Chuyên đề dược sĩ (dược liệu) các phương pháp đánh giá dược liệu chứa alkaloid nói chung và dược liệu chứa quinine nói riêng

MỤC LỤC Lời mở đầu Chương I Tổng quan tài liệu 1.1 Phương pháp đánh giá dược liệu 1.1.1 Cảm quan 1.1.2 Sử dụng kính hiển vi 1.1.3 Phương pháp hóa học 1.1.4 Phương pháp vật lý 1.1.5 Xác định độ ẩm 1.1.6 Định lượng tro 1.1.6.1 Tro toàn phần 1.1.6.2 Tro không tan acid hydrochlorid 1.1.6.3 Tro sulfat 1.1.7 Phương pháp sắc ký 1.2 Phương pháp phân tích Alkaloid 10 1.2.1 Phân tích định tính 10 1.2.1.1 Các phản ứng tạo tủa 10 1.2.1.2 Phản ứng tạo tủa 11 1.2.2 Phân tích định lượng 11 1.2.2.1 Xác định hàm lượng Alkaloid phương pháp phân tích trọng lượng 12 1.2.2.2 Xác định hàm lượng Alkaloid phương pháp không nước 14 Chương II Phân tích dược liệu chứa quinine 15 2.1 Phân tích định tính thuốc trị sốt rét quinine sắc ký mỏng 15 2.1.1 Nguyên tắc 15 2.1.2 Thuốc, dụng cụ, hóa chất 17 2.1.2.1 Thuốc 17 2.1.2.2 Dụng cụ, hóa chất 17 2.1.3 Các bước tiến hành kỹ thuật 17 2.1.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu 17 2.1.3.2 Chuẩn bị mẫu thử 17 2.1.3.3 Chấm sắc ký 18 2.1.3.4 Chạy sắc ký 18 2.1.3.5 Phát 19 2.1.4 Đọc kết 19 2.1.5 Ưu nhược điểm phương pháp 20 2.2 Phân tích định tính phản ứng tạo màu tạo tủa 20 2.2.1 Phản ứng tạo màu 20 2.2.2 Phản ứng tạo tủa 21 2.3 Phân tích định lượng 22 Chương III Chỉ tiêu chất lượng 23 LỜI MỞ ĐẦU Cây Canhkina có tên phiên âm tiếng Pháp Quinquina Xuất phát từ Nam Mĩ, từ lâu vỏ Canhkina người dân số vùng giới sử dụng với nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt hữu hiệu việc trị bệnh sốt rét Ở nước ta, vỏ Canhkina biết đến sử dụng vào đầu kỉ 20 Ngày nay, quinine ứng dụng để điều chế thuốc chống sốt rét Tuy nhiên bị lạm dụng nên chất lượng thuốc bị giảm có bị làm giả Với chuyên đề này, chúng tơi muốn trình bày rõ phương pháp đánh giá dược liệu chứa alkaloid nói chung dược liệu chứa quinine nói riêng CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phương pháp đánh giá dược liệu: Đánh giá dược liệu nghĩa xác định dược liệu có tiêu chuẩn quy định hay khơng Tiêu chuẩn dược liệu quy định: đặc chất, độ tro, độ ẩm Những tiêu chuẩn đề để đảm bảo chất lượng thuốc có để giao dịch thị trường Có thể xếp phương pháp đánh sau: 1.1.1 Cảm quan: Phương pháp cảm quan nghĩa dùng cảm quan để đánh nhìn bên ngồi hình dáng, kích thước, màu sắc, vài dược liệu cần bẻ để quan sát bên Mùi đặc điểm nhiều dược liệu chứa tinh dầu, nhựa Vị cam thảo, cỏ ngọt; chua dược liệu chứa acid hữu cơ; đắng dược liệu chứa alkaloid, glucosid; cay ớt, gừng… 1.1.2 Sử dụng kính hiển vi: Phương pháp đánh giá dựa vào kính hiển vi bao gồm vi phẩu soi bột Đây phương pháp hay dùng để kiểm nghiệm dược liệu Trong vài trường hợp phương pháp có ưu phương pháp hóa học ví dụ để phân biệt loại tinh bột người ta dựa vào phương pháp hóa học mà phải nhờ vào kính hiển vi Một vài mảnh trúc đào dày tử thi xác định dễ dàng soi vi phẩu làm phản ứng tìm oleandrosid Dùng kính hiển vi khơng để xác định giả mạo mà cịn ước lượng tỉ lệ chất giả mạo vào số lượng đặc điểm mẫu kiểm nghiệm so sánh với mẫu đối chứng 1.1.3 Phương pháp hóa học: Phần lớn dược liệu có thành phần hoạt chất xác định Các hoạt