Nghiên cứu tách tinh chế một số đặc tính của Tyrosinase từ nấm ăn mushroom và khảo sát điều kiện tạo kit Tyrosinase phát hiện nhanh dư lượng hợp chất phenol

Nghiên cứu tách tinh chế một số đặc tính của Tyrosinase từ nấm ăn mushroom và khảo sát điều kiện tạo kit Tyrosinase phát hiện nhanh dư lượng hợp chất phenol Nghiên cứu tách tinh chế một số đặc tính của Tyrosinase từ nấm ăn mushroom và khảo sát điều kiện tạo kit Tyrosinase phát hiện nhanh dư lượng hợp chất phenol luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

bộ giáo dục đào tạo trường đại học bách khoa hµ néi - luận văn thạc sĩ khoa học ngành : công nghệ sinh học nghiên cứu tách tinh chế, số đặc tính tyrosinase từ nấm ăn (mushroom) khảo sát điều kiện tạo kit tyrosinase phát nhanh dư lượng hợp chất phenol đỗ minh trung hà néi 2007 Đỗ Minh Trung MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Đại cương tyrosinase 10 1.1.1 Phức hệ Tyrosinase 10 1.1.2 Cấu tạo tyrosinase 12 1.1.2.1 Vài nét nhóm metalloprotein có chứa đồng 12 1.1.2.2 Cấu tạo tyrosinase 17 1.1.3 Tính chất tyrosinase 19 1.1.4 Cơ chế phản ứng xúc tác enzym tyrosinase 23 1.1.5 Các nguồn thu chế phẩm tyrosinase 27 1.1.6 Tách, tinh chế thu tyrosinase từ nấm ăn 30 1.7 Vai trò ứng dụng tyrosinase 33 1.1.7.1 Vai trò tyrosinase 34 1.1.7.2 Ứng dụng tyrosinase 35 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Đối tượng vật liệu 42 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 42 2.1.2 Hoá chất 42 2.1.3 Thiết bị 42 2.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Thu chế phẩm Tyrosinase từ nấm ăn 43 2.2.2 Kiểm tra độ tinh enzyme phương pháp điện di protein gel polyacrylamide SDS – PAGE 45 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ Tyrosinase 46 2.2.4 Xác định hàm lượng protein tổng số phương pháp Lowry 48 2.2.5 Xác định hoạt độ Tyrosinase phương pháp khuếch tán đĩa thạch 49 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Khảo sát hoạt tính Tyrosinase từ số loại nấm ăn 50 3.2 Tách chiết, tinh chế Tyrosinase từ Agaricus bisporus 53 3.2.1 Tách chiết tyrosinase khảo sát loại dung môi chiết 53 3.2.1.1 Khảo sát loại dung môi chiết 54 3.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đệm kali phosphat đến khả chiết tyrosinase 54 3.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất chống oxi hóa (axit ascobic 0,1M ) đến hoạt tính tyrosinase trình chiết 55 3.2.1.4 Khảo sát hoạt độ tyrosinase phần khác nấm 56 3.2.2 Tinh tyrosinase từ A.bisporus 57 3.2.2.1.Khảo sát tác nhân kết tủa tyrosinase 57 3.2.2.2 Tinh tyrosinase phương pháp sắc ký trao đổi anion (DEAE Shepharose HR 16/10) hệ thống FPLC 60 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung 3.2.2.3 Kiểm tra độ tinh protein phương pháp diện di gel Polyacrylamide SDS-PAGE 63 3.3 Xác định số đặc tính tyrosinase 66 3.3.1 Xác định pH tối ưu tyrosinase 66 3.3.2 Xác định nhiệt độ tối ưu tyrosinase 66 3.3.3 Khảo sát độ bền nhiệt tyrosinase 67 3.3.4 Khảo sát độ bền pH tyrosinase 68 3.3.5 Xác định điểm đẳng điện (pI) tyrosinase 69 3.3.6 Khảo sát động học tyrosinase (Km, Vmax) 70 3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng số ion kim loại chất kìm hãm tới hoạt tính tyrosinase 73 3.4 Ứng dụng tyrosinse phát nhanh hợp chất phenol 74 3.4.1.Khảo sát khả phát hợp chất phenol tyrosinase tự 74 3.4.2 Khảo sát vài yếu tố tạo KIT thử phát nhanh hợp chất phenol 76 3.