Giáo trình Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Giáo trinh Điều hòa sinh trưởng thực vật là môn học giới thiệu về lịch sử nghiên cứu, phương pháp ly trích, cấu tạo hóa học, sinh tổng hợp, vai trò sinh học và cơ chế tác dụng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Môn học này cũng giới thiệu về khả năng ứng dụng của các chất điều hòa sinh trưởng trong sản xuất nông nghiệp

TR NG I H C C N TH KHOA NÔNG NGHI P

Ζeatin

NH

H2

C C H

O Brassinolide

M C L C

L i m đ u ……… i

M c l c ……… ii

Ch ng 1 L c s nghiên c u và các khái ni m v ch t đi u hòa sinh tr ng th c v t ……… 1

1.1 L c s nghiên c u ……… 1

1.1.1 Auxin ……… 1

1.1.2 Gibberellin (GA) ……… 4

1.1.3 Cytokinin ……… 5

1.1.4 Abscisic acid (ABA) ……… 6

1.1.5 Ethylene ……… 6

1.1.6 Brassinosteroid (BR) ……… 7

1.1.7 Salicylate (JA) ……… 7

1.1.8 Jasmonate (SA) ……… 8

1.2 Các khái ni m c b n và thu t ng ……… 8

1.2.1 Yêu c u đ i v i m t ch t đi u hòa sinh tr ng ……… 8

1.2.2 Các khái ni m và thu t ng ……… 9

1.2.2.1 Hormone th c v t (Plant hormone, phytohormone) ……… 9

1.2.2.2 Ch t sinh tr ng th c v t (Plant growth subtance) ……… 9

1.2.2.3 Ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t (Plant growth regulator, PGR) 10

1.2.2.4 Ch t c ch và ch t làm ch m sinh tr ng (Inhibitor và retardant) 10

Ch ng 2 Ph ng pháp trích, thanh l c và xác đ nh ch t sinh tr ng th c v t ……… 11

2.1 Ph ng pháp ly trích ……… 11

2.1.1 Ph ng pháp khuy ch tán ……… 11

2.1.2 Ly trích b ng dung môi ……… 12

2.1.2.1 Chu n b m u ……… 12

2.1.2.2 Ly trích ……… 12

2.2 Tinh l c d ch trích ……… 13

2.3 nh l ng ch t sinh tr ng th c v t ……… 14

2.3.1 Sinh tr c nghi m (Bioassay) ……… 14

2.3.1.1 Sinh tr c nghi m auxin ……… 15

2.3.1.2 Sinh tr c nghi m gibberellin ……… 15

2.3.1.3 Sinh tr c nghi m cytokinin ……… 16

2.3.1.4 Sinh tr c nghi m abscisic acid ……… 16

2.3.1.5 Sinh tr c nghi m ethylene ……… 17

2.3.1.6 Sinh tr c nghi m brassinosteroid ……… 18

2.3.2 Hóa lý tr c nghi m ……… 18

2.3.2.1 Phát hi n ch t sinh tr ng th c v t b ng s c ký kh i ph ……… 18

2.3.2.2 nh l ng ethylene ……… 18

2.3.2.3 Phát hi n ch t đi u hòa sinh tr ng th c v t b ng HPLC ………… 18

2.3.2.4 Sinh tr c nghi m mi n d ch h c ……… 19

đ nh cu i cùng 19

2.4 K t lu n ……… 19

Ch ng 3.C u trúc hóa h c, sinh t ng h p và nh h ng sinh lý c a các nhóm ch t đi u hòa sinh tr ng th c v t ……… 21