chất cho phản ứng màu đặc trưng, người ta dựa vào để định tính định lượng Ví dụ anthranoid dựa vào phản ứng Borntraeger, glycoside tim dựa vào phản ứng dẫn xuất nitro thơm Đối với alkaloid dựa vào tính kiềm định lượng phương pháp acid-kiềm Đôi người ta lại dựa vào thành phần hóa học khơng phải hoạt chất đặc trưng cho dược liệu để đánh giá 1.1.4 Phương pháp vật lý: Trong nhiều trường hợp phát bị pha lẫn hay giả mạo cách soi mặt cắt dược liệu hay bột dược liệu ánh đèn phân tích tử ngoại Có trước soi người ta nhỏ thêm bột dược liệu vài loại thuốc thử (kiềm, acid…) Một số cao dược liệu cho màu sắc khác nhau, hoạt chất vậy, ví dụ aconitin (lơ sáng), berberin (vàng), emetin (đỏ cam) Quinin cho màu xanh lơ dung dịch oxy acid ánh sáng thường rõ đèn tử ngoại Việc ứng dụng số vật lý để đánh giá thường hay tiến hành tinh dầu béo hoạt chất: Độ hòa tan (thường biểu thị sau: 1gam tan …ml nước, …ml cồn ethylic, glycerin…) Tỷ trọng ( đặc biệt tinh dầu dầu béo) ví dụ: tỷ trọng tinh dầu bạc hà 20oC: 0,890-0,922 Tỷ trọng mật ong 20oC khơng 1,38 Góc quay cực riêng: Đối với chất lỏng tinh dầu, dầu béo [α]D25= α /l.d Đối với hoạt chất rắn [α]D25= α.100/l.c α: Góc quay cực đo l: bề dày lớp chất tình decimet d: tỷ trọng chất c: nồng độ phần trăm chất dung dịch Đo góc quay cực tỷ trọng nhiệt độ, ví dụ 25oC Chỉ số khúc xạ (đặc biệt tinh dầu dầu béo) ví dụ: số khúc xạ tinh dầu hương nhu trắng 20oC 1,510-1,528 Nhiệt độ đông đặc ( Đối với tinh dầu dầu béo) ví dụ nhiệt độ đơng đặc tinh dầu hồi phải +15oC Nhiệt độ nóng chảy (Đối với sáp ong hoạt chất alkaloid, glycosid…)ví dụ nhiệt độ nóng chảy sáp ong vàng: 62-66oC 1.1.5 Xác định độ ẩm: Dược liệu thường quy định giới hạn độ ẩm định ví dụ dược điển II tập quy định độ ẩm cao hoa vàng khơng q 13%, q độ ẩm dược liệu dễ bị mốc, hư hỏng Song song với việc định lượng hoạt chất cần xác định độ ẩm để quy hàm lượng so với dược liệu khơ tuyệt đối Có thể xác định độ ẩm cách sau đây: - Sấy tủ sấy áp xuất bình thường - Sấy tủ sấy áp xuất giảm (do máy hút chân không) - Làm khơ bình hút ẩm với chất hút nước mạnh acid sunfuric đậm đặc, phosphorpentoxid áp suất giảm (có máy hút chân khơng) Hai cách sau thường áp dụng với dược liệu quí dễ hỏng nhiệt độ ta cần thu hồi ví dụ sữa ong chúa, nọc rắn… Đối với dược liệu chứa tinh dầu xác định độ ẩm phương pháp cất lơi đẳng phí, nghĩa lôi nước cách cất với dung môi hữu không trộn lẫn với dung dịch lại cho với nước hỗn hợp đẳng phí có nhiệt độ sôi ổn định Sau ngưng tụ để nguội, nước tách đọc thể tích Dung mơi dùng xylem, toluene 1.1.6 Định lượng tro 1.1.6.1 Tro toàn phần: Tro toàn phần khối lượng cặn cịn lại sau nung cháy hồn tồn dược liệu Để so sánh kết quả, cần phải tiến hành điều kiện định Ví dụ, chén nung sứ, đường kính 35mm, sơ đem nung đỏ, để nguội cân bì, đặt mẫu dược liệu cắt tán nhỏ (1-5gram) cân xác Lúc đầu đốt nhẹ tăng dần nhiệt độ để dược liệu cháy hết Cần theo dõi điều chỉnh nhiệt độ để tránh than khơng bị khỏi miệng chén Đốt xong xong cho chén vào lò nung nhiệt độ 500oC thu khối lượng khơng đổi Để tránh dược liệu hóa gỗ tạo than khó đốt cháy, ngừng nung làm ẩm nước cất acid nitric đậm đặc đem nung lại Sau tro khơng cịn màu đen, người