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tyrosinase gắn chất mang 76 3.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định enzym lên chất mang 77 3.4.2.3 Khảo sát thời gian sấy enzym cố định lên chất mang 78 3.4.2.4 Khảo sát khả phát hợp chất phenol kit tyrosinase 79 3.4.2.5 Khảo sát khả phát hợp chất phenol kit tyrosinase nguồn nước thải có chứa hợp chất phenol 81 3.4.2.6 Khảo sát thời gian bảo quản kit tyrosinase 83 KẾT LUẬN 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 PHỤ LỤC 93 TÓM TẮT LUẬN VĂN 95 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung CÁC CHỮ VIẾT TẮT Da Dalton kDa Kilodalton KC Kiểm chứng TN Thí nghiệm ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ HĐ Hoạt độ HĐTĐ Hoạt độ tương đối HĐT Hoạt độ tổng L- DOPA L- 3,4 dihydroxy phenylalanin EDTA Etylen diamin tetra acetic acid PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PPO Polyphenol oxidase PVPP Polyvinylpolypyrrolidone SDS Sodium dodecylsulfate FPLC Fast performance liquid chromatograph Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 1.1: Một vài tính chất tyrosinase từ số loại nấm Bảng 1.2: Kết bước tinh tyrosinase từ Agaricus bisporus Bảng 2.1 : Bảng thành phần gel SDS –PAGE Bảng 3.1: Bán kính vịng phân giải đĩa thạch dịch tyrosinase thô chiết từ loại nấm khác Bảng 3.2 Hoạt độ tyrosinase từ loại nấm khác xác định theo phương pháp đo quang Bảng 3.3: Ảnh hưởng dung môi đến khả chiết tyrosinase Bảng 3.4: Kết khảo sát tỷ lệ đệm Kali phosphat 25mM, pH = 6,8 dùng chiết Tyrosinase Bảng 3.5: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ axit ascorbic trình chiết Bảng 3.6: Kết chiết tyrosinase từ phần Nấm Mỡ Bảng 3.7: Tủa Ethanol Bảng 3.8: Khảo sát nồng độ acetone kết tủa tyrosinase Bảng 3.9: Kết tủa phân đoạn tyrosinase (NH ) SO Bảng 3.10: Các bước tinh tyrosinase từ Agaricus bisporus Bảng 3.11: Điểm đẳng điện pI Bảng 12 : Kết vận tốc phản ứng chất Bảng 3.13: Kết Km, Vmax chất khác Bảng 3.14: Ảnh hưởng số ion kim loại chất kìm hãm Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Phản ứng chuyển hóa L-tyrosine thành L-DOPA tyrosinase Hình1.2: Phản ứng dehydro hóa catechol oxidase Hình 1.3: Phản ứng chuyển hóa diphenol laccase Hình 1.4: Cấu trúc khơng gian tyrosinase Hình 1.5: Cấu trúc trung tâm hoạt động tyrosinase Hình1.6: Tyrosinase xúc tác chuyển hố hai dạng mono di-phenol Hình 1.7: Cơ chế xúc tác tyrosinase với tham gia phân tử O Hình 1.8: Cơ chế phản ứng tyrosinase Hình 1.9: Nấm mỡ Agaricus bisporus Hình 2.1: Hệ thống chạy sắc ký FPLC Hình 3.1: Vịng phân giải đĩa thạch Hình 3.2: So sánh tác nhân tủa Hình 3.3: Sắc ký đồ tinh tyrosinase từ cột DEAE Shepharose HR 16/10 Hình 3.4: Hoạt tính tyrosinase phân đoạn Hình 3.5: Điện di đồ tinh tyrosinase tren gel polyacrylamide SDS-PAGE Hình 3.6: Qui