3.1 Auxin ……… 21

3.1.1 Sinh t ng h p auxin ……… 21

3.1.2 Các auxin ph bi n ……… 23

3.1.3 Nh ng nh h ng sinh lý ……… 25

3.1.4 S phân h y auxin ……… 27

3.2 Gibberellin (GA) ……… 28

3.2.1 Sinh t ng h p gibberellin ……… 29

3.2.2 Nh ng nh h ng sinh lý c a gibberellin ……… 34

3.3 Cytokinin ……… 35

3.3.1 Sinh t ng h p cytokinin ……… 36

3.3.2 Nh ng nh h ng sinh lý c a cytokinin ……… 36

3.4 Abscisic acid ……… 38

3.4.1 Sinh t ng h p abscisic acid ……… 38

3.4.2 S b t ho t c a abscisic acid ……… 39

3.4.3 Nh ng nh h ng sinh lý c a abscisic acid ……… 39

3.5 Ethylene ……… 40

3.5.1 Sinh t ng h p ethylene ……… 41

3.5.2 S kích thích t ng h p ethylene c a Auxin ……… 42

3.5.3 S s n sinh ethylene do stress ……… 43

3.5.4 Nh ng nh h ng sinh lý c a ethylene ……… 43

3.6 Brassinosteroid (BR) ……… 46

3.6.1 Phân lo i và c u trúc hóa h c ……… 46

3.6.2 Sinh t ng h p brassinosteroid ……… 47

3.6.3 Nh ng nh h ng sinh lý c a brassinosteroid ……… 51

3.6.3.1 nh h ng c a BR lên s sinh tr ng nghiêng ……… 51

3.6.3.2 nh h ng c a BR lên s v n dài ……… 52

3.6.3.3 BR c n thi t cho s phát tri n bình th ng c a th c v t ………… 52

3.6.3.4 S ch ng ch u v i đi u ki n kh c nghi t c a môi tr ng, tính kháng sâu b nh và tính ch ng ch u v i thu c c ……… 53

3.6.3.5 Kích thích s sinh t ng h p ethylene ……… 54

3.6.3.6 Kh n ng ng d ng c a brassinosteroid ……… 55

3.7 Salicylate (SA) ……… 56

3.7.1 Sinh t ng h p salicylic acid ……… 56

3.7.2 nh h ng sinh lý ……… 57

3.8 Jasmonate (JA) ……… 58

3.8.1 Sinh t ng h p, chuy n hoá và v n chuy n jasmonate ……… 58

3.8.2 Nh ng nh h ng sinh lý c a jasmonate ……… 59

3.9 Các ch t đi u hòa sinh tr ng khác ……… 60

Ch ng 4 Vai trò c a ch t đi u hòa sinh tr ng trong sinh tr ng và phát tri n c a th c v t ……… 61

4.1 i u khi n s n y m m c a h t và s phát tri n c a cây con ………… 61

4.1.1 nh h ng c a gibberellin và abscisic acid ……… 62

4.1.2 nh h ng c a cytokinin 62

4.1.3 nh h ng c a ethylene ……… 62

4.1.4 nh h ng c a nh ng ch t khác ……… 63

4.2 S thành l p r b t đ nh t cành giâm ……… 65

4.3 Miên tr ng ……… 66

4.4 nh h ng c a ch t đi u hòa sinh tr ng lên quá trình lão hoá ……… 66

Ch ng 5 Vai trò c a ch t đi u hòa sinh tr ng lên các quá trình sinh s n c a th c v t ……… 68

5.1 Tr hoa ……… 68

5.1.1 nh h ng c a nh ng y u t môi tr ng lên s phát tri n sinh s n … 68 5.1.1.1 Quang k (photoperiodism) ……… 68

5.1.1.2 S th hàn (Vernalization) ……… 69

5.1.2 S t ng m m hoa ……… 69

5.2 nh h ng c a ch t đi u hòa sinh tr ng lên s t ng m m hoa, kích thích và c ch tr hoa ……… 70

5.3 nh h ng c a ch t đi u hòa sinh tr ng lên s phát tri n c a chùm hoa ho c thân trong nh ng cây có hoa và s th hi n gi i tính ………… 70

5.3.1 Gibberellin và s phát tri n chùm hoa ho c thân ……… 70

5.3.2 Ch t đi u hòa sinh tr ng và s th hi n gi i tính ……… 71

5.4 S r ng ……… 71

5.4.1 Gi i ph u h c c a s r ng ……… 72

5.4.2 Sinh lý c a s r ng ……… 72

5.4.2.1 nh h ng c a nhi t đ , oxygen và nh ng y u t dinh d ng …… 72

5.4.2.2 nh h ng c a ch t đi u hòa sinh tr ng lên s r ng ……… 73

5.5 Sinh lý c a s đ u trái, sinh tr ng, phát tri n, chín và r ng trái …… 74

5.5.1 Sinh lý c a s đ u trái ……… 74

5.5.2 nh h ng c a ch t đi u hòa sinh tr ng lên sinh tr ng và phát tri n c a h t và trái ……… 74

5.5.3 T a th a hoa và trái b ng hóa ch t ……… 75

5.5.4 S chín c a trái ……… 75

5.5.5 Ng n s r ng trái ……… 76

5.5.6 Gây ra s r ng trái ……… 76

Ch ng 6 Vai trò c a ch t đi u hòa sinh tr ng lên quá trình quang h p c a th c v t ……… 77

