Nghiên cứu quy trình chiết xuất chlorophyll từ phân tằm

SCIENCE - TECHNOLOGY P-ISSN 1859-3585 E-ISSN 2615-9619 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CHLOROPHYLL TỪ PHÂN TẰM STUDY ON EXTRACTION PROCESS OF CHLOROPHYLL FROM SILKWORM FERTILIZER Phạm Quỳnh Trang1,3, Đỗ Trung Sỹ1, Trần Hữu Quang1, Hồng Thị Bích2, Phạm Thị Hồng Minh2, Vũ Minh Quang3, Nguyễn Thị Hương3,* TÓM TẮT Chlorophyll sản phẩm trình quang hợp tự nhiên, có nhiều ứng dụng đời sống Tách chiết chlorophyll từ phân tằm mang lại hiệu kinh tế cao Bằng phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll Lichtenthaler H.K., nhóm nghiên cứu xác định hàm lượng chlorophyll tổng 0,598%, yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chiết chlorophyll: Hệ dung môi acetone: NH4OH 9/1, v:v, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết 5% (w/v), nhiệt độ chiết khoảng 25 - 30oC, thời gian ủ mẫu 24h, trình chiết thực bóng tối Từ khóa: Chlorophyll, phân tằm, chiết xuất ABSTRACT Naturally occurring chlorophyll with many applications is a photosynthetic product Chlorophyll derivatives derived from silkworm fertilizer have generated the high economic values A study conducted by Lichtenthaler H.K et al, revealed that the total chlorophyll content reaches up to 0.598% from silkworm fertilizer with the optimized conditions, including acetone: NH4OH (9:1, v/v), 5% of material/ solvent ration (w/v), 24h extraction treatment in room temperature and dark Keywords: Chlorophyll, silkworm fertilizer, extract Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội * Email: Huongphap2016@gmail.com Ngày nhận bài: 25/01/2020 Ngày nhận sửa sau phản biện: 25/6/2020 Ngày chấp nhận đăng: 26/02/2021 gian, cịn có tác dụng chữa bệnh tiểu đường [1] Trong trình tiêu hóa tằm, chlorophyll khơng bị tiêu hóa đào thải theo đường phân Vì phân tằm hàm lượng chlorophyll cao nhiều so với nguyên liệu thực vật, rong tảo thông thường Tách chiết chlorophyll từ phân tằm khơng có ưu điểm nguyên liệu dồi dào, không bị giới hạn thời gian mùa vụ mà cịn tốn dung mơi hóa chất có hiệu kinh tế cao, đồng thời kết hợp thu nhận hoạt chất q khác Có nhiều phương pháp tách chiết chlorophyll từ phân tằm công bố Một số nghiên cứu nhóm tác giả Deng Xiangyuan cộng [14] tách chiết chlorophyll phương pháp siêu âm 50oC, 60 phút Nồng độ chlorophyll thu 13,825 mg/l Mặt khác nhóm tác giả tách chiết chlorophyll chiếu xạ vi sóng với hệ dung môi acetone/ethanol = 2/1, áp suất 0,4MPa, công suất 300W thời gian chiếu xạ 50 giây Nồng độ chlorophyll đạt 14,325mg/l [15] Tuy nhiên nước ta cơng trình nghiên cứu khai thác tách chiết chlorophyll từ phân tằm Trong khuôn khổ nghiên cứu chúng tôi, số dung môi khác điều kiện tách chiết khác đưa vào thử nghiệm Thông qua kết thực nghiệm, ảnh hưởng điều kiện tách chiết khác đánh giá so sánh, từ rút điều kiện phù hợp sử dụng để tách chiết chlorophyll từ phân tằm, làm sở khoa học