ta để nguội bình hút ẩm đem cân 1.1.6.2 Tro không tan acid hydrochloric: Thêm vào tro toàn phần 5ml HCl 10% Đậy chén vung mặt kính đồng hồ đun cách thủy 10 phút Dùng 5ml nước cất nóng để rửa mặt kính đồng hồ dùng nước rửa để pha lỗng dung dịch cịn lại chén Lọc dung dịch qua giấy lọc không tro, rửa cặn giấy lọc nước cất nóng nước rửa khơng cịn phản ứng ion chlorid Chuyển giấy lọc có cặn vào chén nung trên, sấy khơ, đốt nung nhiệt độ 500oC khối lượng không đổi Trừ trường hợp đặc biệt mộc tặc, tro biểu thị chủ yếu cát cấu tạo silic oxyd dược liệu không làm kỹ 1.1.6.3 Tro sulfat: Tro sulfat tro lại sau nhỏ aicd sulfuric dược liệu đem nung Phương pháp cho kết ổn định phương pháp tro tồn phần carbonat oxyd chuyển thành sulfat 1.1.7 Phương pháp sắc ký: Đây phương pháp hữu hiệu áp dụng để định tính, định lượng tách chiết thành phần hóa học dược liệu 1.1.7.1 Sắc kí cột: Sắc kí cột bao gồm sắc kí cột cổ điển sắc kí cột đại hay gọi sắc ký lỏng hiệu cao hay sắc ký lỏng cao áp Trong sắc ký cột cổ điển người ta thường dùng cột thủy tinh đường kính 1-5cm dài 30-100cm Hạt nhồi cột đường kính từ 150-300µm Sau chất tách pha tĩnh ta lấy phần pha tĩnh có mang chất đem chiết lấy chất Nếu dược chất tách pha tĩnh ta hứng lấy phân đoạn dịch rửa có hịa tan chất nhờ phận góp tự động Trang bị cho sắc kí cột cổ điển đơn giản, không tốn nên phương tiện chủ yếu để tách thành phần hóa học dược liệu Trong sắc kí cao áp, chất nhồi cột có cỡ hạt 3-10 µm Vì hạt nhỏ, dung mơi chảy khó nên phải dùng bơm để nén Sắc kí lỏng cao áp có khả tách chất tốt Dung môi (pha di động) để rửa phải tinh khiết Cần lọc loại vẩn đuổi hết khí hịa tan siêu âm đun nóng, khuấy hút sục khí trơ Bơm nén phải tạo áp suất cao 200-500atm Cột thép khơng rỉ có đường kính 4-10mm, dài 10-30cm Có loại nhỏ chiều dài 3-10cm, đường kính 1-4mm Cột thủy tinh dùng áp suất 50atm Khi dung mơi hịa tan chất khỏi cột qua detecto hay dùng detecto quang phổ tử ngoại khả biến Tùy theo chất tượng sắc kí người ta chia ta sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc kí trao đổi ion, sắc kí gel Trong sắc ký hấp phụ, nhơm oxyd, silicagel hay sử dụng Trong trình khai triển rửa giải chất phân cực bị lưu giữ mạnh Về pha động ta sử dụng dung môi với độ phân cực tăng dần: Dung môi Ether dầu Hexan Heptan Cyclo Carbon tetrachlorid Ether isopropylic Toluen Benzen Ether ethylic Chlorofrom Methylen chlorid Dichlor ethan Aceton Dioxan Ɛ0 0,1 0,1 0,1 0,04 0,18 0,28 0,29 0,32 0,38 0,40 0,42 0,49 0,56 0,56 10 Người ta sử dụng nhiều thuốc thử để xác nhận có mặt ancaloit thực vật Do sở phản ứng hóa học ancaloit phần lớn không rõ ràng, nên người ta phân biệt phản ứng phản ứng màu phản ứng tạo tủa 1.2.1.1 Các phản ứng tạo tủa:  Thuốc thử Mayer (1865): K2HgI4 [kali-thủy ngân (II) iodua kaliumiodomercurat]: Là thuốc thử ancaloit thông thường cho tủa màu trắng (vàng trắng) không tan kể dung dịch axit loãng  Thuốc thử Dragendorff hay Kraut (1881): KBiI4 [Kali-bizmut-iodua]: Thuốc thử ancaloit cho tủa kết tinh màu vàng cam (đỏ)  Thuốc thử Bouchardat (1839) hay Wagner (1863): KI3 [dung dịch kali-iodua 0,1N + I2]: cho tủa kết tinh màu nâu đỏ sẫm với ancaloit  Thuốc thử Sonnenchein (1857): H3[P(Mo3O10)4], axit phosphormolibdenic: Tạo tủa tương đương mol với hầu hết ancaloit Đặc biệt nhạy quinin strychnin  Thuốc thử Godeffroys: K4[Si(W3O10)4], axit silicowonframic: Người ta sử dụng dung dịch nước 5% muối natri nó, cho phản ứng nhạy với ancaloit cho tủa màu trắng  Axit cheric (tannin): Tạo tủa vô định hình khơng màu trắng vàng  Muối Reinecke: NH4[Cr(SCN)4(NH3)2], Amoni-tetrarodanato-diammincromat(III): Ban đầu, người ta sử dụng tác nhân tạo tủa với amin bậc II amin tercier Rosenhaler sử dụng để xác nhận có mặt ancaloit cho tinh thể đặc trưng  Natri-tetraphenyl-borat (Kalignost), Na[B(C6H5)4]: Ban đầu, người ta sử dụng tác nhân thử kali, sau sử dụng thử ancaloit thơng thường, cho tủa màu trắng axit axêtic Cần lưu ý rằng: amin tổng hợp tercier quaternary amin thường cho phản ứng tủa ancaloit 12 1.2.1.2 Phản ứng tạo tủa: Trong số phản ứng ancaloit, phản ứng ancaloit với axit khống đặc đơi cho khả phân biệt Các phản ứng cho kết tốt ancaloit có độ cần thiết Đặc biệt phản ứng tạo màu với axit H2SO4 đậm đặc dựa sở khả hút nước ơxy hóa  Tác nhân Erdmann: 20ml axit H2SO4 đậm đặc + 10 giọt (dung dịch 100ml chứa 10 giọt axit HNO3) Phản ứng không màu với ancaloit: atropin, koniin, nicotin, caffein, quinin, cocain, strychnin Đỏ, vàng: Brucin Vàng cam, đỏ máu: Veratrin Nâu đỏ, nâu sẫm: Papaverin Đỏ máu, vàng: Tebain  Tác nhân Fröhde: axit H2SO4 đậm đặc + 5% ammoni-molibdat Xanh tím: Morphin Xanh oliu: Hydrastin  Tác nhân Mandelin: axit H2SO4 đậm đặc + vanadin (axit H2SO4 đậm đặc + 5% ammoni-vanadat) Xanh da trời sang đỏ: strichnin  Tác nhân Marquis: Formaldehide + axit H2SO4 đậm đặc (1ml axit H2SO4 đậm đặc + giọt formaldehide) Đỏ tím: Morphin dẫn xuất  Tác nhân Arnold-Vitali: lượng nhỏ KNO2 + axit H2SO4 đậm đặc Màu tím: Atropin, hyoscyamin, scopolamin Đỏ tím: strichnin  Tác nhân Thalleiochin: nước clo (brôm) + amoniac Xanh cây: quinin, quinidin 1.2.2 Phân tích định lượng: 13 Những năm trước đây, để xác định hàm lượng ancaloit cần tiến hành hai bước Bước Muối ancaloit tan nước kiềm hóa bazơ thích hợp để giải phóng ancaloit dạng bazơ không tan nước Bước ancaloit tự chiết dung mơi thích hợp (chloroform), sau đuổi dung môi xác định hàm lượng ancaloit phương pháp phân tích trọng lượng (gravimetric analysis) Sau này, người ta phát thấy số phân ly ancaloit đủ lớn (pKb ≥ 7), sử dụng phương pháp chuẩn độ để xác định hàm lượng Trong trường hợp này, sau đuổi hết dung môi hữu người ta cho vào dung dịch ancaloit thừa lượng axit H2SO4 0,1N 0,2N để tạo muối, dung dịch thừa axit chuẩn độ dung dịch kiềm 0,1N 0,2N Ngày nay, người ta sử dụng phương pháp chuẩn độ môi trường ‟không nước‟, muối ancaloit dung dịch axit axêtic băng chúng chuẩn độ trực tiếp axit percloric (HClO4) Tác nhân gây nhiễu đo thành phần axit (trong trường hợp muối ancaloit tạo axit halogenid) loại trừ muối thủy ngân (II) axêtat Phương pháp xác định hàm lượng cho ancaloit có số phân ly nhỏ (pKb ≤7) quinin hay papaverin Để xác định hàm lượng ancaloit có thực theo phương pháp sau: 1.2.2.1 Xác định hàm lượng Alkaloid phương pháp phân tích trọng lượng: a) Kiềm hóa giải phóng ancaloit tự trước chuẩn độ Để kiềm hóa, thơng thường người ta sử dụng amoniac, đơi