Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nƣớc thải chế biến thủy sản

Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nƣớc thải chế biến thủy sản Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nƣớc thải chế biến thủy sản luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hồi Hương khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đồ án TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Huỳnh Mai Nhi i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời tri ân chân thành đến Cơ Nguyễn Hồi Hương tận tình hướng dẫn, bảo em suốt thời gian xây dựng đề cương hoàn thành đồ án Em xin cám ơn Thầy Huỳnh Văn Thành động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực Đồng thời, em gửi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian dài học tập Với kiến thức mà em tiếp thu không giúp em thực tốt đồ án tốt nghiệp mà cịn tảng kiến thức cho cơng việc sau Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình ln chăm sóc, tạo điều kiện cho em đến trường theo đuổi ước mơ chỗ dựa vững không tinh thần mà vật chất cho em suốt năm qua Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến bạn thực đề tài phịng thí nghiệm – người động viên, sát cánh giúp đỡ để em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cám ơn Thầy Cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi đến quý Thầy Cô lời chúc sức khỏe TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Huỳnh Mai Nhi ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài 2 Tình hình nghiên cứu enzyme protease .3 2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme protease nƣớc 2.2 Tình hình sản xuất enzyme protease giới .3 Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu .3 Phƣơng pháp nghiên cứu .4 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa đề tài Các kết đạt đƣợc đề tài Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ngành sản xuất thủy sản 1.2 Tổng quan nƣớc thải chế biến thủy sản 10 1.2.1 Các công đoạn phát sinh nước thải thủy sản 10 1.2.2 Đặc tính nước thải chế biến thủy sản 14 1.2.3 Ảnh hưởng nước thải thủy sản đến môi trường nước .15 1.2.4 Hệ thống xử lý nước thải cho nhà máy sản xuất thủy sản 17 1.3 Tổng quan vi sinh vật nƣớc thải công nghiệp 18 1.3.1 Nguồn gốc vi sinh vật nước thải công nghiệp .18 1.3.2 Thành phần vi sinh vật nước thải công nghiệp 19 1.3.3 Chuyển hóa vật chất vi sinh vật nước thải công nghiệp 19 1.4 Tổng quan trình phân giải chất giàu protein nhờ vi sinh vật21 iii Đồ án tốt nghiệp 1.4.1 Q trình amon hóa protein 22 1.4.2 Vi sinh vật tham gia trình phân hủy protein 23 1.4.2.1 Bacillus subtillis 24 1.4.2.2 Bacillus cereus 25 1.4.2.3 Bacillus mensentericus 25 1.4.3 Enzyme protease vi sinh vật 26 1.4.3.1 Protease ngoại bào vi sinh vật: 26 1.4.3.2 Protease nội bào vi sinh vật: .27 1.4.3.3 Phân loại theo trung tâm hoạt động enzyme 28 1.5 Tổng quan phƣơng pháp xử lý nƣớc thải .28 1.5.1 Các phương pháp xử lý nước thải 29 1.5.1.1 Phương pháp học 29 1.5.1.2 Phương pháp hóa lý 29 1.5.1.3 Phương pháp hóa học 30 1.5.2 Phương pháp sinh học xử lý nước thải 31 1.5.2.1 Nguyên tắc 31 1.5.2.2 Các trình sinh học chủ yếu xảy nước thải 31 1.5.2.3 Các hình thức xử lý nước thải phương pháp sinh học 33 1.5.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình xử lý nước thải phương pháp sinh học .35 1.6 Tổng quan chế phẩm sinh học 37 1.6.1 Định nghĩa chế phẩm sinh học 37 1.6.2 Mục đích việc sử dụng chế phẩm sinh học thủy sản .37 1.6.3 Các chế phẩm sinh học xử lý nước thải chứa nito thị trường 38 1.6.3.1 Men vi sinh JUMBO .38 1.6.3.2 Chế phẩm sinh học EMIC .39 1.6.3.3 Chế phẩm AQUAPOND 39 1.6.3.4 Chế phẩm sinh học EM 40 1.6.3.5 Chế phẩm vườn sinh thái cho thủy sản 40 iv Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài .42 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu .42 2.1.2 Thời gian nghiên cứu .42 2.2 Vật liệu nghiên cứu 42 2.2.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn .42 2.2.2 Hóa chất môi trường 42 2.2.2.1 Hóa chất 42 2.2.2.2 Môi trường 42 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 53 2.2.3.1 Thiết bị 53 2.2.3.2 Dụng cụ 53 2.3 Bố trí thí nghiệm 54 2.4 Bố trí thí nghiệm chi tiết 54 2.4.1 Phân lập định danh sơ chủng vi khuẩn amon hóa 54 2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn amon hóa 54 2.4.1.2 Định danh sơ chủng vi khuẩn phân lập 57 2.4.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh enzyme protease chủng phân lập 58 2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường thu enzyme đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn 60 2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt động enzyme môi trường lỗ thạch casein 61 2.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối môi trường thu enzyme đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn 63 2.4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng chế độ cung cấp oxi đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn 64 2.4.2.5 Khảo sát động học tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn 66 v Đồ án tốt nghiệp 2.4.3 Thí nghiệm ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải CBTS 67 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu .68 2.5.1 Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu 68 2.5.2 Phương pháp tăng sinh 69 2.5.3 Phương pháp pha loãng mẫu 69 2.5.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả phân giải protein 69 2.5.4.