Ứng dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh

Ứng dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Ứng dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh Ứng dụng thử nghiệm công nghệ rna interference vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tôm càng xanh luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM CÔNG NGHỆ RNA INTERFERENCE VÀO NGHIÊN CỨU CHUYỂN ĐỔI GIỚI TÍNH TƠM CÀNG XANH Macrobrachium Rosenbergii (De Man, 1879) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : Nguyễn Thị An Cán hướng dẫn : Th.S Bùi Thị Liên Hà MSSV: Lớp: 08DSH4 TP Hồ Chí Minh, 2012 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) (De Man, 1879) lồi tơm nước có giá trị quan trọng đóng vai trị lớn nghề ni trồng thủy sản nhiều nước nhiệt đới cận nhiệt đới Trong năm gần đây, việc nuôi tôm xanh Việt Nam phát triển cách mạnh mẽ, đặc biệt khu vực nuôi tôm thương mại lưu vực sông Mê Kông mở rộng 8000 sản lượng đạt 10000 năm 2010 (Hai, 2010) Do nhu cầu giống cho việc nuôi đại trà lớn Tuy nhiên, nghề nuôi tôm xanh gặp nhiều khó khăn đặc điểm sinh học chúng Những tôm xanh đực thường lớn nhanh gấp bốn năm lần tôm quần thể thời gian nuôi, điều dẫn tới cạnh tranh thức ăn, môi trường sống gây tượng ăn thịt đồng loại Thông thường, khác kích thước tơm thấy mắt giai đoạn trưởng thành giới tính, ngưng phát triển tập trung dưỡng chất cho việc sinh sản (Cohen, 1984), đực tiếp tục phát triển đạt kích thước lớn so với trưởng thành Những vấn đề ảnh hưởng tới sản lượng thu hoạch lợi ích kinh tế kích thước tơm lớn giá thành cao Việc ni tơm xanh tồn đực đạt sản lượng cao việc ni tồn hay đực quần thể (Sagi Ra’anan, 1988) Khối lượng trung bình quần thể 473 g/m2, 248 g/m2 260 g/m2 Những nhà khoa học Ả Rập Xê Út báo cáo kết tương tự tiến hành thí nghiệm ni tơm tồn đực, tồn hỗn hợp đực (Siddiqui, 1997) Điều thể việc ni tơm xanh tồn đực làm tăng sản lượng cách đáng kể mang lại lợi nhuận cao việc ni tồn hay hỗn hợp đực Vì thế, việc nghiên cứu phát triển số kỹ thuật tạo quần thể tơm xanh tồn đực nhu cầu cần thiết Đồ án tốt nghiệp Kỹ thuật bất hoạt RNA (Guo Kempheus, 1995) sử dụng công cụ hiệu để hiểu rõ chức gene quy định tính trạng cách tiêm RNA mạch đôi vào thể giáp xác (Tiu, 2007; Hiu, 2008) Ý tưởng tạo giả cách làm bất hoạt RNA thơng tin mã hóa gene tuyến đực insuline–like tơm xanh (Macrobrachium rosenbergii insulin–like androgeneic gland, Mr–IAG) RNA mạch đôi (dsRNA) thực thành công quy mơ phịng thí nghiệm (Ventura ctv, 2009) Kể từ đó, kỹ thuật bất hoạt RNA hứa hẹn hướng tiếp cận để tạo quần thể tơm tồn đực cho việc ni tơm xanh thương mại Chính lý mà đề tài “Ứng dụng thử nghiệm công nghệ iRNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii” tiến hành 1.2 Mục đích đề tài Mục đích việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật bất hoạt RNA để tạo giả phục vụ cho cơng tác tạo tơm xanh tồn đực với Mr–IAG gene mục tiêu 1.3 Nội dung đề tài Nghiên cứu công nghệ bất hoạt RNA thơng qua quy trình tổng hợp double stranded RNA theo Kit hãng Promega Ambion Kiểm tra hiệu sợi đôi dsRNA thực nghiệm chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan tuyến đực tôm xanh Macrobrachium rosenbergii 2.1.1 Phụ đực Phụ đực quan giao cấu tơm xanh đực xuất chân bơi thứ hai Chồi phụ đực bắt đầu xuất vào giai đoạn khoảng 70 ngày tuổi sau giai đoạn postlarve (trọng lượng 0,38g; tổng chiều dài 3,7 cm) đến giai đoạn 94 ngày tuổi phụ đực phát triển đầy đủ (Chung Quang Trí, 2006) Hình 2.1 Chân bơi thứ tơm xanh đực 2.1.2 Tuyến đực Những tế bào thuộc tuyến đực quan sát Faxon (1884) tôm nước Cambarus montanus (Faxon, 1884) Tuyến hormon xác định sau giáp xác Orchestia gammarellus vào 1953 mơ gọi tuyến đực (Charniaux–Cotton, 1953) Những nghiên cứu sau cho thấy rõ tuyến đực, lớp mơ mỏng gắn phần cuối ống dẫn tinh tôm nước Procambarus blandingii, P viaeviridis, Camb bartonni Camb diogenes (Puckett, 1964) Những cấu trúc tương tự quan sát cua Scylla serrata (King, 1964) Ở giáp xác tinh sào nơi tạo tinh trùng quan tạo