trình tách chiết, tinh chế tyrosinase từ nấm Agaricus bisporus Hình 3.7: Xác định pH tối ưu Hình 3.8: Xác định nhiệt độ tối ưu Hình 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ tới tính bền tyrosinase Hình 3.10 Khảo sát ảnh hưởng pHtới tính bền tyrosinase Hình 3.11: Cơ chất nồng độ 10-2M sau 20 phút phản ứng Hình 3.12: Cơ chất nồng độ 10-3M sau 20 phút phản ứng Hình 3.13 Cơ chất nồng độ 10-4M sau 20 phút phản ứng Hình 3.14: Ảnh hưởng nồng độ enzym tạo kit phát chất (L-DOPA) Hinh 3.15: Thời gian cố định enzym lên chất mang Hình 3.16: Thời gian sấy enzym cố định Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung Hình 3.17: Khả phát hợp chất phenol kit tyrosinase Hình 3.18: Sơ đồ kiểm tra hợp chất phenol kit tyrosinase Hình 3.19 : Khả phát hợp chất phenol nước thải tyrosinase tự Hình 3.20: Khả phát nhanh hợp chất phenol nước thải kit tyrosinase Hình 3.21: Kit tyrosinase phát hợp chất phenol thời gian đầu bảo quản Hình 3.22: Kit tyrosinase phát hợp chất phenol sau ngày bảo quản Hình 3.23: Kit tyrosinase phát hợp chất phenol sau 14 ngày bảo quản Hình 3.24: Kit tyrosinase phát hợp chất phenol sau 21 ngày bảo quản Hình 3.25: Hộp túi bảo quản kit tyrosinase Đồ thị 3.1: Xác định Km, Vmax với chất L-DOPA Đồ thị 3.2: Xác định Km, Vmax với chất Catechol Đồ thị 3.3: Xác định Km, Vmax với chất L-tyrosine Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung MỞ ĐẦU Tyrosinase (EC 1.14.18.1) enzym thuộc nhóm kim loại có chứa nguyên tử kim loại Cu phân tử thuộc họ polyphenoloxydase (PPO) Tyrosinase có khả hydroxyl hố chất họ monophenol tạo thành o-diphenol sau có khả chuyển hoá tiếp hợp chất o-diphenol thành hợp chất o-quinon chất có liên quan tới hình thành chất trung gian tạo nên chất có màu nâu sẫm Bởi vậy, tyrosinase ứng dụng nhiều lĩnh vực y học, nông nghiệp, lĩnh vực xử lý mơi trường, ứng dụng có triển vọng tyrosinase xử lý môi trường khả phát loại bỏ dư lượng hợp chất phenol Phenol dẫn xuất chúng chất độc, sử dụng rộng rãi ngành cơng nghiệp hố chất, sản xuất nhựa, bột giặt, phế thải ngành sản xuất than đá, tinh chế dầu hoả v.v Các hợp chất phenol thường xác định phương pháp sắc ký đo quang Các phương pháp nhạy nhược điểm chi phí tốn kém, thời gian phân tích lâu Một ứng dụng có triển vọng nhà khoa học nước quan tâm dùng Tyrosinase tạo điện cực sinh học kiểm tra hợp chất phenol có sản phẩm nông nghiệp, thực phẩm, xử lý môi trường rút ngắn thời gian nhiều Tyrosinase có mặt loại động vật có vú, loại động vật không xương sống, thực vật vi sinh vật, với chức sinh học có khác lớn Tyrosinase từ động vật có vú lần mơ tả với liên quan phát triển u tế bào vấn đề sắc tố bệnh bạch tạng bệnh lang trắng Trong nấm, tyrosinase nói chung liên quan tới hình thành bền vững bào tử, liên quan tới chế phòng vệ chế gây độc liên quan tới nâu hố hình thành sắc tố Trong suốt thập kỉ gần đây, nghiên cứu tập trung vào Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung tyrosinase tách chiết từ loại nấm ăn Agaricus bisporus, với ưu hẳn hoạt độ enzym cao, nguồn nguyên liệu phổ biến rẻ tiền, quy trình tách chiết lại