Bài thuyết trình: Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp trình bày giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR, nguyên lí hoạt động của PCR, một số ứng dụng của PCR trong nông nghiệp hiện nay. Để nắm vững nội dung chi tiết mời các bạn cùng tham khảo tài liệu. Hi vọng tài liệu sẽ giúp ích cho các bạn trong quá trình học tập cũng như nghiên cứu của mình.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PHÂN TỬ TRONG XÉT NGHIỆM NÔNG NGHIỆP Chủ nhiệm môn: LÊ NGỌC TRIỆU Danh sách thành viên Đặt vấn đề Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử nhiều ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử tiếp cận với phương pháp đem lại kết có ý nghĩa to lớn, có nghiên cứu lĩnh vực y tế, khoa học đời sống PCR phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhậy tính đặc hiệu cao; đó, PCR thích hợp cho xét nghiệm chẩn đoán lĩnh vực y học, pháp y, bệnh lí trồng NHƯ VẬY: - TẠI SAO LẠI LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BẰNG KĨ THUẬT PCR ? - CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN ĐOÁN ? - TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CĨ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ? - Ý NGHĨA CỦA VIỆC CHUẨN ĐOÁN BẰNG XÉT NGHIỆM NÀY TRONG NÔNG NGHIỆP ? I Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR II Nguyên lí hoạt động PCR III Một số ứng dụng PCR nông nghiệp I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR Dựa vào chế tổng hợp gen đặc hiệu tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis phát minh kĩ thuật tổng hợp gen ống nghiệm (PCR) vào năm 1985 PCR phương pháp in vitro để tổng hợp đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu mồi oligonucleotide gắn vào sợi đơi đoạn DNA đích với tham gia DNA polymerase Phản ứng PCR thực qua giai đoạn chu kì: - Giai đoạn biến tính (denaturation) - Giai đoạn bắt cặp (annealing) - Giai đoạn kéo dài (elongaction) Chu kì lặp lặp lại từ 20 40 lần cho sản phẩm cuối PCR đoạn DNA RNA phiên Số lượng tính theo hàm số mũ Máy PCR II.Nguyên lí hoạt động PCR Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR ( PCR mix): - DNA khuôn - Taq DNA polymerase - d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) - Primer ( oligonucleotide) - PCR buffer Ba giai đoạn phản ứng PCR thực máy luân nhiệt (Thermalcycles) - Giai đoạn biến tính (denaturation): 92 – 98 độ C Giai đoạn bắt cặp (annealing) 45 thoi gian 20s-2phut Giai đoạn kéo dài (elongaction) nhiệt độ 68-72 Giới thiêu bước kỹ thuật PCR việc lấy mẫu đem phân tích Các bệnh phẩm y học ↓ Ly trích pre - nucleic acide ↓ Ly trích acide nucleic tinh khiết ↓ PCR ( RT - PCR) ↓ Phân tích phát sản phẩm PCR quang phổ hay điện di Thực xét nghiệm chẩn đoán PCR Sáu khâu quy trình xét nghiệm kỹ thuật PCR Lấy mẫu: ADN tách chiết từ mẫu khác nhau, máu tươi, máu khô, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, da, phân, v.v Mẫu lấy chỗ gửi từ xa hàng nghìn kilơmet, nhiều ngày, phong bì bình thường, qua bưu điện, khơng cần bảo quản lạnh Có thể DNA kép, đơn, RNA tách chiết từ đối tượng nghiên cứu DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm (từ 1mg xuống cịn 100µg) người ta sử dụng polymerase cho hiệu cao Kí hiệu-Lấy mẫu đem phân tích Phản ứng ELISA Đặt vấn đề: Ngồi việc xét nghiệm bệnh lí sinh vật gây ra, nơng nghiệp việc sử dụng loại hóa chất, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) yếu tố quan trọng Dư lượng thuốc BVTV nông sản vấn đề xã hội ELISA- phương pháp xét nghiệm ứng dụng từ lâu xét nghiệm bệnh lí, gần phát triển theo hướng kiểm tra, đánh giá mức độ ô nhiểm dư lượng hợp chất BVTV nông sản môi trường sinh thái nông nghiệp Định nghĩa: ELISA ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa kết hợp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Trong tính chất họat hóa enzyme độ đặc hiệu kháng thể không đổi Nguyên tắc: Sử dụng KT đơn dòng(Mabs) phủ bề mặt đĩa giếng Nếu có diện KN mẫu,KN tạo phức hợp với KT cố định giếng KT tự có gắn enzyme tạo thành phức hợp kép(sandwich).Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA Có hai phương pháp xét nghiệm ELISA: Phương pháp ELISA gián tiếp(indirect ELISA): dùng để phát kháng thể chuyên biệt huyết Phương pháp ELISA trực tiếp( direct ELISA): dùng để phát kháng nguyên mẫu xét nghiệm Các loại enzyme thường dùng: Alkaline phosphatase Peroxydase Glucoxydase β-galactosidase bộ KIT Elisa Thí nghiệm kiểm tra sốt dengue bằng bộ KIT Elisa Ưu điểm: Ưu điểm quan trọng phương pháp ELISA độ nhạy cao, phát phức hợp nhỏ KN_KT, cho phép phát sớm tác nhân gây bệnh giai đoạn sớm mầm bệnh xâm nhiễm Nhanh,thao tác đơn giản Rẻ tiền, tốn sinh phẩm,hóa chất,số lượng mẫu lớn, thích hợp với việc phân tích ngun liệu thơ Nhược điểm: độ xác khơng cao Phương pháp ELISA cạnh tranh dùng cho phân tích thuốc trừ sâu (1) Cạnh tranh trực tiếp: Cố định kháng thể (2) Cạnh tranh gián tiếp: Cố định cộng hợp kháng nguyên Trong kiểu (1), kháng thuốc trừ sâu phủ lên giếng nhựa nhỏ Một hapten(kháng ngun khơng hồn tồn) mơ thuốc trừ sâu gắn với Enzyme đánh dấu tạo nên cộng hợp enzyme có khả liên kết với kháng thể Khi cho dịch chiết mẫu cộng hợp enzyme vào giếng, thuốc trừ sâu dịch chiết cộng hợp enzyme cạnh tranh để liên kết với kháng thể Sau rữa trôi chất dư thừa sau pư chất tương ứng với enzyme cho vào xúc tác enzyme pư tạo màu hay phát huỳnh quang xuất giếng Thuốc trừ sâu nhiều cộng hợp enzyme cạnh tranh nên kháng thể giử lại màu nhạt ngược lại Trong kiểu (2) cộng hợp KN- Protein cố định bề mặt rắn Thuốc trừ sâu lượng kháng thể cố định cho vào, thuốc trừ sâu KN tự cạnh tranh với KN cố định bám vào KT Lượng KN tự nhiều KT bị KN giữ cố định Sau rữa trơi chất thừa sau pư người ta dùng KT thứ có đánh dấu enzyme để phát KT ban đầu bị giữ lại Từ ta định lượng thuốc trừ sâu mẫu ... thành viên Đặt vấn đề Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử nhiều ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử tiếp cận với phương pháp đem lại kết có ý nghĩa... PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN ĐOÁN ? - TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CÓ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ? - Ý NGHĨA CỦA VIỆC CHUẨN ĐỐN BẰNG XÉT NGHIỆM NÀY TRONG NƠNG NGHIỆP ? I Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật. .. Một số ứng dụng PCR nông nghiệp I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR Dựa vào chế tổng hợp gen đặc hiệu tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis phát minh kĩ thuật tổng hợp gen ống nghiệm