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật khiết 69 2.5.4.2 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật .71 2.5.5 Phương pháp tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập 71 2.5.6 Các phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 72 2.5.6.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc 72 2.5.6.2 Soi khuẩn lạc 72 2.5.6.3 Phương pháp nhuộm gram 72 2.5.6.4 Phương pháp nhuộm bào tử 72 2.5.7 Các thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 73 2.5.7.1 Thử nghiệm catalase .73 2.5.7.2 Thử nghiệm khả di động 73 2.5.7.3 Thử nghiệm Indol 73 2.5.7.4 Thử nghiệm VP .73 2.5.7.5 Thử nghiệm urease 73 2.5.7.6 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) 73 2.5.7.7 Thử nghiệm MR (Methyl Red) .74 2.5.7.8 Thử nghiệm khả lên men nguồn carbohydrate 74 2.5.7.9 Thử nghiệm khả lên men (F) oxy hóa (O) glucose 75 2.5.7.10 Thử nghiệm TSI 75 2.5.7.11 Thử nghiệm citrate 75 2.5.7.12 Thử nghiệm khả chịu mặn 75 2.5.7.13 Thử nghiệm Tyrosine 75 2.5.7.14 API KIT 20E 76 vi Đồ án tốt nghiệp 2.5.8 Xác định mật độ tế bào phương pháp đo mật độ quan (OD600nm) 76 2.5.9 Phương pháp đục lỗ thạch .76 2.5.10 Phương pháp nghiên cứu khả phân hủy tinh bột, protein, lipase, cellulose 77 2.5.11 Các phương pháp định lượng số nước thải 79 2.5.11.1 Phương pháp xác định Clorua 79 2.5.11.2 Phương pháp xác định nhu cầu oxi hóa học (COD) .79 2.5.11.3 Phương pháp định lượng N-NH4+ 79 2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê 79 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .80 3.1 Kết phân lập lựa chọn chủng có khả phân hủy protein 80 3.2 Kết định danh sơ 80 3.2.1 Kết thử nghiệm sinh hóa 80 3.2.2 Quan sát hình thái, sinh lý .82 3.3 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 88 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 90 3.4.1 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn phân lập .90 3.4.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt động enzyme môi trường lỗ thạch casein .92 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối đến khả tăng trưởng sinh enzyme protease chủng phân lập 98 3.4.3.1 Khả tăng sinh khối chủng nồng độ muối khác 99 3.4.3.2 Kết ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh enzyme chủng phân lập 102 vii Đồ án tốt nghiệp 3.4.4 Kết khảo sát ảnh hưởng oxi đến khả sinh enzyme protease chủng phân lập 106 3.4.5 Khảo sát động học tổng hợp protease môi trường nhân tạo 108 3.4.6 Ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải 110 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .54 Kết luận 54 Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 120 A Tài liệu Tiếng Việt 120 B Tài liệu Tiếng Anh 121 C Tài liệu Internet 123 PHỤ LỤC viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CBTS: Chế biến thủy sản CFU: Colony forming unit ĐKVPG: Đường kính vịng phân giải DO: Oxy hịa tan (Dissolved Oxygen) ĐKVPG: Đường kính vịng phân giải FAO: Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc MT: Môi trường MT1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân hủy protein, chứa 1% gelatine MT2: Môi trường thu enzyme N2 : Khi Nitơ NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth NH4+ : Amonium NO2- : Nitrite NO3-: Nitrate OD: Optical Density TN: Thí nghiệm TSB: Tripticase Soya Broth TSI: Triple Sugar Iron Agar TSS: Total suspended solids (tổng vật chất lơ lửng) VK: Vi khuẩn VP – MR: Voges – Proskauer – Methyl Red VSV: Vi sinh vật ix Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 theo giá so sánh 2010 Bảng 1.2 Khối lượng sản phẩm thủy sản xuất từ năm 2002 – 2005 Bảng 1.3 Năng lực sản xuất sở chế biến thủy sản đông lạnh 10 Bảng 1.4 Lượng phế thải trung bình cho sản phẩm thủy sản 12 Bảng 1.5 Các dạng nước thải công nghiệp chế biến thủy sản 13 Bảng 1.6 Giá trị thông số ô nhiễm làm sở tính tốn giá trị tối đa cho phép 13 Bảng 1.7 Một số vi sinh vật tham gia trình amon hóa protein 24 Bảng 2.1 Kết thử nghiệm khử nitrate thành nitrite 74 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập .80 Bảng 3.2 Kết định danh sơ chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải thủy sản 80 Bảng 3.3 Kết khảo sát enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn phân lập .88 Bảng 3.4 pH môi trường nuôi cấy tối ưu để tổng hợp enzyme protease chủng phân lập 92 Bảng 3.5 pH hoạt động tối ưu enzyme protease chủng phân lập .97 Bảng 3.6 pH môi trường nuôi cấy tối ưu pH hoạt động tối ưu enzyme protease tổng hợp từ chủng vi khuẩn .98 Bảng 3.7 Nồng độ muối tối ưu cho khả tăng trưởng chủng phân lập 102 Bảng 3.8 Nồng độ muối tối ưu cho khả sinh enzyme protease chủng phân lập 106 Bảng 3.9 Ảnh hưởng điều kiện oxi đến khả sinh enzyme chủng 108 Bảng 3.10 Thời gian nuôi cấy tối ưu chủng phân lập 110 x ... tài ? ?Phân lập số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả phân hủy protein nƣớc thải chế biến thủy sản? ?? thực nhằm tìm chủng vi khuẩn có khả phân giải protein điều kiện có nồng độ NaCl mức 3% để sản xuất... trình phân lập vi khuẩn có khả phân giải protein từ nước thải chế biến thủy sản 55 Hình 2.3 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả phân hủy protein .56 Hình 2.4 Quy trình định danh sơ chủng. .. quan ngành sản xuất thủy sản 1.2 Tổng quan nƣớc thải chế biến thủy sản 10 1.2.1 Các công đoạn phát sinh nước thải thủy sản 10 1.2.2 Đặc tính nước thải chế biến thủy sản 14