natribicacbonat (NaHCO3) nước vôi Nếu kiềm hóa dung dịch kiềm mạnh (NaOH, KOH) tạo phản ứng khơng mong muốn Ví dụ: hợp chất ancaloit dạng este (atropin) bị xà phịng hóa, ancaloit dạng phenol (morphin) tạo phenolat chiết chloroform Một số bazơ dùng để giải phóng ancaloit tự khỏi muối như: 14  NaOH: Muối quinidin, muối quinin, codein-phốtphat, dihydrocodeinon - tartarat, dihydrocodein-tartarat  Amoniac (NH3): Muối este-ancaloit khung tropan, muối clorua dẫn xuất morphin-ancaloit (không dùng cho muối clorua morphin), papaverin, ephedrin, pilocarpin, strichnin  Natri-bicacbonat (NaHCO3): Morphin-clorua, phyzostigmin-salicylat b) Phương pháp tiến hành: Cho lượng muối ancaloit cân vào phễu chiết hịa tan 5ml nước, kiềm hóa dung dịch muối đến pH = 10 Ancaloit tự thường tan nước, người ta chiết chloroform (ete) Dung dịch kiềm hóa chiết lần (mỗi lần 10 ml CHCl3) Tách loại kiểm tra có mặt ancaloit pha hữu lần cuối (dịch chiết lần 6) thuốc thử Dragendorff Mayer Gộp pha hữu cơ, sau làm khan Na2SO4 khan Lọc qua giấy lọc Dung dịch thu chứa ancaloit tự do, người ta xác định hàm lượng ancaloit theo phương pháp thích hợp (phân tích chuẩn độ hay phân tích trọng lượng) tùy thuộc vào độ lớn số phân ly Phương pháp chiết nhanh Schulek: Phương pháp lần chiết áp dụng muối ancaloit tan tốt nước Cách tiến hành sau: Hòa tan lượng muối ancaloit biết ml nước, thêm 70 ml CHCl3 lắc đều, thực tế lượng ancaloit sau giải phóng hịa tan hoàn toàn pha hữu (pha CHCl 3), sau làm khơ Na2SO4 khan, lọc lấy dịch chiết CHCl3 tiến hành xác định hàm lượng ancaloit 1.2.2.2 Xác định hàm lượng Alcaloid phương pháp “không nước” Trước chuẩn độ người ta cho dung dịch thủy ngân (II) axêtat (trong axit axêtic băng) vào dung dịch axit axêtic băng muối ancaloit-halogenua để tạo ancaloit-axêtat chất không tan thủy ngân (II) halogenua B.HCl + Hg(AcO)2 → B AcOH + HgCl2 15 Thủy ngân (II) axêtat axit axêtic băng bazơ yếu không gây ảnh hưởng đến xác định hàm lượng ancaloit phương pháp chuẩn độ Ngoài ra, người ta sử dụng phương pháp chuẩn độ axit thành phần muối ancaloit Ví dụ: Để xác định thành phần ancaloit thơng qua muối clorua tiến hành theo phương pháp sau Người ta cho CHCl3 vào dung dịch nước ancaloit-clorua, lắc Sau đó, chuẩn độ dung dịch pha dung dịch NaOH 0.1N Ancaloit tự tan vào CHCl3 muối NaCl tan vào nước Do vậy, coi phương pháp xác định lượng axit đơn giản Phương pháp áp dụng cho ancaloit quinin papaverin tốt Trong số phương pháp xác định hàm lượng ancaloit trên, phương pháp xác định hàm lượng ancaloit phương pháp “khơng nước” cịn áp dụng cho muối amin có phân tử lớn tercier hay quaternary amin CHƯƠNG II PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU CHỨA QUININE 2.1 Phân tích định tính thuốc trị sốt rét quinine sắc kí mỏng: 2.1.1 Nguyên tắc: - Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) kỹ thuật phân tích sắc ký hai pha lỏng rắn, pha tĩnh lớp chất hấp phụ (pha rắn) trải thành lớp mỏng kính hay kim loại, pha động dung môi hay hệ dung mơi thích hợp (pha lỏng) - Các chất cần phân tích dạng dung dịch đưa lên bảng mỏng đặt bảng mỏng bình triển khai sắc ký với hệ dung mơi thích hợp, chất cần phân tích chuyển động theo chiều