cho việc xây dựng quy trình tách chiết chlorophyll quy mô lớn NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MỞ ĐẦU 2.1 Nguyên liệu Chlorophyll nhóm chất màu tự nhiên phong phú nguồn chất màu xanh cho tất loài thực vật, tảo, vi khuẩn lam, thành phần hệ quang hợp xanh vi khuẩn quang hợp [3] Chlorophyll ứng dụng phổ biến thực phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nano điều trị ung thư [4, 6] Đặc biệt gần thu hút quan tâm nhà khoa học việc ứng dụng loại thuốc quang trị liệu [10] Phân tằm thu mua Vũ Thư - Thái Bình vào mùa xuân hè (tháng 2-6) tằm lớn Phân tằm tươi hạt mềm, đường kính 4mm Phân tằm tươi phơi khơ ánh nắng mặt trời giữ nơi khô Sau chuyển đến sở nghiên cứu, phân tằm sàng lọc loại bỏ tạp chất, đóng túi ni lông 50g/túi, hút chân không bảo quản -18oC Phân tằm (Tàm sa, tám mễ) có tên khoa học Silkworm Fertilizer vị thuốc dùng nhiều dân Website: https://tapchikhcn.haui.edu.vn Các chất chuẩn chlorophyll a, chlorophyll b mua hãng Sigma - Aldrich, độ tinh  95% Vol 57 - No (Feb 2021) ● Journal of SCIENCE & TECHNOLOGY 117 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm thực phịng ịng Cơng nghệ ngh Vật liệu Mơi trường, Viện Hóa học vàà Trung tâm Phát triển tri Công nghệ Vật ật liệu sạch, Viện Hóa học hợp chất thiên thi nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học vàà Công nghệ ngh Việt Nam P-ISSN ISSN 1859 1859-3585 E-ISSN 2615-9619 (71- 91%) Tảo spirulina có hàm àm lư lượng nước cao 95,31%, phân tằm có hàm lượng ợng n nước 32,71% Bảng Hàm lượng ợng chlorophyll từ số loại nguyên liệu TT 2.2.1 Quy trình chiếtt tách chlorophyll Nguyên liệu Phân tằm sau xử lý loại bỏ thành phần ph tạp thô cành, dâu (5 gam) xay nghiền n 100 ml hỗn h hợp dung môi acetone: NH4OH (9/1, v/v) Hỗn H hợp sau lưu chai thủy tinh sẫm màu khoảng thời gian khác từ đến 30 Sau lọc l bỏ bã, dung dịch ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút khoảng kho phút Dịch chiết chlorophyll đượcc xác định đ hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b chlorophyll tổng t phương pháp Lichtenthaler, nthaler, H.K [9, 12, 13] Phân tằm (silkworm fertilizer) 32,71 0,375 0,223 0,598 0,902 62,713 Lá dâu tằm (Morus alba) 82,15 0,216 0,125 0,340 1,907 63,343 Spinach (Spinacia oleracea) 91,03 0,086 0,080 0,166 1,850 51,743 Cỏ linh lăng (Medicago sativa) 75,14 0,194 0,107 0,302 1,213 64,481 Tảo xoắn (Spirulina platensis) 95,31 0,040 0,018 0,058 1,231 69,147 2.2.2 Xác định hàm lượng ng chlorophyll Dịch chiết chlorophyll hòa òa loãng b acetone 80% đo độ hấp thụ quang ên máy so màu UV-VIS UV (LABOMED - Mỹ) bước ớc sóng 663nm and 645nm 645 với mẫu trắng acetone 80% [5, 7, 9] Lượng chlorophyll (µg) 1g g cao chiết chi xác định theo công thức đây: V % Chlorophyll a [12,7 (A )– 2,69 ((A )] 100% 10 W V % Chlorophyll b[22,9 (A )– 4,68 ((A )] 100% 10 W % Chlorophyll a + b = % Chlorophyll a + % Chlorophyll b Trong đó: Hàm Hàm lượng (%) Chla lượng ratio nước Chl a Chl b  Chl  Chl (%) (a+b) (a+b)* Lá chè (Camellia sinensis) 45,43 0,107 0,088 0,195 0,357 54,892 Lá tre (Bambusoideae) 46,73 0,148 0,117 0,265 0,497 55,947 Lá bồ ngót (Sauropus androgynous) 55,78 0,119 0,089 0,207 0,469 57,233 Chl a: Chlorophyll a Chl b: Chlorophyll b Tổng Chl (a+b): hàm lượng ợng tổng chlorophyll (a+b) tính theo nguy nguyên liệu tươi Tổng Chl (a+b)*: hàm lượng ợng tổng chlorophyll (a+b) tính theo nguy ngun liệu khơ tuyệt đối A: Độ hấp thụ quang V: Thể tích dung dịch chiết sau hòa òa với v acetone 80% W: Khối lượng cao chiết 2.2.3 Phương pháp tinh ạch chlorophyll Việc ệc phân tích, phân tách phần dịch chiết đ thực phương pháp sắc ắc ký khác n sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường ờng (CC) với pha tĩnh l silica gel (Merck) sắc ắc ký rây phân tử với pha tĩnh l sephadex LH-20 (Merck) [8,2] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết đánh giá hàm lượng ng chlorophyll phân tằm so với số nguyên liệu u giàu chlorophyll Một số nguyên liệu ệu thực vật (lá dâu tằm, cỏ linh lăng Alfalfa, Spinach,….) bột ột tảo xoắn Spirulina đ sử dụng để đánh giá, so sánh với hàm lượng ợng chlorophyll đ tách chiết từ phân tằm Phương pháp định ịnh lượng l chlorophyll xác định theo tiêu chuẩn ẩn Hoa Kỳ [9,11] Theo bảng hình 1, hàm lượng ợng nước n nguyên liệu nghiên cứu có chênh lệch ệch lớn Trong loại thực vật khảo sát hàm lượng nước ớc dao động từ 45,43 đến 91,03% Nhóm nguyên liệu ệu thực vật có hàm h lượng nước thấp: chè, tre, bồ ngót (45 - 55%), nhóm có hàm lượng nước cao làà spinach, dâu tằm, t cỏ linh lăng Hình Đồ thị biểu diễn mối tương ương quan gi tổng chlorophyll theo nguyên liệu tươi, khô tỷỷ lệ chlorophyll a nguy nguyên liệu nghiên cứu Chính chệnh lệch hàm àm lư lượng nước lớn nên qui hàm lượng ợng khô tuyệt đối, h hàm lượng chlorophyll số nguyên liệu ệu nghi nghiên cứu dao động từ 0,357 đến 1,907%, thấp làà chè 0,357% cao nh dâu tằm 1,907% Các nguyên ên liliệu có hàm lượng chlorophyll cao: dâu tằm ằm (1,907%), cỏ linh lăng (1,850%) vvà spinach (1,213 %) Đây nguyên ên liliệu sử dụng nhiều nước thếế giới để thu nhận chlorophyll dẫn ẫn xuất chlorophyll Tuy nhi nhiên, thực tế, nguyên liệu có hàm lư lượng nước lớn, khoảng 75 - 90%, lượng ợng chlorophyll thu đ tương ứng 0,216; 0,086 hay 0,194% sinh khối ối ttươi Vì trình tách chlorophyll đạt hiệu ên đ đối tượng nguyên liệu tươi nên lượng dung môi thiết ết bị sử dụng để thu đ 1kg chlorophyll lớn ập 57 - Số (02/2021) 118 Tạp chí KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ● Tập Website: hhttps://tapchikhcn.haui.edu.vn SCIENCE - TECHNOLOGY P-ISSN 1859-3585 E-ISSN 2615-96199 Phân tằm nguyên liệu ệu tách chiết chlorophyll tiềm hàm lượng chlorophyll thu ợc từ phân tằm tươi t (độ ẩm 32,71%) 0,598%, tương ứng 0,902% sinh khối khô Nếu sử dụng nguyên liệu để ể tách chiết chlorophyll thu lượng chlorophyll lớn, giá thành ành