hormon tuyến đực Nếu đực động vật có xương sống, tuyến sinh dục (tinh sào) có hai chức tạo tinh trùng nội tiết testosterone tơm xanh nhiều động vật giáp xác thuộc mười chân Decapoda khác hai chức Đồ án tốt nghiệp thực hai quan riêng lẻ Tinh sào tôm xanh chuyên tạo tinh, tuyến đực (androgenic gland) – quan biệt lập khác có chức tiết hormon, tham gia vào biệt hố giới tính phát triển đặc điểm sinh dục thứ cấp, ảnh hưởng lên kích thước tăng trưởng (Sagi, 2001) Ở tơm đực lớn người ta thấy tuyến đực tương đối rõ Đó khối tế bào có hình kim tự tháp, dính với phần sau ống phóng tinh Cũng tuyến sinh dục ống dẫn tinh, tuyến đực chịu ức chế tuyến nội tiết nằm cuống mắt tơm Hình 2.2 Tuyến đực tơm xanh có hình kim tự tháp cuối ống dẫn tinh Sự tồn tuyến đực xác nhận nhiều loài giáp xác, chúng tiết hormon có tác động lên biệt hố giới tính (Chaniaux–Cotton Payen, 1985; Katakura, 1989) Tuyến AG có vai trị lên biệt hóa giới tính trình lột xác Charniaux– Cotton chứng minh việc cắt bỏ tuyến AG Orchestia gammarella làm giảm sinh tinh trùng đực (Charniaux–Cotton, 1954) 2.1.3 Hormon tuyến đực Hormon tuyến đực tinh chế tìm nhóm giáp xác chân Armadilidium vulgare protein gồm có ba chuỗi peptid A (chứa 29aa), B (44aa), C (45aa), chuỗi A aa thứ 18 cịn có thêm nhóm carboxyl (Martin ctv, 1999) Trọng lượng phân tử hormon khoảng 16.570 Da Khi tiến hành tiêm hormon tuyến đực cho nhỏ, sau này phát triển thành đực, cho giao vĩ với có chức sinh sản cho hệ Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3 Cấu trúc phân tử hormon tuyến đực (Martin ctv, 1999) 2.1.4 Tác động tuyến đực lên phân hóa giới tính tơm xanh Tuyến androgenic (AG) quan nội tiết đực, có vai trị quan trọng việc hình thành giới tính đặc tính sinh dục thứ cấp (Ohs ctv, 2006) AG nằm cuối ống dẫn tinh, gần lỗ mở sinh dục liên kết lõng lẻo với ống dẫn tinh AGH hormon điều khiển biệt hóa giới tính thành đực phát triển đặc điểm sinh dục đực thứ cấp Sự tiết GSH GIH cho quy định số chất dẫn truyền thần kinh tác động trực tiếp vào buồng trứng Ở đực, GIH tác động lên tinh hoàn gián tiếp điều khiển AG sau giảm tiết AGH Hormon kích thích tuyến sinh dục cần thiết để có sinh tinh xảy tinh hoàn (Fingerman, 1997) AG tham gia vào q trình biệt hóa giới tính đực thơng qua việc tiết hormon AGH tín hiệu ban đầu tất bước cần thiết trình biệt hóa giới tính phát triển đặc điểm đực (Ohs ctv, 2006) Nếu khơng có AG tiết AGH khơng đủ tuyến sinh dục biệt hóa thành tuyến sinh dục (Sagi ctv, 1995) Sự phát triển AG cho dấu hiệu tín hiệu di truyền (Ohs ctv, 2006) Sự cắt bỏ tuyến androgenic tôm xanh Macrobrachium rosenbergii giai đoạn cịn non gây đảo giới hồn tồn, với hóa tính trạng sinh dục sơ cấp thứ cấp vật sinh sản (Sagi ctv, 1990; Sagi ctv, 1997) Đồ án tốt nghiệp 2.2 Cơng nghệ chuyển đổi giới tính tơm xanh 2.2.1 Cơ sở lý thuyết tạo dịng tơm xanh tồn đực Cặp nhiễm sắc thể giới tính tôm xanh đực đồng giao tử (ZZ) dị giao tử (WZ) Để tạo dòng đơn tính tồn đực (100% tơm đực ZZ) cần có tơm bố tơm mẹ có NST ZZ Để tạo dịng tồn đực việc cần thiết để tạo tôm giả mang NST ZZ Male: ♂ (ZZ) X Female: ♀ (ZZ) 100% ♂ (ZZ) Hình 2.4 Sơ đồ tạo dịng đơn tính đực Sagi Cohen cho biết cho chuyển giới khoẻ mạnh lai với đực thông thường cho dịng tồn đực (Sagi, Cohen, 1990) 2.2.2 Các phương pháp tạo tôm xanh giả 2.2.2.1 Vi phẩu loại bỏ tuyến đực Tơm chưa trưởng thành thực vi phẫu loại bỏ tuyến androgene tôm đực, dẫn đến tạo trứng, phát triển vòi trứng lỗ sinh sản đực chuyển giới giai đoạn phát triển cịn non Tơm đực sau phát triển thành (Nagamine ctv, 1980) Việc loại bỏ AG đực, làm AGH gây nên tượng: đực thành mang NST ZZ Kỹ thuật vi phẫu loại bỏ tuyến androgenic thực lần Sagi (Sagi ctv, 1990) Ở Việt Nam, kỹ thuật vi phẫu thực thành công năm 2004 (Nguyễn Văn Hảo ctv, 2004) Kỹ thuật vi phẫu kỹ thuật tạo tơm giả để sản xuất tơm tồn đực phổ biến Tuy nhiên kỹ thuật cần có kỹ thuật viên có tay nghề cao, cần nhiều người để sản xuất số lượng tôm giả lớn, chi phí sản xuất lớn, tỷ lệ tơm vi phẫu thành tơm giả sinh sản khơng ổn định