đơn giản Xuất phát từ tiềm ứng dụng tyrosinase, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tách tinh chế, số đặc tính từ nấm ăn (Mushroom) khảo sát điều kiện tạo kit tyrosinase phát nhanh dư lượng hợp chất phenol” Nội dung đề tài: - Khảo sát số loại nấm thực vật, chọn loại nấm có hoạt lực tyrosinase cao - Khảo sát phương pháp chiết tyrosinase - Tách tinh chế phương pháp kết tủa muối, dung môi hữu - Sắc ký qua cột trao đổi anion - Điện di kiểm tra độ tinh - Xác định số đặc tính tyrosinase - Tìm điều kiện thích hợp cố định tối ưu chất mang để tạo kit enzym phát nhanh hợp chất phenol - Khảo sát khả phát hợp chất phenol kit tyrosinase Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung ● Khảo sát khả phát hợp chất phenol nước thải kit tyrosinase: Hình 3.20: Khả phát nhanh hợp chất phenol kit yyrosinase TN: thí nghiệm; KC: kiểm chứng; 1: nước thải khu vực sản xuất nhựa; 2; nước thải khu vực bãi rác; 3: nước thải nơi sản xuất hoá chất; 4: nước thải khu vực sản xuất thuốc; 5: nước thải khu vực xăng dầu; 6: nước thải khu sản xuất chè Kết hình 3.21 cho thấy tyrosinase tự Kit tyrosinase có khả phát hợp chất phenol nguồn nước thải 1,4,6 nồng độ 10-4 (so với thang chuẩn) Dựa vào so sánh mầu kiểm chứng thí nghiệm, mẫu thí nghiệm xuất mầu nâu nhạt đến nâu sẫm chứng tỏ nước thải có chứa hợp chất phenol 82 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung 3.4.2.6 Khảo sát thời gian bảo quản kit tyrosinase Enzym có chất protein nên q trình bảo quản dễ chịu tác động nhiều yếu tố (pH mơi trường, nhiệt độ, nhiễm khuẩn ) Vì vậy, cần tìm điều kiện thích hợp cho q trình bảo quản nhằm mục đích giữ cho enzym khơng bị giảm hoạt độ nhanh để phục vụ tốt cho trình ứng dụng Tyrosinase enzym tương đối bền điều kiện pH = 6-7 nhiệt độ thường Vì ta sử dụng số phương pháp bảo quản thông dụng, dễ ứng dụng Chúng tiến hành nghiên cứu bảo quản kit tyrosinase ba chế độ nhiệt độ khác : nhiệt độ 0oC, nhiệt độ 40C nhiệt độ phòng ngày lấy mẫu lần để kiểm tra khả phát hợp chất phenol Kết trình bày hình sau Hình 3.21: Kit tyrosinase phát hợp chất phenol thời gian đầu bảo quản 83 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung Hình 3.22: Kit tyrosinase phát hợp chất phenol sau ngày bảo quản Hình 3.23: Kit tyrosinase phát hợp chất phenol sau 14 ngày bảo quản 84 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung Hình 3.24: Kit tyrosinase phát hợp chất phenol sau 21 ngày bảo quản Từ kết hình phương pháp nhận biết mầu mắt cho thấy, bảo quản Kit Tyrosinase nhiệt độ phịng khả phát hợp chất phenol nồng độ 10-4 giảm sau 14 ngày có khả phát hợp chất phenol nồng độ 10-2, 10-3, (hình 3.24), sau 21 ngày khả phát 10-3 giảm, phát hợp chất phenol 10-2 (hình 3.25) Đồng thời quan sát mầu sắc que thử bảo quản nhiệt độ OoC 4oC sau 21 ngày phát hợp chất phenol nồng độ 10-2, 10-3, 10-4 so với mầu sắc kết ban đầu trước bảo quản Để thuận tiện sử dụng, chọn phương án bảo quản nhiệt độ 4oC để lưu giữ Kit Tyrosinase nhằm phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng Các que thử Tyrosinase Kit bảo quản 4oC bảo quản hộp nhựa kích thước 14×9, hộp có nhiều túi PE kích thước 8×5, 85 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung Hình 3.25: Hộp túi bảo quản Kit Tyrosinase 86 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung KẾT LUẬN 1.