6.1 Ch t c n sinh tr ng ……… 77

6.1.1 Nh ng ch t c ch sinh t ng h p gibberellin ……… 77

6.1.1.1 Nh ng h p ch t onium ……… 77

6.1.1.2 Pyrimidine ……… 77

6.1.1.3 Triazole ……… 78

6.1.1.4 Nh ng ch t khác ……… 79

6.1.2 Nh ng ch t c n sinh tr ng không c ch sinh t ng h p gibberellin 80

6.1.2.1 Morphactin ……… 80

6.1.2.2 Dikegulac ……… 81

6.1.2.3 H p ch t phóng thích ethylene ……… 81

6.1.2.4 Maleic hydrazide ……… 81

6.1.2.5 D n xu t c a acetamide ……… 82

6.1.2.6 D n xu t c a acid béo……… 82

6.2 ng d ng c a ch t c n sinh tr ng ……… 82

6.3 M i liên quan gi a ch t sinh tr ng cây tr ng trong quá trình quang … h p và s phân chia c a ch t đ ng hóa ……… 83

6.4 Các v n đ v phòng tr c d i ……… 84

6.4.1 Ph ng pháp phòng tr c ……… 84

6.4.1.1 Ng n ng a, phòng tr và nh c ……… 84

6.4.1.2 Qu n lý c d i ……… 84

6.4.2 Gi i thi u v phòng tr c b ng hóa ch t ……… 84

6.4.2.1 Thu c c có tác d ng gi ng nh IAA ……… 85

6.4.2.2 Nh ng ch t c ch t ng h p gibberellin ……… 85

6.4.3 S c ch quá trình sinh t ng h p, quang h p và hô h p ……… 85

6.4.3.1 Nh ng ch t c ch hô h p (MAA, dinoseb, bromoxynil) ………… 85

6.4.3.2 Ch t c ch quang h p ……… 85

6.4.3.3 Nh ng ch t c ch quá trình sinh t ng h p ……… 86

6.4.4 Công ngh di truy n và tính kháng thu c c th c v t b c cao …… 86

Tài li u tham kh o ……… 88

L i M u

xu t nông nghi p Nó c ng là môn h c cung c p nh ng ki n th c c n thi t cho

nh ng ngành sinh lý th c v t, khoa h c cây tr ng và sinh h c phân t

cho sinh viên h c xong n m th hai các ngành nông h c, tr ng tr t và sinh h c

trình này

hoàn thi n h n Xin chân thành cám n phó giáo s ti n s Lê V n Hoà, ti n s

trình này

C n th , ngày 25 tháng 12 n m 2004

Nguy n Minh Ch n

nh ng nghiên c u c b n v sinh hoá, sinh lý và sinh h c phân t c ng đ t đ c nhi u thành t u M i liên h c a ch t đi u hoà sinh tr ng v i s n y m m, s phát tri n c a cây con, s t o r , miên tr ng, s phát d c, s chín, s lão hoá, s tr hoa, s r ng, s

đ u trái, s phát tri n c a trái, s r ng trái non, s chín, s kích thích r ng trái, s t o

c , quang h p và phòng tr c d i đã đ c bi t Các ng d ng ch t đi u hoà sinh

tr ng trong nông nghi p và vi c th ng m i hóa chúng c ng đã tr thành hi n th c

1.1 L c s nghiên c u

1.1.1 Auxin

Vi c phát hi n ra auxin đã đ c Darwin (1880) kh o sát trên hi n t ng quang

h ng đ ng Ông th y ng n di p tiêu h ng v phía có ánh sáng và cho r ng ánh sáng

đã kích thích ng n di p tiêu h ng v phía đó B ng nhi u thí nghi m đ n gi n dùng

m t n p che chóp di p tiêu hay c t nó đi thì di p tiêu không còn h ng v ánh sáng

n a

Salkowski (1885) đã phát hi n indole-3-acetic acid trong môi tr ng lên men Mãi đ n nhi u n m v sau ch t này c ng đã đ c tìm th y trong mô th c v t Ngày nay, ch t này đ c bi t nh là ch t đi u hòa sinh tr ng quan tr ng thu c nhóm auxin,

nó c ng có liên quan đ n nhi u quá trình sinh lý trong cây Rothert (1884) đã kh ng