rẻ, r giảm lượng dung môi sử dụng, giảm qui mô thiết bị đồng thời c thu ợc nhiều hoạt chất sinh học q phân tằm Đây l qui trình kép, vừa ừa thu chlorophyll, vừa thu hoạt chất sinh học có giá trị 3.2 Ảnh hưởng ởng số yếu tố đến trình tr chiết chlorophyll từ phân tằm 3.2.1 Kết khảo sát ảnh hưởng ởng dung môi đến hiệu chiết chlorophyll từ phân tằm Kết khảo sát hình cho thấy methanol, acetone ethanol dung môi tốt ợc sử dụng dụn để chiết xuất chlorophyll Hàm lượng ợng chlorophyll phân tằm sử dụng dung môi khác (methanol, acetone ethanol 70 100%) dao động khoảng từ 0,336 - 0,593% Hình Ảnh hưởng ởng dung môi đến hiệu chiết chlorophyll từ phân tằm Do đó, dựa kết thu đư ược, chlorophyll a (Chla), chlorophyll b (Chlb), tổng nồng độ chlorophyll v tỷ lệ Chla thay đổi theo loại tỷỷ lệ dung môi đ sử dụng Acetone 90% dung môi thu ợc tổng lượng l diệp lục cao 0,593% Chla 60,435% 3.2.2 Kết khảo sát ảnh hưởng ởng nhiệt độ đến hiệu chiết chlorophyll từ phân tằm Hình Ảnh hưởng ởng nhiệt độ đến hiệu chiết chlorophyll từ phân tằm Kết thu hình cho thấy nhiệt độ 25 30ºC (nhiệt độ phòng), tổng hàm lượng ng chlorophyll đạt đ cao hàm lượng ợng nhiệt độ khác Hàm H lượng chlorophyll làà 0,598 0,585% tỷ t lệ chla đạt 63,81% 25ºC Nhiệt ệt độ tăng thúc đẩy trình tr chiết xuất chlorophyll từ vật liệu Tuy nhiên, ên, trường trư hợp này, độ nhạy cảm ảm cao với nhiệt chlorophyll, chlorophyll Website: https://tapchikhcn.haui.edu.vn chuyển đổi thành ột hợp chất - pheophytin (ô liu đen), làm giảm lượng ợng chlorophyll vật liệu Do đó, nhiệt độ vượt 35ºC, ºC, hàm lư lượng chlorophyll tỷ lệ chla giảm 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng ởng thời gian ủ mẫu đến hiệu ả chiết chlorophyll từ phân tằm Kết khảo sát ảnh hưởng ởng thời gian ủ mẫu đến hiệu ệu chiết chlorophyll đ trình bày hình Trong khoảng ảng thời gian ủ mẫu từ 0h đến 30h cho thấy thay đổi lớn hàm lượng chlorophyll ttổng đạt giá trị cao 0,635% trình ủ tiến h hành 24h, vượt thời gian này, hàm lượng ợng cholorophyll tổng thu đ không đổi sẽẽ giảm dần thời gian ủ nhiều chlorophyll không bền ền điều kiện tự nhi nhiên Vì chúng tơi chọn thời gian ủ mẫu làà 24h 24h Hình Ảnh hưởng ởng thời gian ủ mẫu đến hiệu chiết chlorophyll từ phân tằm Kết nghiên cứu ứu số yếu tố ảnh h hưởng đến việc ệc chiết xuất chlorophyll từ phân tằm cho thấy acetone 90% dung mơi thích hợp ợp cho q trình chiết xuất chlorophyll Nhiệt độ 25ºC, tỷỷ lệ vật liệu/dung môi llà 5% thời ời gian chiết 24 đ chọn để chiết xuất chlorophyll 3.3 Kết ết tinh chlorophyll 3.3.1 Kết ết tinh chlorophyll sử dụng sắc ký cột silica gel cỡ hạt 0,040 - 0,063mm Cao chiết ết acetone phân tằm (TA (TA-25g) tiến hành sắc ắc ký qua cột silica gel với hệ dung môi dichloromethane: methanol (D:M) tỷ lệ từ 10:1→1:1 Kiểm tra phân đoạn nhỏ ỏ sắc ký lớp mỏng vvà màu thuốc thử vanilin-H2SO4, sau dồn ồn phân đoạn giống lại, ta thu ợc phân đoạn TA1→TA3 Phân đoạn TA2 (5,2g) ợc phân tách tr cột silica gel ằng hệ dung môi dichloromethane: methanol tỷ lệ (3:1), thu ợc bốn phân đoạn nhỏ từ TA2A→TA2D Phân đoạn TA2C sau cất ất loại dung môi thu đ hỗn hợp chất rắn chlorophyll ới dạng vơ định h hình, màu vàng xanh khối lượng 1,2g Phân đoạn TA2C ợc phân tách sắc ký mỏng điều chế silica gel pha thường, ờng, dung môi triển khai mỏng n-buthanol: buthanol: ethanol: nư nước (4:1:2) thu hợp chất chlorophyll a (8,0mg) mg) chlorophyll b (10,0mg) 3.3.2 Kết ết tinh chlorophyll sử dụng sắc ký cột rây phân tử với pha tĩnh sephadex LH LH-20 Cao chiết ết acetone phân tằm (RA (RA-25g) tiến hành sắc ắc ký qua cột sephadex LH LH-20 với dung môi rửa giải Vol 57 - No (Feb 2021) ● Journal of SCIENCE & TECHNOLOGY 119 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ethanol Kiểm tra phân đoạn nhỏ sắc ký lớp mỏng màu thuốc thử vanilin-H2SO4, sau dồn phân đoạn giống lại, ta thu phân đoạn RA1→RA3 Phân đoạn RA1 (8,6g) tinh chế lại cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải ethanol thu hỗn hợp chất rắn chlorophyll dạng vô định hình, màu vàng xanh RA1A (1,8g) Phân đoạn RA1A phân tách sắc ký mỏng điều chế silica gel pha thường, dung môi triển khai mỏng n-buthanol: ethanol: nước (4:1:2) thu hợp chất chlorophyll a (8,0mg) chlorophyll b (10,0mg) Từ kết cho thấy tinh chế chlorophyll từ phân tằm sử dụng sắc ký cột rây phân tử với pha tĩnh sephadex LH-20 cho hiệu cao sử dụng sắc ký cột silica gel Hàm lượng chlorophyll tổng thu cao hơn: (1,8g/25g) so với (1,2g/25g) sử dụng sắc ký cột silica gel cỡ hạt 0,040 - 0,063mm Sử dụng sephadex LH-20 có khả tái sử dụng nhiều lần dung môi rửa giải ethanol không gây độc Chính phương pháp tinh chế sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải ethanol ưu tiên sử dụng cho nghiên cứu KẾT LUẬN Thông qua kết thu nhận q trình nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy việc tách chiết chlorophyll từ phân tằm cho hàm lượng chlorophyll (0,598%) cao so với nguyên liệu tươi khác Ngoài việc lựa chọn hệ dung môi acetone: NH4OH (9/1, v/v) cho hiệu chiết suất tối ưu Q trình chiết thực bóng tối nhằm tránh phân hủy chlorophyll tác dụng ánh sáng mặt trời Các kết quan trọng sở khoa học cho việc xây dựng quy trình tách chiết chlorophyll quy mô công nghiệp P-ISSN 1859-3585 E-ISSN 2615-9619 [7] S E Hagerthey, J William Louda, P Mongkronsri, 2006 Evaluation of pigment extraction methods and a recommended protocol for periphyton chlorophyll a etermination and chemotaxonomic assessment1 Journal of phycology, vol 42, pp 1125-1136 [8] Khalyfa A., Kermasha S., Alli I., 1992 Extraction, Purification, and Characterization of C hlorophylls from Spinach Leaves J Agric Food Chem., Vol 40, pp 215-220 [9] Lichtenthaler H K., 1987 Chlorophyllsandcarotenoids: Pigmentsof photosynthetic biomembranes Methods Enzymol., Vol 148, pp 350-382 [10] Scheer H., 1991 The distribution and extraction of the