chuyển động dung môi Do khả hấp phụ khác chất, lực hai pha chất khác mà di chuyển chúng khác Từ xác định giá trị Rf 16 chất cần phân tích chất chuẩn cần tiến hành song song mỏng, điều kiện Giá trị Rf tính theo cơng thức: a Rf = b Phương pháp dùng nồng độ chất chuẩn 80% 100% a: Khoảng cách từ tâm vết chấm đến tâm vết sắc b: Khoảng cách từ tâm vết chấm đến điểm kết thúc dung mơi Hình 2.1 Sơ đồ sắc kí ( C100%: nồng độ chuẩn 100%, C80%: nồng độ chuẩn 80%, T: chất cần phân tích) 17  Chú ý: Giá trị Rf phụ thuộc vào yếu tố sau: Bản chất chất tinh (không lẫn tạp) chạy sắc ký: hệ dung môi, cùngloại mỏng, chất khác có Rf khác (theo lý thuyết thực tế có nhiều chất hệ dung mơi loại mỏng có Rf gần nhau, phân biệt được) Hệ dung môi: pha động Pha tĩnh: Mà silica gel mỏng bạn (chú ý mỏng có nhiều loại khác nhé: Silica gel alumina, loại silica gel dùng phổ biến) Tựu trung Rf phụ thuộc vào tương tác yếu tố kể Phương pháp kiểm tra phân tích loại thuốc thực theo sổ tay hướng dẫn kiểm tra chất lượng thuốc thiết yếu German Pharma Health Fund (GPHF) 2.1.2 Thuốc, dụng cụ, hóa chất: 2.1.2.1 Thuốc: - Thuốc chống sốt rét chứa quinine Dạng bào chế: viên nén, viên bao, viên nhộng thuốc tiêm - Các chất chuẩn German Pharma Health Fund (GPHF) cung cấp 2.1.2.2 Dụng cụ, hóa chất: - Chày sứ, kim loại nhơm, bình thủy tinh dung tích từ 25–100ml, phễu lọc, pipet thẳng 1-25ml, lọ thủy tinh nhỏ dung tích 10 25 ml, ống mao quản thủy tinh 2μl - Bản mỏng : silica gel G, cỡ 5x10cm, bàn là, bình triển khai sắc ký, đèn tử ngoại bước sóng 254 366 nm, bình phát hiện, đĩa petri bình iod - Nhãn dính, bút dạ, bút chì, giấy lọc, kéo, panh, kẹp - Dung môi: nước cất, methanol, acid sufuric đặc 96%, acid acetic đặc, ethyl acetat, aceton, acetonitril, dung dịch amoniac đậm đặc… 2.1.3 Các bước tiến hành kỹ thuật 18 2.1.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu: Dung dịch đối chiếu (1): Dung dịch quinin sulfat chuẩn 1,0% hỗn hợp thể tích chloroform (TT) thể tích ethanol 96%(TT) Dung dịch đối chiếu (2): Dung dịch có chứa 1,0% chất chuẩn quinidin sulfat quinin sulfat hỗn hợp thể tích chloroform (TT) thể tích ethanol 96% (TT) 2.1.3.2 Chuẩn bị mẫu thử: Lấy lượng bột viên nghiền mịn có chứa khoảng 0,1 g quinin sulfat, lắc kỹ với 10 ml hỗn hợp gồm thể tích chloroform (TT) thể tích ethanol 96% (TT) Sau đem lọc 2.1.3.3 Chấm sắc kí: Lấy bút chì kẻ đường thẳng cách mép sắc ký 1,5cm Dùng ống mao quản (2μl) hút dung dịch chuẩn dung dịch thử chấm đường thẳng kẻ trước với khoảng cách Có thể chấm vết sắc ký Dùng đèn UV 254nm để kiểm tra tương đồng vết Tất vết chấm phải có hình trịn 2.1.3.4 Chạy sắc kí: Dùng pipet hút xác dung mơi Diethylamin-Aceton-Toluen (10:20:80) cho vào bình triển khai sắc ký Sau cho dung mơi vào bình sắc ký, đập nắp lắc Cắt mẫu giấy lọc để dựa vào thành bình để dung mơi bảo hịa (khoảng 15 phút) Cẩn thận đặt bảng sắc ký chấm dung dịch chuẩn dung dịch thử vào bình sắc ký Đóng kín nút lọ sắc ký, chờ đến dung môi chạy khoảng 3/4 độ dài sắc ký (khoảng 15-20 phút) chuyển sắc ký ngồi, đánh dấu mức dung mơi đợi khơ, bay dung môi cách sấy khô dụng cụ làm nóng cần thiết 2.1.3.5 Phát Vết sắc ký đồ dung dịch thử phải phù hợp