Xác định một số nguồn gen Lily (Lilium) bản địa ở Việt Nam

TIỂU BAN TÀI NGUYÊN SINH VẬT XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NGUỒN GEN LILY (LILIUM) BẢN ĐỊA Ở VIỆT NAM Bùi Thị Thu Hƣơng1, Đồng Huy Giới Nguyễn Hữu Cƣờng1, Bùi Văn Thắng2 Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Trường Đại học Lâm nghiệp Lily (Lilium) loài hoa đẹp, đa dạng phong phú chủng loại, có giá trị kinh tế cao ưa chuộng khắp nơi giới Chi Lilium bao gồm 110 đến 120 loài thuộc họ Liliaceae (Tuyl J M V et al., 2011) Ở Việt Nam, bên cạnh giống lily nhập nội, trồng số loài lily địa đồng từ lâu đời hoa Loa kèn trắng (còn gọi Huệ tây), Loa kèn tứ quý (Đặng Văn Đơng, 2010) sở hữu số lồi lily đặc hữu quý phát mọc tự nhiên vùng núi phía bắc Bách hợp (cịn gọi lily hoang dại) (Nguyễn Thị Phương Thảo, 2009) Đây nguồn gen quý, khai thác không kiểm sốt có nguy suy giảm nghiêm trọng Như vậy, cần có nghiên cứu đầy đủ từ sinh học mơ tả hình thái học, sinh lý học đến sinh học phân tử để phục vụ việc đánh giá chọn lọc, nhân giống tạo giống phù hợp với điều kiện sinh thái nhu cầu địa phương Bên cạnh phương pháp cổ điển đánh giá giống, loài, phương pháp đại cần phát huy để tiết kiệm thời gian, mà lại cho kết xác, phương pháp sinh học phân tử Chỉ thị phân tử xem cơng cụ hữu ích sử dụng rộng rãi thời gian từ lúc bắt đầu thí nghiệm tới cho kết ngắn, xác nghiên cứu di truyền Các thị barcode (hay gọi mã vạch DNA) phương pháp Paul Hebert đưa lần vào năm 2003 (Hebert, 2003) Ưu điểm phương pháp khơng cần phu thuộc vào hình thái hoàn chỉnh mà cần lượng nhỏ mẫu xác định xác lồi với độ xác cao Cơng cụ xác định loài nhanh phương pháp truyền thống khác, đồng thời cung cấp liệu bảo tồn sinh học khảo sát đa dạng sinh học, phát triển nguồn gen quý Các loài lily đa dạng phong phú có kích thước gen lớn nên gặp khó khăn sử dụng kỹ thuật phân tử (Tuyl J M V et al., 2011) Chính vậy, quần thể Lilium khơng có cơng bố đặc điểm sinh thái, nơng học mà cịn cơng bố chuỗi trình tự đặc trưng phân loại loài lily đặc hữu thư viện Gene Bank Các lồi lily đặc hữu Việt Nam chưa có báo cáo đầy đủ xác định loài phân loại cơng bố Chính vậy, báo cáo trình bày kết bước đầu xác định số nguồn gen lily (Lilium) địa phổ biến Việt Nam nhằm phục vụ cho việc chọn, tạo phát triển nguồn hoa lily quý cho Việt Nam, giới I VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu lily thu thập có tên bảng sau (bảng 1) Bảng STT 1222 Danh sách mẫu nguồn gốc thu thập Tên địa phƣơng Ký hiệu Nơi thu thập Bách hợp LHD SaPa, Lào Cai Loa kèn tứ quý LK Tây Tựu, Hà Nội Loa kèn trằng LKT Tây tựu, Hà Nội HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Phƣơng pháp thu mẫu đánh giá loài Mẫu thu thập đánh giá đặc điểm hình thái theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2007) 2.2 Tách chiết DNA nhân dòng gen ITS gen lục lạp rpoC1 kỹ thuật PCR DNA tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB DNA tổng số kiểm tra điện di gel agarose 1% nhuộm Ethidium Bromide Kết lượng DNA ghi nhận hệ thống phân tích hình ảnh tự động GelDoc hàm lượng DNA đo máy Nanodrop DNA pha loãng nồng độ 100 ng/µl làm nguyên liệu để tiến hành phản ứng PCR Sản phẩm PCR thu sau kiểm tra phương