đ nh l i và ti p t c các thí nghi m c a Darwin cho th y r ng tín hi u quang h ng

đ ng gây ra s nghiêng đ c ki m soát trong t bào nhu mô c a di p tiêu

Fitting (1907) đã c l ng nh h ng c a v t c t m t phía lên di p tiêu c a

y n m ch (Avena) trong môi tr ng bão hoà đ m đ nh ng v t c t b m t không b khô K t qu cho th y không có nh h ng c a nh ng v t c t bên lên t c đ phát tri n

và s đáp ng c a tác đ ng ánh sáng b t ch p đ n nh ng v trí c t so v i h ng c a ánh sáng Fitting cho r ng ch t kích thích đ c v n chuy n qua ch t s ng và di chuy n quanh v t c t Ông c ng suy đoán r ng s đáp ng tác đ ng ánh sáng d ng tính đã

x y ra b i vì ánh sáng đã s p x p chi u phân c c trong nh ng t bào c a chóp di p tiêu

và ch t kích thích đ c di chuy n t nh ng t bào c a chóp di p tiêu đ c chi u sáng

m t phía đ n nh ng t bào ph n trong t i phía d i Th t không may m n, nh ng quan sát c a ông đã không chính xác b i vì m t vách ng n s v n chuy n đã không bao gi đ c hình thành

Hình 1.1 L c s nghiên c u v auxin trên di p tiêu b c t chóp

S nghiêng

c a di p

tiêu

Không nghiêng c a

S nghiêng

c a di p tiêu

v i v t c t v phía t i

Không có s nghiêng c a

di p tiêu khi

mi ng mica

đ c đ t v phía t i

Fitting (1907)

Boysen-Jensen (1913)

Trong t i Trong t i Không có s sinh

tr ng c a di p tiêu khi chóp

đ c tách r i

S sinh

tr ng th ng

c a di p tiêu khi chóp b

c t r i đ c

đ t tr l i

S nghiêng

c a di p tiêu khi mi ng

Boysen-Jensen (1913) cho r ng ch t kích thích gây ra b i ánh sáng có th đ c

di chuy n xuyên qua v t th không có s s ng Ông đã ch ng minh đi u này b ng cách

c t chóp di p tiêu Avena và chêm m t mi ng gelatin gi a chóp và ph n g c Khi ph n

chóp đ c chi u sáng, ph n d i l p gelatin đã cong đi Không nh thí nghi m c a Fitting, ông c ng c t nh ng v t nh ng m t khác nhau c a di p tiêu và chêm m t

mi ng mica vào đ t o vách ng n Khi vách ng n đ c đ t phía không đ c chi u sáng

c a di p tiêu thì không có hi n t ng cong Tuy nhiên khi nó đ c đ t v phía sáng

c a di p tiêu s cong x y ra k t qu cho th y r ng tín hi u đã đ c truy n xu ng qua phía trong t i c a di p tiêu và đã kích thích s sinh tr ng cong

Paal (1918) đã kh ng đ nh l i nh ng phát hi n c a Boysen-Jensen và cho r ng

có m t ch t có kh n ng hòa tan đã s n sinh ra trong di p tiêu và đi u khi n s phát

tri n c a di p tiêu Avena N u c t chóp di p tiêu và đ chóp y nghiêng m t bên c a b

m t c t trong t i thì di p tiêu s cong v phía không có chóp

Soding (1925) đã tri n khai công trình c a Paal b ng cách dùng thí nghi m sinh

tr ng th ng d a trên s v n dài c a di p tiêu Avena trong t i N u di p tiêu b c t

r i, thì s v n dài s b gi m Khi đ t đ nh di p tiêu tr l i thì s sinh tr ng th ng

nh ban đ u đ c ph c h i

Hình 1.2 Thí nghi m c a Went (1926) cho th y có m t ch t hoá h c t chóp di p tiêu

b c t kích thích s phát tri n tr l i c a di p tiêu b c t m t chóp trong t i

Went (1926) đã thu đ c m t ch t hoá h c ho t đ ng t chóp di p tiêu Avena

b ng cách đ t nh ng chóp di p tiêu này trên kh i agar Sau m t th i gian, b nh ng chóp di p tiêu, và c t agar ra t ng kh i nh Ông đã th y r ng kh i agar này ch a đ ng

ch t hòa tan t đ nh chóp đ c c t đã kích thích s phát tri n tr l i c a di p tiêu khi

đã đ c đ t trên nh ng thân c t đ u

Hình 1.3 Sinh tr c nghi m di p tiêu Avena c a Went (1928)