với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (1) vị trí màu sắc kích thước Phép 19 thử có giá trị sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2) cho vết tách biệt rõ ràng 2.1.4 Đọc kết quả: - Nếu vết chất cần phân tích chất chuẩn có hình dạng, kích thước, màu sắc, cường độ màu giá trị Rf giống nhau, ta kết luận chất thử chất chuẩn giống Chất thử coi tinh khiết sắc đồ khơng có vết lạ Nếu sắc đồ không phát thấy vết chất cần phân tích chất cần phân tích khơng chứa hoạt chất chất chuẩn - Nếu vết chất cần phân tích có màu sắc nhạt hơn, hình dạng nhỏ nhiều so với vết C80% màu sắc đậm hơn, hình dạng vết sắc ký lớn nhiều so với vết C100% (sau lần kiểm tra với phương pháp) cần đánh giá hoạt chất chế phẩm 2.1.5 Ưu nhược điểm phương pháp: - Ưu điểm: kỹ thuật thực thực địa để sàng lọc thuốc giả thuốc chất lượng; - Nhược điểm: khơng xác định xác hàm lượng hoạt chất 2.2 Phân tích định tính phản ứng tạo màu tạo tủa Người ta sử dụng nhiều thuốc thử để xác nhận có mặt Ankaloid thực vật Do sở phản ứng hóa học Ankaloid phần lớn khơng rõ ràng, nên người ta biết phân biệt phản ứng phản ứng màu tạo tủa 2.2.1 Phản ứng tạo màu: - Đun nóng 0,2g bột canhkina ống nghiệm khơ thấy màu tím đỏ bốc lên Nhưng ngưng tụ phần ống thành giọt màu tím 20 - Phản ứng Thalleoquinin: Dung dịch nước muối quinin quinidin nước có huỳnh quang cho thêm nước clor hay brom hết huỳnh quang, thêm amoniac thừa có màu xanh lục hay kết tủa xanh lục - Phản ứng Erythroquinin: Dung dịch muối quinin sau tác dụng với nước clor brom, cho thêm amoniac kali ferocyanua xuất màu đỏ Cho thêm cloroform vào lắc, màu đỏ chuyển sang lớp cloroform Andre phát phản ứng Thalleoquinin từ năm 1835 diễn tả với tên gọi ngày Brandes Nhưng chế phản ứng gần giải thích rõ Từ nghiên cứu Skraup cho biết phản ứng oxy vào vị trí nhân quinin alcaloid (quinin quinidin) Bước thứ oxy hóa halogen sinh nhiều hợp chất, dẫn xuất 6-ceto quinolin cho phản ứng tiếp tục cho thêm amoniac xuất màu xanh Trên sắc kí đồ lớp mỏng cho thấy chất màu gồm nhiều vết “Thalleoquinin” Điều dễ hiểu cho thêm amoniac có cetimin tương ứng sinh ra, có khả ngưng tụ với phẩn tử cetoquinilin, kết hợp thực qua nguyên tử N imin với C-6 cetoquinolin mà với C-5 tác dụng với halogen, phản ứng cộng hợp xảy phần nhóm vinyl, phần C5 C-7, sau halogen nhóm –OH, tạo sản phẩm phản ứng có màu xanh 21 Hình 2.2 Phản ứng Thalleoquinin 2.2.2 Phản ứng tạo tủa: - Lấy 0,10g bột dược liệu thêm 10ml H2SO4 loãng, lắc, để yên, lọc, dịch lọc phải phát huỳnh quang màu xanh lơ ánh sáng tử ngoại Lấy 1ml dịch lọc thêm 0,5 ml thuốc thử Mayer phải cho tủa rõ Thuốc thử Mayer (1865): K2HgI4 [kali-thủy ngân (II) ioduakaliumiodomercurat]: Là thuốc thử ancaloit thông thường cho tủa màu trắng (vàng trắng) không tan kể dung dịch axit lỗng 2.3 Phân tích định lượng: Cân xác 3g bột dược liệu qua rây có kích thước lỗ mắt rây 0,125mm sấy khô 60oC đến khối lượng khơng đổi vào bình nón 250ml có nút mài Thêm 2ml HCl lỗng(TT) 10ml nước, đun nóng cách thủy sơi 10 phút Để nguội, thêm 5ml dung dịch NaOH 30% (TT) vào 150ml hỗn hợp dung môi ether-cloroform [3:1] Lắc 10 phút Thêm vào hỗn hợp 5g bột mịn 22 gồm tragacan, lắc phút Để yên phút Lấy xác 100ml dịch