pháp điện di gel agarose Bảng Trình tự mồi dùng phản úng PCR Tên mồi Ký hiệu ITSF ITS ITSR 1F rpoC1 3R Trình tự mồi (5’- 3’) ACGAATTCATGGTC CGGTGAAGTGTTCG TAGAATTCCCCGGT TCGCTCGC GTTAC GTGGATACACTTCT TG TAATGG TGAGAAAACATAA GTAAACGGGC Kích thƣớc (bp) 800 550 Sản phẩm cắt điện di gel agarose 1%, sau làm (thơi gel) theo Kit QIAquick Gel Extraction (của hãng QIAGEN) Kiểm tra gel agarose 1% xem chất lượng DNA sau tinh kit 2.3 Tạo plasmid tái tổ hợp Biến nạp vector tái tổ hợp pBT vào tế bào E.coli DH5α theo phản ứng Bảng Thành phần phản ứng nối gen vào vector pBT Thành phần H2O Buffer T4 ligase (10X) Vector BT Gen T4DNA ligase (enzym) Tổng số Thể tích (µl) 1 10 Sản phẩm PCR bố trí vào trình tự nucleotide gen LacZ pBT, gen sản xuất β- galactosidase (chất xúc tác thủy phân X-gal màu xanh) Do vi khuẩn khơng mang plasmid tái tổ hợp cho khuẩn lạc màu xanh Chọn khuẩn lạc có màu trắng ni LB lỏng có bổ sung carbenicilin qua đêm Kiểm tra plasmid thực phản ứng PCR: Plasmid tách kiểm tra plasmid phản ứng PCR Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR giống với trình nhân gen Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% 1223 TIỂU BAN TÀI NGUYÊN SINH VẬT 2.4 Giải trình tự Trình tự DNA xác định máy phân tích trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer theo nguyên lí Sanger với kit BigDye Terminator v 3.2 Cycle Sequencing (Macrogen Inc HànQuốc) 2.5 Phƣơng pháp phân tích số liệu Các chuỗi DNA xử lý phần mềm DNAstar kiểm chứng với liệu từ GenBank chương trình BLAST Các trình tự dóng hàng phần mềm BioEdit Cây phân loại xây dựng theo phương pháp tối đa (Maximum Parasimony - MP) sở số liệu thu phần mềm MEGA II.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Một số đặc điểm phân bố, hình thái Lily Việt Nam Theo Trần Duy Quý cộng (2004), hoa lily có nguồn gốc chủ yếu từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, California (Mỹ) rải rác số nơi khác Loại có mặt hầu hết châu lục, với khoảng phân bố rộng từ 10o đến 60o độ bắc vùng có khí hậu ôn đới lạnh vùng núi cao từ 1200 m trở lên vùng nhiệt đới Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Việt Nam Ước chừng khoảng 80 loài bản, chúng xuất châu Á với khoảng 50-60 lồi, châu Mỹ có 20 loài, châu Âu 12 loài (Trần Duy Quý cs, 2004) Ở Việt Nam, loài L poilanei Gagnep nhiều nhà khoa học cho mọc hoang dại SaPa, Hồng Liên Sơn (Nguyễn Nghĩa Thìn, Nguyễn Thị Thời, 1998; Trần Duy Quý cs, 2004; Nguyễn Phương Thảo cs, 2012) Các giống L longiflorum trồng lâu đời Hà Nội số tỉnh thành nước đặc biệt L formolongo ưa chuộng phát triển tốt Việt Nam năm gần thời điểm mùa hè nắng nóng (Đặng Văn Đơng cs, 2010) Theo hình thái đặc điểm sinh thái mẫu lily nghiên cứu, nhóm mẫu thu thập với kí hiệu LK, LKT (thu thập Hà Nội) xác định theo L formolongi; L longiflorum Thunb LHD (thu thập SaPa, Lào Cai) xác định L poilanei Gagne Kết tương tự cơng bố Nguyễn Nghĩa Thìn, Nguyễn Thị Thời (1998), Đặng Văn Đông cs, (2010) Nguyễn Phương Thảo cs, (2012) Tách chiết DNA tổng số khuếch đại gen vùng trình tự nhân ty thể mẫu lily nghiên cứu Các vạch băng gel điện di (Hình 1) cho thấy, mẫu DNA sau chiết tách từ mẫu tương đối rõ nét, không bị đứt gãy, chứng tỏ DNA