ 37oC sau để phá vỡ tế bào loại bỏ protein; (4) Bổ sung NaCl 5M, đảo đều, ủ 65oC 10 phút; (5) Chiết ADN dung dịch chloroform : isoamylalcohol (24:1) phenol; (6) Ly tâm thu dịch nằm lớp xác tế bào; (7) Chiết lại ADN chloroform : izoamylalcohol (24:1) phenol; (8) Tủa ADN cách bổ sung NaOAc 3M, cồn 100% giữ -20oC tối thiểu giờ; (9) Ly tâm loại bỏ dịch nổi, rửa cặn ADN cồn 70%, làm khô ADN; (10) Hoà lại cặn đệm TE chứa ARNaza (100 g/ml), ủ 37oC để loại ARN; (11) Nồng độ độ ADN xác định phổ hấp phụ máy quang phổ tử ngoại điện di gel agaroza 1% Chu trình nhiệt PCR nhân gen invA: 94oC phút; lặp lại 35 chu kỳ: (94oC 30 giây, 55oC 40 giây, 72oC phút 20 giây); 72oC phút; kết thúc 4oC Tạo dòng mang gen invA Tạo dòng sản phẩm PCR tiến hành cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 sử dụng sinh phẩm hãng Invitrogen Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dịng pCR2.1: l H2O khử ion vơ trùng + l dung dịch đệm T4-ligaza + l sản phẩm PCR + l vectơ pCR2.1 mở vòng + l T4 ligaza Phản ứng ủ 14oC qua đêm đảm bảo nhiệt độ cho T4-ligaza hoạt động Sản phẩm PCR gen gắn với vectơ tạo nên ADN plasmid (plasmid tái tổ hợp) Các ADN plasmid biến nạp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α Nuôi cấy chủng mơi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin X-gal, IPTG qua đêm 37oC.Để thu nhận plasmid tái tổ hợp, ADN plasmid tách chiết lại từ tế bào vi khuẩn biến nạp kiểm tra cách cắt với enzym hạn chế Tinh ADN plasmid đọc trình tự gen ADN plasmid tinh S.N.A.P Miniprep kit theo quy trình nhà sản xuất Trình tự ADN xác định máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) với kit BigDye Terminater v.3.1 Cycle Sequencing Kit hãng Applied Biosystems II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Khuếch đại gen invA Salmonella typhimurium 12 1357 947b bp p ~1350 bp Hình 1: Điện di sản phẩm PCR gen invA Salmonella typhimurium Kênh 1: Chỉ thị ADN chu n; Kênh 2: Sản ph m PCR gen invA 898 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Dựa trình tự invA Salmonella typhimurium công bố Genbank, sử dụng phần mềm Primer plus để thiết kế cặp mồi khuếch đại gen invA Mồi cho PCR để nhân gen invA thiết kế có trình tự nucleotit sau: invA1 CGAAGCGTACTGGAAAGGGA invA2 ATCAGAGGCTTCCGTGTCAA Sản phẩm PCR đặc hiệu chứa gen invA có chiều dài khoảng 1350 bp Trên hình 1, kết điện di cho thấy sản phẩm PCR xuất băng có kích thước khoảng 1350 bp tương đương với tính tốn theo lý thuyết Như vậy, cặp mồi invA invA thiết kế đặc hiệu sản phẩm PCR thu cho băng Tạo dòng vi khuẩn mang gen invA Để tách dịng gen invA, chúng tơi sử dụng vectơ pCR 2.1 có kích thước 3,9kb Các sản phẩm PCR gen invA gắn riêng rẽ vào vectơ pCR 2.1 biến nạp vào E coli chủng DH5 Plasmid tái tổ hợp tách chiết từ huyền dịch E coli kiểm tra cách xử lý với enzym cắt hạn chế Dựa vào đặc điểm thuận lợi vectơ pCR 2.1 có mang hai vị trí cắt enzym EcoR I nằm liền kề hai bên vị trí cắt mở vịng nên chúng tơi sử dụng EcoR I để kiểm tra kết tạo dòng Nếu sản phẩm PCR gắn vào vectơ xử lý EcoR I xuất hai băng, băng có kích thước kích thước sản phẩm PCR Kết minh chứng hình 12345 pCR2.1 PCR gen invA Hình 2: Điện di sản phẩm ADN plasmid mang gen invA sau cắt EcoR I Kênh 1, 2: ADN plasmid mang gen invA cắt EcoR I; Kênh 3: pCR2.1; Kênh 4: Sản ph m PCR gen invA; Kênh 5: Chỉ thị ADN chu n Kết điện di hình cho thấy sau plasmid tái tổ hợp xử lý EcoR I xuất hai băng, băng tương ứng với kích thước vector pCR2.1 (3,9kb), băng tương ứng với kích thước sản phẩm PCR gen invA (1350bp) Đọc phân tích so sánh trình tự gen Để kiểm tra dịng vi khuẩn tạo có mang gen invA mong muốn hay khơng, chúng tơi tiến hành đọc trình tự nucleotit sản phẩm PCR gen invA so sánh chúng với trình tự tương đồng Genebank Trình tự nucleotit đoạn gen tạo dòng so sánh với trình tự tương đồng Genebank, số đăng ký M90846.1 (Galan et al,1992) 899 TIỂU BAN ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ BẢO TỒN invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 900 CGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTT 60 ATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATT 120 TCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTGGTCCTCCGCCCTGTCTACTTATACCATG ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| TCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTACTTATACCATG 180 CTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC 240 GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACG 300 CAGCTGTTGAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGATATTTTGACCATTTCAATGGGA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| CAGCTGTTGAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGA 360 ACTCTGCCGGGATTCCCACTGCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTCTGCCGGGATTCCCACTGCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTC 420 TTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGC 480 GAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTAGGACTGATTGGCGATCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTAGGACTGATTGGCGATCTC 540 GATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCCGGCGTGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCCGGCGTGAA 600 GATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC 660 GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTA TTGTTGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGTTGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTG 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 720 1320 780 1380 GTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGT 840 AGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAAGAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAAGAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTAT 900 GTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGGCGGTGACCGTGGCGCGCAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGGCGGTGACCGTGGCGCGCAAC 960 GTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACTGGAAGCGAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACTGGAAGCGAAA 1020 1440 1500 1560 1620 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 invA invA.M90846 TTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT 1080 TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCG 1140 CTCGCATTGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCGCATTGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGA 1200 GCAATGGCGCGTTATATTTGTCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCAATGGCGCGTTATATTTGTCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATG 1260 GTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACC 1320 TTCCTCAGCCTTGACACGGAAGCCTCTGAT |||||||||||||||||||||||||||||| TTCCTCAGCCTTGACACGGAAGCCTCTGAT 1680 1740 1800 1860 1920 1350 1950 Identities = 1348/1350 (100%), Gaps = 0/1350 (0%; Strand=Plus/Plus Hình 3: So sánh trình tự invA tạo dịng với trình tự tƣơng đồng Genebank Kết so sánh công cụ blast NCBI cho thấy hai trình tự có tương đồng nucleotit 100% Như vậy, với kết đọc so sánh trình tự nucleotit đoạn gen invA tạo dịng với trình tự tương đồng Genebank cho thấy chúng tơi tạo dịng vi khuẩn mang xác gen invA III KẾT LUẬN Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc nhân gen invA Salmonella typhimurium, cặp mồi tiếp tục nghiên cứu phát triển cho định hướng chế tạo kit chẩn đoán Đã tạo dòng vi khuẩn mang gen invA Các dòng lưu giữ để cung cấp nguyên liệu ADN cho nghiên cứu ứng dụng sau TÀI LIỆU THAM KHẢO Center for food safety & Applied Nutrition, 2001 Bacteriological Analytical Manual Online: Identification and Foodborne Bacterial pathogens by gene probes Chapter 24 Fierer J., Guiney D G., 2001 Diverse virulence traits underlying different clinical outcomes of Salmonella infection The Journal of Clinical investigation, 107(7): pp 775780 Galan J.E., Ginocchio C and Costeas P., 1992 Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family J Bacteriology, 174 (13): 4338-4349 Ohl M.E., and Miller S I., 2001 Salmonella: A model for bacterial pathogenesis Annual Review of Medicine, 52: 259-274 Phan T K., 2001 Foodborne Diseases, Youth Publisher, 5-38 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, 2003 Thống kê bệnh truyền nhiễm 1993-2003.Nxb Y học 901 TIỂU BAN ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ BẢO TỒN Zhou D., Hardt W D., Galan J E, 1999 Salmonella typhimurium encodes a putative iron transport system within the centisome 63 pathogenicity island Infection and Immunity 67: 1974-1981 STUDY ON GENE FOR DIAGNOSIS OF SALMONELLA TYPHIMURIUM Ha Thi Quyen, Hoa Thi Minh Tu SUMMARY Research and detection of genes having function for diagnose pathogenic bacteria are essential for environmental and safe food surveillance In this study, we designed specific primers and constructed a thermal cycle to amplify the specific fragment of the invA gene that encodes the protein invasion of Salmonella typhimurium, having function for infection to the host In addition, the bacterial clones containing invA gene has been cloned The exact determination of the invA gene in this report was confirmed by nucleotide sequencing and compared to homology sequences in Genbank The results of this study could be used to develop a Salmonella Diagnostic Kit using PCR And the clones containing the invA gene would be stored to provide target genes for continuing studies 902 ... dịng vi khuẩn mang xác gen invA III KẾT LUẬN Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho vi? ??c nhân gen invA Salmonella typhimurium, cặp mồi tiếp tục nghiên cứu phát triển cho định hướng chế tạo kit chẩn đoán. .. NGHIÊN CỨU Khuếch đại gen invA Salmonella typhimurium 12 1357 947b bp p ~1350 bp Hình 1: Điện di sản phẩm PCR gen invA Salmonella typhimurium Kênh 1: Chỉ thị ADN chu n; Kênh 2: Sản ph m PCR gen. .. sản phẩm PCR gen invA (1350bp) Đọc phân tích so sánh trình tự gen Để kiểm tra dịng vi khuẩn tạo có mang gen invA mong muốn hay không, tiến hành đọc trình tự nucleotit sản phẩm PCR gen invA so