Đã chọn loại nấm mỡ Agaricus bisporus.cho hoạt lực tyrosinase cao (2364,55U/g nấm) 2.Tìm điều kiện thich hợp để chiết tyrosinase từ nấm mỡ Agaricus bisporus với hiệu suất cao: - Dung môi chiết: đệm phosphate 25 mM, pH=6,8 Với tỷ lệ dung môi: nấm 5:1, axit ascorbic 0,1M 5% Tác nhân kết tủa cho hiệu suất thu hồi tyrosinase cao acetone với tỉ lệ 1.5:1 Kết hợp với sắc ký trao đổi anion cột DEAE Sepharose HR16/10 hệ thống FPLC, thu chế phẩm Tyrosinase mức độ gấp 53,3 lần , hiệu suất thu hồi 4,4 % hoạt độ riêng enzym: 1654,36 U/mg protein Đã khảo sát số đặc tính tyrosinase - t opt = 35 ºC, bền vùng 25oC-35 °C - pH opt = 6,8, bền vùng pH= 6-7 - pI = - Các thông số động học: Đối với chất L-DOPA: Km = 0,36 mM/l, Vmax = 3,636 μ/phút Đối với chất Catechol: Km = 0,46 mM/l, Vmax= 1,642 μ/phút Đối với chất L-Tyrosine: Km = 0,67 mM, Vmax= 0,061 μ/phút - Cơ chất đặc hiệu tyrosinase L-DOPA - Tìm chất kìm hãm dặc hiệu tyrosinase EDTA Các ion kim loại nồng độ Cu2+ 1mM, Ni2+ 0,5mM, 1mM kìm hãm tyrosinase, nồng độ thấp Cu2+ 0,1mM, 0,5mM, Ni2+ 0,1mM, Fe2+ μg/ml, μg/ml, μg/ml không ảnh hưởng nhiều tới hoạt tính tyrosinase 87 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung Tyrosinase có khả phát chất monophenol diphenol tyrosinase nồng độ 10-2-10-4M Bước đầu tìm số thông số tạo KIT thử phát nhanh hợp chất phenol - Nồng độ tyrosinase thích hợp cố định lên chất mang 50U/ml, thời gian 10 phút - Nhiệt độ sấy 30oC - Thời gian sấy - Bảo quản 4oC - Kit Tyrosinase có khả phát hợp chất monophenol diphenol nồng độ 10-2-10-4M, có khả phát hợp chất phenol nguồn nước thải chứa hợp chất phenol: nước thải khu vực sản xuất nhựa, sản xuất thuốc, khu sản xuất chè 88 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, (2004), Công nghệ enzym Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2001), Công nghệ nuôi trồng nấm Tập Nxb Nông nghiệp Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Enzym ứng dụng Tập Nxb Giáo dục TIẾNG ANH Simone Bouchilloux, P McMahill H.S Mason (1963), The multiple forms mushroom tyrosinase, purification and molecular properties of the enzyme Vol No The Journal of Biological chemistry Dukworth, H.W and Coleman,J.E (1970) Physicochemical and kinetic properties of mushroom tyrosinase J Biol Chem 245, 1613-1625 Kwang-Hoon Kong, Nin-PyoHong, Sang-Sook Choi, Yong-Tare Kim and Sung- Hye Cho (2000), Purrification and characterization of a highly stable tyrosinase from Thermonicrobium roseum Biotechnol, Apple, Biochem 31, 113-118 Rodriquez, M O and Flurkey, W H A (1992), Mushroom Tyrosinase Experiment Biochemistry Project to Study Mushroom Tyrosinase J chem.Ed 69(9)767–769 Lukas A, Mueller, Ursula Hinzs and Jean-Pierre Zryd (1996), Characterization of a Tyrosinase from amanita muscaria involved in Betalain biossynthesis Phytochemistry, vol, 42 No.6, pp 1511-1515 