chiết ether cloroform cho vào bình nón khác bốc tới khơ Hòa tan cắn 10ml ethanol 96o (TT) trung tính hóa đun nóng nhẹ cách thủy Thêm vào dung dịch chiết ethanol 10ml nước cất giọt dung dịch đỏ methyl Chuẩn độ HCl 0,1 N màu chuyển từ vàng sang đỏ Gọi n số ml dung dịch HCl 0,1N dùng, 1ml dung dịch HCl 0,1 N tương ứng với 0,03094 alcaloid toàn phần biểu thị hỗn hợp đồng phần tử quinin cinchonin Hàm lượng phần trăm alcaloid toàn phần dược liệu: X%= n * 3,094 Dược điển Việt Nam quy định phải có 6% alcaloid tồn phần Ngồi định lượng phương pháp đo quang: - Bandelin tạo tủa màu alcaloid với thuốc thử Reinecke, lấy riêng tủa, hòa tan aceton đo quang 525nm Muối Reinecke: NH4[Cr(SCN)4(NH3)2], Amoni-tetrarodanato-diammincromat(III): Ban đầu, người ta sử dụng tác nhân tạo tủa với amin bậc II amin tercier Rosenhaler sử dụng để xác nhận có mặt ancaloit cho tinh thể đặc trưng - Sanchez định lượng quinin quinidin phương pháp làm nhóm methy –OCH3 H2SO4 phenol sinh tạo màu đỏ với thuốc thử diazo Đo cường độ màu, tính hàm lượng quinin quinidin dược liệu - Monnet định lượng quinin phương pháp đo quang dựa vào phản ứng erythroquinin 23 CHƯƠNG III CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG Tên chung quốc tế: Quinine Mã ATC: P01B C01 Loại thuốc: Chống sốt rét Dạng bào chế hàm lượng Viên nén: 300 mg (dưới dạng quinin dihydroclorid quinin hydroclorid) 24 Viên nén bao: 125 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg (dưới dạng quinin sulfat) Ống tiêm dạng quinin dihydroclorid 300 mg/1 ml, 600 mg/2 ml Ống tiêm quinoserum 100 mg/10 ml (Quinin dihydroclorid, dung dịch nước muối đẳng trương) 100 mg quinin base khan tương ứng với: 122 mg quinin dihydroclorid, 122 mg quinin hydroclorid, 121 mg quinin sulfat, 122 mg quinin ethylcarbonat (là chất không đắng), 136 mg quinin hydrobromid, 169 mg quinin bisulfat Các dạng muối quinin sulfat, hydroclorid, dihydroclorid ethyl carbonat có hàm lượng quinin base gần Có thể dùng muối theo liều định cho muối quinin Thông tin qui chế: Quinin có danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ năm 1999 Thuốc dạng tiêm phải kê đơn bán theo đơn 25 Tài liệu tham khảo: Bài giảng Dược liệu Tập I - 1998 Bài giảng Dược liệu Tập II - NXB Y học 2002 Dược điển Việt Nam III Nguyễn Viết Thân - Kiểm nghiệm dược liệu phương pháp hiển vi- NXB khoa học kỹ thuật- 2003 http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp? area=58&cat=1101&ID=5122 http://www.duoclieu.org/2012/07/phuong-phap-danh-gia-duoc-lieu.html http://www.timbacsy.com/vian-nan-quinin-sulfat/ 26 ... phương pháp đánh giá dược liệu chứa alkaloid nói chung dược liệu chứa quinine nói riêng CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phương pháp đánh giá dược liệu: Đánh giá dược liệu nghĩa xác định dược liệu có... đắng dược liệu chứa alkaloid, glucosid; cay ớt, gừng… 1.1.2 Sử dụng kính hiển vi: Phương pháp đánh giá dựa vào kính hiển vi bao gồm vi phẩu soi bột Đây phương pháp hay dùng để kiểm nghiệm dược liệu. .. quan để đánh nhìn bên ngồi hình dáng, kích thước, màu sắc, vài dược liệu cần bẻ để quan sát bên Mùi đặc điểm nhiều dược liệu chứa tinh dầu, nhựa Vị cam thảo, cỏ ngọt; chua dược liệu chứa acid