Vì vậy, cần tìm phương pháp để cải thiện hạn chế kỹ thuật vi phẫu nhằm tạo nguồn tơm tồn đực để tăng sản lượng cho người nuôi Đồ án tốt nghiệp 2.2.2.2 Cấy tuyến đực vào tôm Sự biệt hóa giới tính ngược isopod Armadillidium vulgare, gây việc cấy AG vào cái, sau bắt đầu biệt hóa hình thái giới tính Ở tơm xanh, việc cấy AG đực trưởng thành vào chưa trưởng thành, kết biệt hóa ngược thành đực (Nagamine ctv, 1980) Tuy nhiên, khả sống sau cấy AG thấp (Ohs ctv, 2006) 2.2.2.3 Sử dụng hormon Hiện nay, steroid sử dụng để thay đổi kiểu hình giới tính cá ngâm tiêm qua chế độ ăn trước biệt hóa giới tính Điều mang lại hy vọng việc sử dụng hormon để điều khiển giới tính động vật giáp xác Điều khiển chế độ ăn chứa hormon xem phương pháp thiết thực quy mô thương mại Tuy nhiên, phương pháp mang lại thách thức khả hormon rò rỉ từ viên thức ăn từ cố tiêu hóa, đặc biệt thay đổi thức ăn chế biến trước tiêu thụ (Ohs ctv, 2006) Dewi cộng dùng hormon 17β–estradiol bổ sung vào thức ăn để điều khiển giới tính tơm xanh Kết thu 17β–estradiol không ảnh hưởng đến tỷ lệ đực tôm xanh (Dewi ctv, 2006) Baghel cộng nghiên cứu ảnh hưởng chuyển đổi giới tính cho ấu trùng tơm xanh ăn artemia làm giàu với 17α–methyltestosterone, dạng steroid động vật có xương sống, kết cho thấy 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính tơm xanh từ thành đực (Baghel ctv, 2004) Nhưng sau đó, Ohs cộng dùng 17α–methyltestosteron bổ sung vào thức ăn để chuyển giới tính tơm xanh Tuy nhiên, kết lại cho thấy 17α– methyltestosteron khơng có tác dụng việc chuyển đổi giới tính tôm xanh (Ohs ctv, 2006) Như vậy, 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính tơm xanh chưa xác định Ohs cộng cho hậu ấu trùng tôm xanh thường (50% đực, 50% cái) ăn thức ăn có bổ sung dopamine với nồng độ 0,15; 1,5; 15 ppm vòng 60 ngày (Ohs ctv, 2006) Kết nhóm đối chứng có tỷ lệ tơm 62,6%, Đồ án tốt nghiệp nghiệm thức cho tôm ăn thức ăn bổ sung dopamine với nồng độ 0,15; 1,5 15 mg/kg có tỷ lệ tơm là: 80,9%; 88%; 71% Kết cho thấy có chênh lệch đáng kể nhóm khơng có cho ăn thức ăn có bổ sung dopamine Thử nghiệm tạo tiềm sử dụng dopamine để tạo tơm xanh tồn đực phục vụ cho sản xuất 2.3 Giới thiệu cộng nghệ iRNA ứng dụng tạo tôm xanh giả 2.3.1 Giới thiệu iRNA Công nghệ iRNA gây bất hoạt gene công cụ đầy hứa hẹn chế điều khiển hoạt hóa gene phổ biến thể sống nhân thực iRNA trình làm bất hoạt gene cách đặc thù, làm bất hoạt gene (gene đích) có trình tự tương đồng với tác nhân gây bất hoạt gene (các sợi RNA ngắn khoảng 21–27 nucleotide) iRNA tham gia điều khiển hoạt hóa gene giai đoạn phiên mã gene – ngăn cản sinh tổng hợp RNA giai đoạn sau phiên mã – phân hủy mRNA làm triệt tiêu sinh tổng hợp protein (Đỗ Năng Vịnh, 2007) Can thiệp RNA (iRNA) sợi đơi RNA (dsRNA), có tác động đặc hiệu với trình tự mục tiêu, thúc đẩy phân hủy ngăn chặn biểu trình tự mục tiêu (Chen ctv, 2003) Sự can thiệp RNA thông qua trung gian dsRNA chế bất hoạt gene sau phiên mã (PTGS) bảo tồn suốt q trình phát triển Nó biểu mức độ phiên mã dịch mã trình chép nội sinh mức nhiễm sắc cách hình thành vùng chất nhiễm sắc thể nhân (Hannon, 2002) iRNA tượng Neurospora crassa, trình tự RNA tương đồng có khả chế ngự gene nội sinh (Romano Macino, 1992) Dựa thành tựu chương trình Geneomics trình tự hầu hết gene quan trọng xác định, từ thiết kế dsRNA tương đồng để gây bất hoạt gene đích Cơng nghệ iRNA tạo cách mạng nghiên cứu y sinh chữa bệnh Ý nghĩa khoa học tiềm ứng dụng to lớn công nghệ iRNA nhiều tác giả đề cập, họ cho “một công nghệ đầy uy lực”, “cuộc cách mạng iRNA” (Archana, 2003; Ajit, 2007) Năm 1998, hai nhà Đồ án tốt nghiệp Hình 4.10 Kiểm tra chất lượng RNA mạch đôi (dsRNA) Giếng 1: chứng âm; Giếng 2: thang DNA; Giếng 3: dsRNA sau tổng hợp nên T7 RiboMax iRNA System Kit; Giếng 4: dsRNA xử lý DNase; Giếng 5: xử lý RNase III; Giếng 6: xử lý RNase A Sau tổng hợp sợi đôi RNA, tiến hành kiểm tra lần để đảm bảo sợi đôi RNA tổng hợp xác mạch đơi Kết hình 4.10, cho thấy xử lý DNAse – enzyme phân hủy DNA (giếng 4) hay