Nonhyun-dong, Kangnam-Ku, Seul, Korea (2000), Application Note The Measurement of Tyrosinase activity using PDA UV-Vis Spectrophotomete Sinco.com/ application_data_en/AB2009.pdf 89 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung 10 Sang W Choi and Gerald M Sapers J Agric (1994), Effects of Washing on Polyphenols and Polyphenol Oxidase in Commercial Mushrooms (Agaricus bisporus), Food Chem 42, 2286-2290 11 J.B.Pridham (1963), Enzyme chemistry of phenolic compounds Pergamon press 12 Antonius Johannus Maria Schoot Uiterkamp (1973), Copper pairs in proteins an epr and optical study of hemocyanin and tyrosinase Rijksuniveriteit Groningen 13 R.L Jolley, Jr Donald, A.Robb and H.S.Mason (1969), The multiple forms of mushroom tyrosinase Association-Dissociation phenomena Vol 244 No pp 1593-1599 The Journal of Biological Chemistry 14 Robert A Copeland (2000), Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis Wiley-VCH, Inc 15 F Garcia-Molina, J.L Munoz, P.A Garcia-Ruiz, J.N RodriguezLopez, Garcia-Canovas and J Tudela (2006), A further step in the kinetic characterisation of the tyrosinase enzymatic system Journal of Mathematical Chemistry 16 D Koeni, A Popov B Krebs, (2000) Institut fur Anorganische und Analytische Chemie, Universitat Munster, Wilhelm-Klemm-Strasse 2, D-48149 Munster, Germany Crystal structure investigations on a tyrosinase from mushroom Institut fur Biochemie, Universitat Munster, Hamburg, Germany 17 Jan Haavik, (1997) L-DOPA is a substrate for tyrosine hydroxylase Journal of Neurochemistry 69,1720-1728 18 Biochemistry Laboratory I, (2005) Mornitoring the enzymatic activity of mushroom tyrosinase Biochemistry Laboratory I 19 Rodriquez, M.O and Flurkey, W.H (1992) Kinetic analysis of the enzyme tyrosinase A two week project J.Chem.Ed 69(9) 767-769 90 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung 20 Qing-Xi Chen, Li-Na Ke, Kang-Kang Song, Huang Huang, and Xiao-Dan Liu, (2004) Inhibitory effects of Hexylresorcinol and Dodecylresorcinol on mushroom (Agaricus bisporus) tyrosinase The protein journal, Vol.23, No.2 21 Qing-Xi Chen, Huang Huang and Isao Kubo, (2003) Inactivation kinetics of mushroom tyrosinase by Cetylpyridinium Chloride Journal of protein chemistry, Vol.22, No.5 22 Qin Wang, Yan Shi, , Kang-Kang Song, Hua-yun Guo, Ling Qiu, and Qing-Xi Chen (2004) Inhibitory effects of 4-halobenzoic acids on the diphenolase and monophenolase activity of mushroom tyrosinase The protein journal, Vol.23, No.5 23 Yuan Cun-guang (1997) Progress of optical determination for phenolic compounds in sewage Department of Chemical Engineering University of Petroleum Shandong Dongying 257062 China 24 Thomas Klabunde, Christoph Eicken, James C Sacchettini & Bernt Krebs, (1998) Crystal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center Nature Structural Biology 5, 1084 - 1090 25 S Halaouli, M Asther, J.