tổng số mẫu tách chiết thành công Hàm lượng DNA tổng số kiểm tra máy đo Nanodrop, thể Bảng Bảng Hàm lƣợng DNA tổng số mẫu Tên mẫu A260/280 Nồng độ DNA (ng/µl) LK 09 1081,2 LHD 1,80 249,7 LKT 2,14 819,4 Hình 1: Ảnh điện di sản phẩm tách chiết DNA mẫu lily nghiên cứu M: thang marker1kb 1224 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Tỷ số A260/A280 dao động khoảng 1,80 đến 2,14 cho thấy, DNA có độ tinh cao tương đối đồng đều; nồng độ khoảng từ 249 ng/µl đến 820 ng/µl, sử dụng cho phản ứng PCR Phản ứng PCR tiến hành với mồi khuếch đại vùng ITS (gen nhân) rpoC1 (gen lục lạp) kết thu biểu diễn Hình Hình 2: Ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA Hình 3: Ảnh điện di sản phẩm tinh phản mẫu lily với thị ITS rpoC1 ứng PCR mẫu với thị ITS rpoC1 M: thang marker1kb M: thang marker1kb Các băng vạch thu hình ảnh điện di chứng minh vùng gen khuếch đại thành cơng (hình 2) đặc hiệu (hình 3) Các vùng gen nhân vùng gen ty thể tiếp tục tạo dòng (cloning) giải trình tự Tạo dịng đoạn trình tự gen mục tiêu giải trình tự nucleotid Các đoạn gen mục tiêu tạo dòng tế bào khả biến E coli DH5α với vector pBT sau kết hợp gen đích phản ứng nối (ligation) Kết quả, lượng lớn khuẩn lạc xanh trắng mọc chứa vector tái tổ hợp tái khép vịng (hình 4) Một số khuẩn lạc trắng đượckiểm tra có mặt gen đích phản ứng PCR-clony với mồi đặc hiệu gen mục tiêu (hình 5) Hình 4: Đĩa petri nuôi khuẩn E coli DH5α sau biến nạp Vòng tròn màu trắng khuẩn lạc trắng; vòng trịn màu xanh khuẩn lạc xanh Hình 5: Sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi ITS rpoC1 M: thang marker1kb Hình cho thấy sản phẩm PCR genome có kích thước theo tính tốn lý thuyết khoảng 800 bp (với đoạn gen ITS) 550bp (với đoạn gen rpoC1), chứng tỏ đoạn gen mong muốn tạo dịng thành cơng vi khuẩn E.coli Các đoạn DNA sau tách dịng thành cơng đọc trình tự xử lý phần mềm Bioedit DNASTAR đối chiếu với trình tự công bố ngân hàng GenBank Kết Blast ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự ITS mẫu có mức độ tương đồng với trình tự ITS1 – 5,8S – ITS2 lồi thuộc chi Lilium giới công bố từ 92 - 98% với độ bao phủ từ 74 - 96% Đó lồi L.dauricum (HQ724821.1); L concolor var buschianum (HQ724819.1); L concolor var Partheneion (HQ724820.1); L.amabile (HQ724816.1); L cernuum (HQ724818.1); L distichum (HQ724822.1); L.tsingtauense (HQ724827.1) L lancifolium (HQ724825.1) (Sultana S et al., 2010) 1225 TIỂU BAN TÀI NGUN SINH VẬT Ngồi ra, kết phân tích phần mềm Bioedit cho thấy, có 117 điểm sai khác lồi, chiếm 13,5% tồn trình tự Trong 64 vị trí vùng ITS1, 42 vị trí vùng ITS2, 11 vị trí khác vùng cuối gen 5.8S Vùng 5,8S vùng nằm ITS1 ITS2 Kết phân tích vùng 5,8S mẫu cho thấy vùng biến động, tương đối bảo tồn có 14 điểm sai khác tập trung chủ yếu cuối vùng 5,8S Từ việc phân tích trình tự vùng ITS1, ITS2 5,8S cho thấy, mẫu có điểm sai khác với mẫu cịn lại có quan hệ họ hàng gần Kết thể hình 100 L.distichum L.tsingtauense 44 LKT 40 98 LK L.concolor var buschianum L.amabile 80 96 L.concolor var partheneion L.dauricum 55 L.lancifolium L.cernuum 34 LHD Hình 6: Cây phân loại mối quan hệ di truyền nguồn gen lily địa Việt Nam nguồn gen lily giới dựa trình tự gen ITS1 – 5,8S – ITS2 Quan sát phân loại xây dựng sở so sánh trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2, ta nhận thấy rằng: Các giống LK (L formolongi) LKT (L longiflorum Thunb) nằm nhánh nhỏ chứng tỏ chúng có quan hệ gần gũi với (với độ tin cậy cao, số bootstrap 98%) Có thể nói, giống cịn có quan hệ gần gũi với lồi L tsingtauense, L distichum (thuộc nhóm Martagon) số bootstrap thấp (44%) Giống LHD (L poilanei Gagnep) có quan hệ gần với lồi L cernuum (thuộc nhóm Asiatic) nên nằm nhánh nhỏ có số bootstrap thấp 34% - độ tin cậy thấp Như vậy, ta sơ kết luận thị ITS cho phép phân biệt mẫu nghiên cứu (L poilanei Gagnep, L formolongi, L longiflorum Thunb ) với loài khác chi Lilium Kết Blast ngân hàng gen NCBI với trình tự rpoC1 cho thấy, trình tự rpoC1 mẫu có mức độ tương đồng với trình tự lồi thuộc chi Lilium giới mức 99% với độ bao phủ từ 90 - 95% Đó lồi L longiflorum (KC968977.1) (Kim J S and Kim J .; 2013); L superbum (KP462883.1) (Lam V K Y and Graham S W., 2015); L lancifolium (JF972827.1) (Kim D K and Kim J H., 2011) Theo kết phân tích vùng gen rpoC1 mẫu nghiên cứu với trình tự DNA vùng gen loài thuộc chi Lilium (2 lồi) cơng bố GenBank bên phần mềm Bioedit (bảng 6), cho thấy có 12 điểm sai khác loài, chiếm 2,3% toàn trình tự Có thể thấy đa hình trình tự rpoC1 thấp nhiều so với vùng gen ITS Từ hình 7, ta nhận thấy phân loại gồm nhánh lớn Quan sát nhánh nhỏ, ta thấy mẫu nghiên cứu LHD (L poilanei Gagnep) LK (L formolongi) có mối quan hệ di truyền gen rpoC1 gần (với số bootstrap 64%), mẫu có quan hệ gần với lồi L superbum thuộc nhóm Oriental (95%) Cịn mẫu nghiên cứu LKT (L longiflorum Thunb) có quan hệ gần với L longiflorum thuộc nhóm Trumpet (chỉ số bootstrap 70%) Chỉ thị rpoC1 cho phép phân biệt mẫu với số bootstrap cao trình tự rpoC1 lồi Lilium cơng bố ngân hàng GenBank chưa nhiều, xem thị tiềm cho nghiên cứu định danh phân loài thuộc chi Lilium 1226 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 64 95 LHD LK L.superbum LKT 70 L.longiflorum L.lancifolium Hình 7: Cây phân loại mối quan hệ di truyền nguồn gen lily địa Việt Nam nguồn gen lily giới dựa trình tự gen rpoC1 III KẾT LUẬN Loa kèn trắng, Loa kèn tứ quý Bách hợp thu thập vị trí phân bố xác định L longiflorum Thunb, L formolongi L poilanei Gagnep Đã khuếch đại vùng ITS, rpoC1 giải trình tự thành công vùng mẫu lily nghiên cứu Từ thông tin gen rpoC1 xác định Loa kèn trắng (L longiflorum Thunb) thuộc nhóm Trumpet; Loa kèn tứ quý (L formolongi) Bách hợp (L poilanei Gagnep) có mối quan hệ di truyền gần nhau, mẫu có quan hệ gần với lồi L superbum thuộc nhóm Oriental TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Văn Đông, Nguyễn Thị Thanh Tuyền, Trịnh Khắc Quang, Lê Thu Hƣơng, 2010 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo nhân giống hoa lily, loa kèn Nhà xuất Hà Nội 118 trang Hebert P D N., Cywinska A, Ball S L., deWaard J R., 2003 Biological identifications through DNA barcodes Proceedings of the Royal Society of London, Series B 270:313-322 Kim D K and Kim J H., 2011 Lilium lancifolium RNA polymerase C (rpoC1) gene, partial cds; chloroplast https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007 Các phương