RNAse A – enzyme phân hủy RNA mạch đơn (giếng 6) không làm ảnh hưởng đến dsRNA tổng hợp Riêng giếng xử lý RNAse III – enzyme phân hủy RNA mạch đơi kết dsRNA bị phân hủy hồn tồn Do đó, giếng khơng xuất vạch sản phẩm Tất điều cho phép kết luận sản phẩm dsRNA tổng hợp hoàn toàn mạch đôi đủ điều kiện làm vật liệu cho thí nghiệm tiêm dsRNA vào tơm xanh đực PL25 48 Đồ án tốt nghiệp 4.2.3 So sánh hai phương pháp bước Kết so sánh nồng độ Mr–IAG dsRNA theo phương pháp bước bước sau chạy điện di 500 bp Hình 4.11 So sánh hiệu suất tổng hợp Mr–IAG dsRNA theo phương pháp bước bước Giếng 1: Mr–IAG dsRNA từ phương pháp bước pha loãng 1:50 Giếng 2: Mr– IAG dsRNA từ phương pháp bước pha loãng 1:50 Giếng 3: thang DNA 50 bp Mỗi giếng cho vào 2µl mẫu, gel agarose 1,5%, 100V, 45 phút, TBE 0,5X Dựa vào kết hình 4.11, vạch giếng sáng rõ vạch giếng chứng tỏ nồng độ Mr–IAG dsRNA tổng hợp từ phương pháp bước nhiều so với phương pháp bước Điều bước lai phương pháp bước không hiệu Phương pháp bước có hiệu kinh tế cao tiết kiệm phản ứng lần tổng hợp Mr–IAG dsRNA T7 RiboMax Express iRNA System Kit có giá thành thấp nhiều so với T7 Megascript Kit, đồng thời hiệu suất tổng hợp Mr–IAG dsRNA cao so với phương pháp bước 49 Đồ án tốt nghiệp Bảng 4.1 So sánh hiệu suất tổng hợp Mr–IAG dsRNA Kit Chỉ tiêu T7 RiboMax Express T7 Megascript Kit IRNA System Kit Số phản ứng 50 40 Nồng độ dsRNA tổng hợp >5 mg/ml 1,5–3 mg/ml 2,5–3 mg/ml 0,5–1 mg/ml theo Kit Nồng độ dsRNA tổng hợp từ thực tế Vì vậy, phương pháp bước lựa chọn tốt cho việc tổng hợp Mr–IAG dsRNA 4.3 Thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA vào tơm PL25 Sau 60 ngày thí nghiệm ta có kết số tơm sống số tơm chuyển sau Bảng 4.2 Kết thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA Thí nghiệm Lơ Đối chứng 30 ngày 60 ngày 30 ngày 60 ngày 5 Nước muối Nước muối sinh lý 0,9 0/0 sinh lý 0,9 0/0 35 31 18 18 34 29 0 Nồng độ Mr– IAG dsRNA (µg/g) Số sống (con) Số chuyển (con) 50 Đồ án tốt nghiệp Hình 4.12 Tỷ lệ sống tôm sau 60 ngày tiêm Sau 30 ngày thí nghiệm, tỷ lệ sống tơm thí nghiệm đạt 87,5% tức có 35 tơm sống 40 tơm thí nghiệm Sau 60 ngày tỷ lệ sống 77,5% tức 31 tơm sống 40 tơm thí nghiệm Như vậy, sau 60 ngày thí nghiệm tiêm tổng số tơm chết con, chiếm 22,5% Riêng lô đối chứng tỷ lệ sống cao đạt 90% hình 4.12 Điều q trình tiêm làm ảnh hưởng đến sức sống tơm thí nghiệm Ngồi ra, ngun nhân chết tơm khơng kiểm sốt điều kiện môi trường như: vi khuẩn gây bệnh đục thân tôm, môi trường nước, kinh nghiệm nuôi cịn hạn chế, q trình lột xác, tơm ăn … Tất tơm lơ thí nghiệm đối chứng cắt chân bơi thứ bên phải xem kính hiển vi để kiểm tra gai sinh dục phụ đực 51 Đồ án tốt nghiệp A B C C D E F Hình 4.13 Tác động Mr–IAG dsRNA lên hình thành phát triển gai phụ sinh dục đực chân bơi thứ bên phải tôm xanh M Rosenbergii A: chân bơi thứ tôm đực đối chứng giai đoạn PL25; B: chân bơi thứ tôm đực thí nghiệm trước tiêm dsRNA; C: chân bơi thứ tôm đực đối chứng sau 60 ngày; D: chân bơi thứ tơm thí nghiệm chuyển cái; E: chân bơi thứ hai tơm thí nghiệm bắt đầu xuất nhú lồi gai phụ sinh dục đực; D: chân bơi thứ tôm thí nghiệm xuất rõ gai phụ sinh dục đực Vị trí mũi tên màu xanh gai phụ sinh dục đực Từ hình 4.13, cho ta thấy giai đoạn trước thí nghiệm chân bơi thứ tơm thí nghiệm tơm đối chứng có đặc điểm hình thái giống Nhưng sau thời gian thí nghiệm có khác biệt rõ rệt tơm đối chứng tơm thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA: thí nghiệm tiêm Mr–IAG dsRNA hầu hết cá thể khơng có gai phụ sinh dục đực, có vài cá thể có xuất gai phụ sinh dục 52 Đồ án tốt nghiệp đực xuất nhú lồi sinh dục đực Riêng tôm đối chứng tất tơm có gai phụ sinh dục đực Hình 4.14 Tỷ lệ chuyển tôm sau 60 ngày tiêm Sau 30 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chuyển 97,1%, tỷ lệ tôm đực chiếm 2,9% (1 con) Tỷ lệ chuyển sau 60 ngày tiêm 93,5% tỷ lệ tôm đực 6,5% (1 đực có gai phụ sinh dục đực phát triển rõ có dấu hiệu đực, gai phụ sinh dục đực xuất hiện) Ở lô đối chứng tất tôm tôm đực Điều chứng tỏ Mr–IAG dsRNA