-C Sigoillot, M Hamdi, A Lomascolo, (2006) Fungal tyrosinases: new prospects in molecular characteristics, bioengineering and biotechnological applications Journal of Applied Microbiology 100 (2), 219–232 26 Erhan Astarci (2003): Production and Biochemical Characterization of Polyphenol Oxidase From Thermomyces Lanuginosus, A Thesis Submitted To The Granduate School of Natural and Applied Sciens of The Middle East Technical University 27 Prof G.W Canters, (2005) Structure and Mechanism of the Type-3 Copper Protein Tyrosinase Armand Wilbrandt Jannes Wichert Tepper 28 Katrin Streffer, (2002) Highly sensitive measurements of substrates and inhibitors on the basis of tyrosinase sensors and recycling systems Mathematisch -Naturwissenschaftlichten Fakultat der Universitat Postdam 91 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung 29 Biochemistry Laboratory I, (2005) Effect of Cationic Metals on Mushroom Tyrosinase Activity Biochemistry Laboratory I 30 Tetshushi Naraoka , Hidemitsu Uchisawa , Haruhide Mori, Hajime Matsue, Seiya Chiba and Atsuo Kimura, (2003) Purification, charactericzation and olecular cloning of Tyrosinase from the cephalopod mollusk, illex argentinus Eur J Biochem 270, 4026-4038 31 Huber, M and Lerch, K, (1988) Identification of two histidines as copper ligands in Streptomyces glaucescens tyrosinase Biochemistry 27, 5610–5615 32 Chunhua Shi, Ya Dai, Bingle Xia, Xiaolong Xu, Yongshu Xie,and Qingliang Liu, (2001) The Purification and Spectral Properties of Polyphenol Oxidase I from Nicotiana tabacum Plant Molecular Biology Reporter 19: 381–381 33 Parkinson, N., Smith, I., Weaver, R., and Edwards, J P (2001) A new form of arthropod phenoloxidase is abundant in venom of the parasitoi Insect Biochem Mol Biol 31, 57-63 34 Fujita, Y., Uraga, Y and Ichishima, (1995) Molecular cloning and nucleotide sequence of the protyrosinase gene, melO, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells Biochem Biophys Acta 1261, 151–154 35 Sigma Productinformatior (1994), Sigma quakity control test procedure Enzymatic assay of tyrosinase Sigma prod No.T7755 36 P.V.Climent, M.L.M.Serralheiro, and M.J.F.Rebelo (2001), Development of a new amperometric biosensor based on polyphenoloxidase and polyethersulphone membrane Pure Appl Chem Vol 73, No.12, pp 1993-1999 37 John M Walker (2002), The Protein Protocols Handbook Humana press Inc 38 Y.Shi , A.E James , I.F.F Benzic and J.A.Busewell, (2002) Genoprotective effects of selected mushroom species WSMBMP the 4th ICBMP 92 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung PHỤ LỤC Bảng 3.7: Xác định pH tối ưu pH ĐVHĐ (U/ml) HĐTĐ (%) 997,10 76,68 5,5 988,87 77,75 1067,00 83,92 6,5 1170,50 92,07 6,8 1271,45 100 1136,02 89,32 7,5 1035,96 81,50 842,56 66,30 Bảng 3.8: Xác định nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ (oC) ĐVHĐ (U/ml) HĐTĐ (%) 10 605,18 40,83 15 784,45 52,93 20 1021,24 68,90 25 1306,72 88,19 30 1382,40 93,29 35 1482,13 100 40 1407,88 94,99 45 1187,91 80,15 50 848,86 57,28 60 633,18 42,72 93 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ tới tính bền tyrosinase 10 15 100 100 98,41 97,57 95,24 93,13 92,6 90,49 87,53 84,67 83,3 25 100 97,15 96,83 92,81 91,12 87,21 84,04 81,82 78,01 76,96 74,63 30 100 