pháp nghiên cứu thực vật Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội - 171 trang Nguyễn Nghĩa Thìn, Nguyễn Thị Thời, 1998 Đa dạng thực vật có mạch vùng núi cao Sapa- Phansipan.NXB ĐHQG Hà Nội –.115 trang Nguyễn Thi Phƣơng Thảo, Vũ Quang Khánh, Cao Việt Anh, 2009 Đánh giá đa dạng hình thái đặc điểm nông sinh học lily địa Lilium poilanei Gagn Tạp chí Khoa học Phát triển: Tập 7, số 4: 460 – 467 Lam V K Y and Graham S W., 2015 Lilium superbum voucher NCU: Chase, M W.:112 chloroplast, complete genome https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Sultana, S., Choi, H W and Bang, J W., Molecular phylogeny of ITS region in Korean Lilium Lilium amabile https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Trần Duy Quý, Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2004 Giới thiệu số giống hoa Lily nhập vào Việt Nam khả phát triển chúng Bản tin Nông nghiệpGiống công nghệ cao, Hà Nội Nxb Nông nghiệp, Vol 6, 10-15 10 Tuyl J M V, Arens P., Ramanna M S ,Shahin A., Khan N , Xie S., A., Marasek Ciolakowska A., Lim K B and R Barba- Gonzalez, 2011 Wild Crop Relatives: Genomic and Breeding Resources Springer pub pp 161-183 1227 TIỂU BAN TÀI NGUYÊN SINH VẬT L longiflorum Thunb L formolongi L poilanei Gagnep L lancifolium L superbum L dauricum L tsingtauense L distichum L cernuum Hình 8: Hình ảnh số lồi hoa lily Việt Nam giới IDENTIFICATION OF SOME GENETIC RESOURCES OF INDIGENOUS LILY (LILIUM) IN VIETNAM Bui Thi Thu Huong, Dong Huy Gioi Nguyen Huu Cuong, Bui Van Thang SUMMARY Lilium longiflorum Thunb, L formolongi and L poilanei Gagnep identified based on morphology studies are precious species belong to Lilium genus, are being uncontrollably exploited and are at risk of severe decline There are now limit of general database and the specific molecular information So, they were collected, their ITS and rpoC1 genes were amplified and studied The ITS & rpoC1 sequences were analyzed and compared with other lilies species in GenBank The results showed that these two DNA regions of the three lilies species were amplified and successfully sequenced Taxonomy trees of the three lilies and some other ones in the world were constructed based on ITS and rpoC1 sequences In particular, the results from the rpoC1 gene were confirmed that L longiflorum Thunb belonged to the Trumpet group while L formolongi and L poilanei Gagnep had close genetic relationship These two lilies species were closely genetic relationship to L superbum, a species of the Oriental group 1228 ... loại mối quan hệ di truyền nguồn gen lily địa Việt Nam nguồn gen lily giới dựa trình tự gen ITS1 – 5,8S – ITS2 Quan sát phân loại xây dựng sở so sánh trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2, ta... mối quan hệ di truyền nguồn gen lily địa Việt Nam nguồn gen lily giới dựa trình tự gen rpoC1 III KẾT LUẬN Loa kèn trắng, Loa kèn tứ quý Bách hợp thu thập vị trí phân bố xác định L longiflorum Thunb,... MP) sở số liệu thu phần mềm MEGA II.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Một số đặc điểm phân bố, hình thái Lily Việt Nam Theo Trần Duy Quý cộng (2004), hoa lily có nguồn gốc chủ yếu từ Trung Quốc, Nhật Bản,