có tác động tích cực đến q trình ức chế hình thành gai phụ sinh dục đực Như vậy, sau 60 ngày thí nghiệm có tơm đực tơm có dấu hiệu đực Ngun nhân q trình chọn tơm ấu trùng PL25 để tiến hành thí nghiệm lẫn vào tơm q ngày tuổi nên Mr–IAG dsRNA khơng cịn tác dụng ức chế gene Mr–IAG chúng hay trình tiêm làm thất lượng Mr–IAG dsRNA chưa có kinh nghiệm kỹ thuật tiêm mà tiêm chưa vị trí nên Mr–IAG dsRNA chưa có tác động ức chế ức chế khơng hồn tồn mRNA mã hóa tạo hormon tuyến đực Từ số liệu thu thập kết luận gene Mr–IAG có ảnh hưởng đến việc mã hóa androgeneic gland (AG) specific insulin–like peptides (mRNA) để tạo hormon tuyến đực cho tôm đực 53 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Tổng hợp Mr–IAG dsRNA để tạo tôm xanh giả cơng nghệ iRNA mục đích nghiên cứu Từ kết thu tổng hợp Mr–IAG dsRNA T7 RiboMax Express iRNA System Kit theo phương pháp bước có hiệu mặt chất lượng hiệu kinh tế Kết nghiên cứu từ thí nghiệm tiêm dsRNA vào tơm PL25, cho thấy nồng độ µg Mr– IAG dsRNA/g có tác dụng rõ rệt việc tạo tôm giả Tuy nhiên, cần kéo dài mở rộng quy mô nghiên cứu để xác định xác nồng độ số lần tiêm để tạo tôm giả Trong nghiên cứu tỷ lệ chết cao 22,5% Do đó, cần tìm biện pháp khắc phục, khống chế yếu tố ngoại cảnh dẫn đến tỷ lệ chết cao tơm như: xây dựng hệ thống sục khí, lưu thơng nước, định kỳ vệ sinh dụng cụ ni kiểm sốt vi khuẩn gây bệnh Nâng cao kỹ thuật nuôi, nắm chu kỳ phát triển lột xác tôm để tránh tượng ăn Cũng cần nghiên cứu thêm tần suất tiêm để giảm bớt số lần tiêm tuần nhằm nâng cao sức sống cho tôm… Kiểm tra lại trình tự Mr–IAG dsRNA sau tổng hợp cách giải trình tự để xác định xác trình tự tổng hợp có phải Mr–IAG dsRNA hay không, nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm tổng hợp tăng hiệu bất hoạt mRNA Ngồi ra, kỹ thuật tiêm đóng vai trị quan trọng q trình chuyển đổi giới tính tơm Nghiên cứu mở cơng nghệ dùng sản xuất tôm xanh giả thay cho phương pháp vi phẫu Cần nghiên cứu thêm phương pháp tổng hợp Mr-IAG dsRNA khác tổng hợp bên tế bào vi khuẩn nhằm sản xuất Mr-IAG dsRNA với số lượng lớn, tiết kiệm chi phí mà hiệu cao 54 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu sách – tạp chí Tài liệu tiếng việt [1] Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Tuần, Hoàng thị Thủy Tiên, Lâm Quyền, Nguyễn Đức Minh, Nguyễn Nhứt Huỳnh Thị Hồng Châu (2004) Kết bước đầu sản xuất giống tơm xanh tồn đực, tuyển tập nghề cá Đồng Bằng Sông Cửu Long Nhà xuất nông nghiệp TP.HCM, trang 159 – 177 [2] Chung Quang Trí (2006) Thử nghiệm dùng hormon đực giáp xác thuộc mười chân Decapoda để đực hóa hậu ấu trùng tôm xanh Macrobrachium rosenbergii de Man Trường đại học Khoa học Tự Nhiên TP HCM [3] Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (IRNA) gây bất hoạt tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí cơng nghệ sinh học 5(3): 265–275 Tài liệu nước ngồi [4] Charniaux–Cotton H and Payen G (1985) Sex differentiati In The biology of Crustacea Edited by Bliss D E and Mantel L H vol 9, pp 147–215 New York: Academic Press [5] Cortney, L Ohs, Louis R D’Abramo, Lora Petrie–Hanson, Anita M Kelly (2006) Apparent control of sexual differentiation of Freshwater Pawn, Macrobrachium rosenbergii, Through Dietary Administration of Dopamine Hydrochloride, Journal of Applied Aquaculture, 18: 4, 19 – 32 [6] Cronin J et al (2005) Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping Curr Gene Ther 5, 387–398 [7] Davis M.E., et al (2010) Evidence of IRNA in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles Nature 2010 Apr 15; 464(7291):1067–70 Epub 2010 Mar 21 [8] Eaton B.A et al (2002) Dynactin is necessary for synapse stabilization Neuron 34, 729–741 55 Đồ án tốt nghiệp [9] Estrada P., Lugo M., Acosta J.l, Carpio Y., Borroto I., Morera Y., Gonzalez O., Rodriguez T., Ramos L., Huberman A (2007) Effect of RNA interference on gene functions of aquatic organisms Biotecnologia Aplicada, Vol 24, No [10] Fingerman M (1997), Role of neurotransmitters in regulating reproductive hormon release