chlorophylls CRC Press: Boca Raton, FL [11] J.D Strickland, T.R Parsons, 1972 Pigment analysis A practical handbook of seawater analysis, pp 185-205 [12] K.Tada, H Yamaguchi, S Montani, 2004 Comparison of Chlorophyll a concentrations obtained with 90% acetone and N, N-dimethylformamide extraction in coastal seawater Journal of oceanography, vol 60, pp 259-261 [13] K.H Wiltshire, M Boerssma, A Moller, H Buhtz, 2000 Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) Aquatic Ecology, vol 34, pp 119-126 [14] Deng Xiangyuan, SHA Peng, GAO Kun, 2011 Study on Ultrasonicassisted Organic solvent extraction process for chlorophyll extraction from silkworm faeces Chinese Agricultural Science Bulletin, Vol.33, pp 125-136 [15] Deng Xiangyuan, SHA Peng, GAO Kun, 2012 Study on microwaveassisted organic solvent extraction process for chlorophyll extraction from silkworm faeces Journal of Northeast Agricultural University, Vol.08, pp 08- 15 AUTHORS INFORMATION Pham Quynh Trang1,3, Do Trung Sy1, Tran Huu Quang1, Hoang Thi Bich2, Pham Thi Hong Minh2, Vu Minh Quang3, Nguyen Thi Huong3 Institute of Chemistry, Vietnamese Academy of Science and Technology Institute of Natural Products Chemistry, Vietnamese Academy of Science and Technology Hanoi University of Industry TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vo Van Chi, 2012 Từ điển Cây thuốc Việt Nam NXB Yhọc tập [2] Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh [3] T Cibic, O Blasutto, K Hancke, G Johnsen, 2007 Microphytobenthic species composition, pigment concentration, and primary production in sublittoral sediments of the Trondheimsfjord (Norway) Journal of Phycology, vol 43, pp 1126-1137 [4] R Devesa, A.Moldes, F.Díaz-Fierros, M Barral, 2007 Extraction study of algalpigments in river bed sediments by applying factorial design Talanta, vol 72, pp 1546-1551 [5] A R Grinham, T J Carruthers, P L Fisher, J W Udy, W C Dennison, 2007 Accurately measuring the abundance of benthic microalgae in spatially variable habitats, Limnology and Oceanography Methods, vol 5, pp 119-125 [6] Humphrey A M., 1980 Nature and distribution of carotenoids Food Chemistry,Vol 5, pp 57-67 120 Tạp chí KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ● Tập 57 - Số (02/2021) Website: https://tapchikhcn.haui.edu.vn ... chiết xuất chlorophyll từ phân tằm cho thấy acetone 90% dung mơi thích hợp ợp cho trình chiết xuất chlorophyll Nhiệt độ 25ºC, tỷỷ lệ vật liệu/dung môi llà 5% thời ời gian chiết 24 đ chọn để chiết. .. đến hiệu chiết chlorophyll từ phân tằm Hình Ảnh hưởng ởng nhiệt độ đến hiệu chiết chlorophyll từ phân tằm Kết thu hình cho thấy nhiệt độ 25 30ºC (nhiệt độ phòng), tổng hàm lượng ng chlorophyll. .. giải ethanol ưu tiên sử dụng cho nghiên cứu KẾT LUẬN Thông qua kết thu nhận trình nghiên cứu, nhận thấy việc tách chiết chlorophyll từ phân tằm cho hàm lượng chlorophyll (0,598%) cao so với nguyên