95,67 94,08 91,86 88,68 84,36 83,19 79,6 77,17 75,69 73,47 35 100 95,03 90,7 89,11 87,74 83,93 76,00 73,04 67,97 62,68 54,12 40 100 94,89 88,53 83,62 80,78 75,23 62,05 57,26 51,19 48,68 34,94 50 100 63,74 45,67 43,45 36,79 34,04 30,55 27,27 26,96 26,32 24,02 60 100 22,62 21,78 20,93 18,6 17,44 14,38 13,53 12,47 11,663 10,89 94 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung 3.10 Khảo sát ảnh hưởng pH tới tính bền tyrosinase Thời gian pH=5 pH=6 pH=6.5 pH=6,8 pH=7 pH=8 100 100 100 100 100 99.6 27.346 69.417 88.025 98.7 99.676 62.135 24.919 62.135 81.553 91.909 98.534 55.016 22.977 54.854 80.582 86.084 97.402 45.631 21.197 52.427 80.258 82.847 95.307 43.851 18.77 49.514 73.984 79.288 94.822 43.527 16.181 48.381 70.873 71.521 92.394 43.203 14.077 47.734 66.828 68.122 90.776 41.423 11.65 43.689 63.268 64.724 88.834 40.291 9.061 42.556 60.841 62.459 82.524 35.599 10 8.09 39.32 56.796 57.605 79.126 31.391 95 Luận văn thạc sỹ khoa học Đỗ Minh Trung TĨM TẮT LUẬN VĂN Tyrosinase (EC 1.14.18.1) có khả xúc tác cho loại phản ứng :phản ứng hydroxyl hoá monophenol tạo thành o-diphenol phản ứng oxi hóa o-diphenol tạo thành o-quinon chất có liên quan tới hình thành chất màu nâu sẫm Enzym tìm thấy lần lồi nấm ăn Agaricus bisporus Tính đặc hiệu tyrosinase hợp chất phenol giúp cho việc phát loại bỏ dư lượng độc tố họ phenol Phenol dẫn xuất chúng chất độc, sử dụng rộng rãi ngành cơng nghiệp hố chất, sản xuất nhựa phế thải ngành sản xuất than đá, tinh chế dầu hoả Các hợp chất phenol thường xác định phương pháp sắc ký đo quang nhược điểm chi phí tốn kém, thời gian phân tích lâu Do chúng tơi tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu tách tinh chế, số đặc tính từ nấm ăn(Mushroom) khảo sát điều kiện tạo kit tyrosinase phát nhanh dư lượng hợp chất phenol)” Một số kết thu sau : tìm loại nấm ăn cho hoạt tính tyrosinase cao Agaricus bisporus, tìm dung mơi thích hợp để chiết tyrosinase đệm phosphat 25mM, tác nhân kết tủa enzym tốt acetone, tinh chế tyrosinase cột DEAE Sepharose HR16/10 thu tyrosinase tinh khiết, Đã xác định số đặc tính tyrosinase bước đầu tìm điều kiện thích hợp cố định tyrosinase lên chất mang tạo kit Bước đầu khảo sát khả phát nhanh hợp chất phenol chuẩn phenol có nước thải số nhà máy sản suất công nghiệp (1: sản xuất nhựa, 4: sản xuất thuốc, 6: sản xuất chè) tyrosinase tự kit tyrosinase cho kết tốt Từ khoá: Tyrosinase, Kit, Mushroom, Polyphenol oxidase, Enzyme 96 Luận văn thạc sỹ khoa học ... phát từ tiềm ứng dụng tyrosinase, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu tách tinh chế, số đặc tính từ nấm ăn (Mushroom) khảo sát điều kiện tạo kit tyrosinase phát nhanh dư lượng hợp chất phenol? ??... kiểm tra độ tinh - Xác định số đặc tính tyrosinase - Tìm điều kiện thích hợp cố định tối ưu chất mang để tạo kit enzym phát nhanh hợp chất phenol - Khảo sát khả phát hợp chất phenol kit tyrosinase. .. hoạt tính tyrosinase 73 3.4 Ứng dụng tyrosinse phát nhanh hợp chất phenol 74 3.4.1 .Khảo sát khả phát hợp chất phenol tyrosinase tự 74 3.4.2 Khảo sát vài yếu tố tạo KIT thử phát nhanh