and gonadal maturation in decapods crustaceans, Invertebrate Reproduction and Development, 31, pp 47– 74 [11] Galvani A and Sperling L (2002) RNA interference by feeding in Paramecium Trends Genet, 18, 11–12 [12] Gao G.P et al (1996) Biology of adenovirus vectors with E1 and E4 deletions for liver directed gene therapy J Virol 70, 8934–8943 [13] Guan, Haoji (2006) Double–stranded RNA induced gene silencing of neuropeptide genes in sand shrimp, Metapenaeus ensis and development of crustacean primary cell culture Trường đại học Hồng Kông [14] Guo S and Kemphues K.J par–1, a gene required for establishing polarity in C elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed Cell 1995 May 19;81(4):611–20 [15] Heister T et al (2002) Herpes simplex virus type 1/adeno–associated virus hybrid vectors mediate site–specific integration at the adeno–associated virus preintegration site, AAVS1, on human chromosome 19 J Virol 76, 7163–7173 [16] Hui J.H.L., Tobe S.S and Chan S.M (2008) Characterization of the putative farnesoic acid O–methyltransferase (LvFAMeT) cDNA from white shrimp, Litopenaeus vannamei: evidence for its role in molting Peptides 29: 252– 260 [17] Hutvagner G and Zamore P.D (2002) iRNA: nature abhors a double–strand Curr Opin Genetics and Development 12: 225–232 56 Đồ án tốt nghiệp [18] Issa Z et al (2005) Development of methods for RNA interference in the sheep gastrointestinal parasite, Trichostrongylus colubriformis Int J Parasitol 35, 935–940 [19] Kafri T et al (1997) Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors Nat Genet 17, 314–317 [20] Katakura Y (1989) Endocrin and genetic control of sex differenciation in the malacostracan Crustacea Invert Reprod Development., 16, 177–182 [21] Kawasaki H and Taira K (2004) Induction of DNA methylation and gene silencing by short interfering RNAs in human cells Nature 2004 Aug 15 [22] Kim D.H, Behlke M.A, Rose S.D, Chang M.S, Choi S., Rossi J.J (2005) Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance IRNA potency and efficacy Nat Biotechnol 2005 Fed; 23(2):222–6 [23] King D S (1964) Fine structure of the androgeneic gland of the crab, Pachygrapsus crassipes General and Comparative Endocrinology, vol 4, no 5, pp 533–544 [24] Li et al Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells Proc Natl Acad Sci USA (2006) Nov 14;103(46):17337–42 Epub 2006 Nov [25] Lieber A et al (1999) Integrating adenovirus–adeno–associated virus hybrid vectors devoid of all viral genes J Virol 73, 9314–9324 [26] Lu L et al (2006) Suppression of porcine arterivirus replication by baculovirus delivered shRNA targeting nucleoprotein Biochem Biophys Res Commun 340, 1178–1183 [27] Martin O., Sorokine, Moniatte M., Bulet P., Hetru C., and Dorsselaer A (1999) The structure of a glycosylated protein hormon responsible for sex determination in the isopod, Armadillidium vulgare European journal of Biochemistry, vol 262, no 3, pp 727–736 [28] Nagamine C., Knight W., Maggeneti A and Paxman, G (1980) Masculinization of female Macrobrachium 57 rosenbergii (de Man) Đồ án tốt nghiệp (Decapoda, Palaemonidae) by androgeneic gland implantation, General and comparative endrocrinology, 31(4) , 442–457 [29] Naldini L et al (1996) Efficient transfer, integration, and sustained long–term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector Proc Natl Acad Sci U S A 93, 11382–11388 [30] Ohs C.L., D`abramo L.R., Hanson L.P and Kelly A.M (2006) Apparent control of sexual differentiation of freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, through dietary administration of dopamine hydrochloride Journal of Applied Aquaculture 18(3) :19–32 [31] Ohs C.L., D`abramo L.R and Kelly A.M (2006) Effect of dietary administration of 17α–methyltestosterone on the sex ratio of postlarval freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii, during the nursery stage of culture Journal of the World Aquaculture Society 37: 34–46 [32] Ongvarrasopone C., Roshorm Y and Panyim S (2007) A Simple and Cost Effective Method to Generate dsRNA for IRNA Studies in Invertebrates Science Asia 33: 35–39 [33] O’Neal W.K et al (2000) Toxicity associated with repeated administration of first generation adenovirus vectors does not occur with a helper–dependent vector Mol Med 6, 179–195 [34] Paddison P.J et al (2002) Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence– specific silencing in mammalian cells Genes Dev 16, 948–958 [35] Palombo F et al (1998) Site–specific integration in mammalian cellsmediated by a new hybrid baculovirus–adeno–associated virus vector J Virol 7, 5025–5034 [36] Peng Y et al (2007) shRNA driven by Pol II/T7 dual–promoter system effectively induce cell–specific RNA interference in mammalian cells Biochem Biophys Res Commun 360, 496–500 [37] Plasterk (2002) RNA silencing: the geneome’s immune system Science 17 May 2002: Vol 296 no 5571 pp 1263–1265 58 Đồ án tốt nghiệp [38] Raden Roro Sri Pudji Sinarni Dewi, Ikhsan Khasani, Sularto and Wahyu Pamungkas (2006) Production of female giant freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) through hormonal induction Indonesian Aquaculture Jounal, 1(1), pp 35 – 38 [39] Rubinson D.A et al (2003) A lentivirus–based systemto functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgeneic mice by RNA interference Nat Genet 33, 401–406 [40] Sachiko Suzuki (1999) Androgeneic gland hormon is a sex–reversing factor but cannot be a sex–determining factor in the female Crustacean Isopods Armadillidium vulgare General and comparartive endrocrinology, 115(3), 370–378 [41] Samaniego L.A et al (1998) Persistence and expression of the herpes simplex virus geneome in the absence of immediate–early proteins J Virol 72, 3307–3320 [42] Sanders B.(1983) Insulin–like peptides in the lobster Homarus americanus.I insulin immunoreactivity General and Comparative Endocrinology 50: 366–373 [43] Sagi A and Afalo E.D (2005) The androgeneic gland and monosex culture of freshwater prawn Macrobrachium Rosenbergii (De Man):a biotechnological perspective Aquaculture Research.36: 231–237 [44] Sagi Amir, Cohen Dan, Milner Yoram (1989) Effect of androgene gland ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of male Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii, General and comparative endocrinology, 77, 15 – 22 [45] Sagi A., Milstein A., Eran Y., Joseph D., Khaila I., Abdu U., Harpaz S and Karplis I (1997a) Culture of the Australian redclaw crayfish (Cherax quadricarinatus) in Israel, II Second growout season of overwintered populations Israelli Journal of Aquaculture–Bamidgeh 59:222–229 59 Đồ án tốt nghiệp [46] Sagi A., Khalaila I., Barki I., Hulata G and Karplus I (1996) Intersex red claw crayfish, Cherax quadricarinatu (Von martens): functional males with pre–viellogeneic ovaries Biol.Bull 190: 16–23 [47] Sagi Amir, Snir Eviatar and Khalaila Isam (1995) Sexual differentiation in decapods crustaceans: role of the androgeneic gland Invertenrate Reproduction an Development, 31(1–3), 55 – 61 [48] Sagi A and Ra`ana Z (1988) Morphotypic differentiation of males of freshwater prawn Macrobrachium rosengergii: changes in the midgut glands and the reproductive system Journal of crustacean biology 8: 43– 47 [49] Spence R Malecha, Patricia, Nevin A., Phyllis Ha, Loena E Barck, Yara Lamadrid–Rose, Scott Masuno and Dennis Hedgecock (1992) Sex–ratios and sex–determination in progeney from crosses of surgically sex–reversed freshwater prawns, Macrobrachium rosenbergii Aquaculture, 105(3–4), pp 201–218 [50] Starkey J.L et al (2009) Hepatitis B virus (HBV)–specific short hairpin RNA is capable of reducing the formation of HBV covalently closed circular (CCC) [51] Stilwell J.L and Samulski R.J (2004) Role of viral vectors and virion shells in cellular gene expression Mol Ther 9, 337–346 [52] Song E et al RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis Nat Med 2003 Mar; 9(3):347–51 [53] Soifer H.S and Kasahara N (2004) Retrotransposon–adenovirus hybrid vectors: efficient delivery and stable integration of transgenes via a two– stage mechanism Curr Gene Ther 4, 373–384 [54] Suzuki H et al (2008) Suppression of hepatitis C virus replication by baculovirus vector–mediated short–hairpin RNA expression FEBS Lett 582, 3085–3089 60 Đồ án tốt nghiệp [55] Tabara H Grishok, A., Mello, C (1998) IRNA in C.elegans: Soaking in the Geneome Sequence Science 16 October 1998: Vol 282 no 5388 pp 430– 431 [56] The Nobel Prize in Physiology ỏ Medicin (2006) RNA interference, pp 1–10 Aigner A (2007) Nonviral in vivo delivery of therapeutic small interfering RNAs Curr Opin Mol Ther 9, pp 345–352 [57] Timmons L and Fire A (1998) Specific interference by ingested dsRNA Nature 395, 854 [58] Tiu S.H and Chan S.M (2007) The use of recombinant protein and IRNAnterference approaches to study the reproductive functions of a gonad–stimulating hormon from the shrimp Metapenaeus ensis T FEBS J 274: 4385–4395 [59] Ventura T., Manor R., Aflalo E.D., Weil S., Raviv S., Glazer L and Sagi A (2009) Temporal silencing of an androgeneic gland–specific insulin–like gene affecting phenotypical geneder differences and spermatogenesis Department of Life General Endocrinology 150: 1278–1286 [560] Zamore P.D, Tuschl T., Sharp P.A and Bartel D.P (2000) IRNA: Double– stranded RNA directs the ATP–dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals Cell 101: 25–33 B Tài liệu từ internet Tài liệu tiếng việt [61] Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn, viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản Nghiên cứu giải pháp điều khiển giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii (2010) http://www.vienthuysan2.org.vn/?do=news&act=detail&id=236 [62] Nguyễn Minh Nam Các RNA không mã hóa protein: giới rộng lớn tiềm ẩn (5.2011) http://vbs.ac.vn/print.php?post=64 Tài liệu nước 61 Đồ án tốt nghiệp [63] Addgene Plasmid pGEM–T vector http://addgene.org/browse/sequence_vdb/2854/ http://addgene.org/vector–database/2854/ [64] Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C Potent and specific genetic interference by double–stranded RNA in Caenorhabditis elegans (1998) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9486653?dopt=Abstract [65] Heriberto Cerutti, Xinrong Ma, Joseph Msanne, Timothy Repas RNA– mediated silencing in Algae: Biological roles and tools for analysis of gene function (2012) http://ec.asm.org/content/10/9/1164.full [66] Krishnan P., Gireesh–Babu P., Rajendran K.V., Chaudhari, A RNA interference–based therapeutics for shrimp viral deseases (2009) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20066961 [67] Shihao Li, Fuhua Li, Zheng Sun, Jianhai Xiang Two spliced variants of insulin–like androgeneic gland hormon gene in the Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis (2012) http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016648012001499 [68] Snell T.W., Shearer T.L., Smith H.A Exposure to dsRNA Elicits RNA Interference in Brachionus manjavacas (Rotifera) (5.2010) http://www.ace.biology.gatech.edu/content/exposure–dsrna–elicits–rna– interference–brachionus–manjavacas–rotifera–0 [69] The IRNA web What is iRNA http://www.iRNAweb.com/IRNA/What_is_IRNA/index.html [70] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/212726128 [71] http://www.geology.com.cn/Geology–Journals/article–3925.html 62 ... ? ?Ứng dụng thử nghiệm công nghệ iRNA vào nghiên cứu chuyển đổi giới tính tơm xanh Macrobrachium rosenbergii” tiến hành 1.2 Mục đích đề tài Mục đích việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật bất hoạt RNA. .. sung dopamine Thử nghiệm tạo tiềm sử dụng dopamine để tạo tơm xanh tồn đực phục vụ cho sản xuất 2.3 Giới thiệu cộng nghệ iRNA ứng dụng tạo tôm xanh giả 2.3.1 Giới thiệu iRNA Công nghệ iRNA gây bất... khơng có tác dụng việc chuyển đổi giới tính tơm xanh (Ohs ctv, 2006) Như vậy, 17α–methyltestosterone có tác dụng chuyển đổi giới tính tơm xanh chưa xác định Ohs cộng cho hậu ấu trùng tôm xanh thường