C t chóp t chóp lên kh i t kh i agar agar 1-4 gi tr l i di p tiêu,

ph c h i s sinh tr ng

Went (1928) c ng đã phát tri n m t ph ng pháp đ đ nh l ng ch t đi u hòa sinh tr ng hi n di n trong m u Ông th y r ng có s liên quan gi a s cong c a di p tiêu v i l ng c a ch t sinh tr ng th c v t ho t đ ng Nh ng phát hi n c a Went đã kích thích m nh m vi c nghiên c u ch t sinh tr ng th c v t T thí nghi m s cong

c a Avena, indole Acetic Acid (IAA) đã đ c phát hi n ây là m t phát hi n r t quan

tr ng đánh d u s kh i đ u c a ngành khoa h c v ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t

Kögl và Haagen-Smith (1931) đã b t đ u v i 33 gallon n c ti u c a ng i

Tr i qua m t lo t b c thanh l c, v i vi c th ho t tính sinh h c sau m i b c b ng

cách dùng th nghi m v s nghiêng c a Avena B c thanh l c cu i cùng c a h đã thu đ c 40 mg h p ch t đ c g i là auxin B (auxenoleic acid) Trong d ch trích này

có ch a heteroauxin và ngày nay đ c g i là indole-3-acetic acid ây chính là ch t

đ c Salkowski phát hi n vào n m 1885

N m 1934, Kögl và Haagen-Smith đã phân l p IAA t men bia và Thimann

c ng đã phân l p IAA t vi c nuôi c y Rhizopus suinus vào n m 1935 Mãi đ n n m

1946, Haagen-Smith và nhi u ng i khác c ng đã phân l p đ c IAA tinh khi t t n i phôi nh c a h t b p i u này cho th y r ng IAA đã đ c tìm th y th c v t b c cao Vliegenthart (1966) đ a ra b ng ch ng r ng Auxin A và B không ph i là s n ph m c a

th c v t t nhiên Tuy nhiên, IAA đã đ c phân l p trên m t s l ng l n loài th c v t

và xu t hi n m i n i trong th c v t b c cao Auxin c a Went có th là IAA, tuy nhiên

nh ng ch t kích thích khác có th có trong nh ng nghiên c u s khu ch tán kh i đ u trên s đáp ng v tác đ ng c a ánh sáng, có th là d n xu t c a IAA Thu t ng auxin

có ngu n g c t ti ng Hy L p Auxein có ngh a là “grow” (m c, sinh tr ng) Kögl, Haagen-Smith và Went đã đ ngh s d ng thu t ng này đ đánh d u s phát hi n m t

ch t đ c bi t có kh n ng kích thích s sinh tr ng cong c a di p tiêu y n m ch Avena

1.1.2 Gibberellin (GA)

T lâu ng i nông dân Nh t B n đã th y hi n t ng cây lúa cao s m h n bình

th ng H ngh r ng đó là s sinh tr ng t t và s có m t mùa b i thu Tuy nhiên, khi

v mùa đ n thì nh ng cây này tr nên l ng th ng, b t th , h t lép Thay vì m t mùa

b i thu, 40% n ng su t đã b m t đi hàng n m do tri u ch ng này B nh này đã đ c

ng i nông dân Nh n B n g i nhi u tên d a theo tri u ch ng quan sát đ c, vài tên thông d ng là bakanae (m ngu), ahonae (m khùng), yrei (ma), somennae (m mì m)…Thu t ng quen thu c đ c dùng là m bakanae Vi t Nam, tri u ch ng này

c ng r t d th y lúa mùa

Vào n m 1898, Hori là ng i đ u tiên cho r ng b nh Bakanae gây ra b i s xâm

nhi m c a m t loài n m thu c chi Fusarium (Hori, 1898) Sawada (1912) cho r ng s

v n dài c a lóng là do ch t kích thích t s i n m Kurosawa (1926) ch ng minh r ng chính ch t đ c ti t ra b i n m Bakanae gây ra s v n dài Có m t lo t tranh lu n v

vi c đ nh danh n m Bakanae vì ng i ta có th th y nó nh ng d ng khác nhau V n

đ này đã đ c gi i to vào n m 1931 khi Wollenweber đ t tên giai đo n b t toàn (vô

tính) Fusarium moniliforme (Sheldon), và giai đo n hoàn toàn (h u tính) Gibberella

fujikuroi (Saw.) Wr Tuy nhiên s thanh l c ch t sinh ra do n m Bakanae b tr ng i

b i s hi n di n c a m t ch t c ch sinh tr ng là fusaric acid (5-n-butylpicolinic acid) Vào n m 1935, Yabuta đã phân l p m t ch t d ng tinh th có ho t tính t d ch

l c môi tr ng thanh trùng n m Gibberella fujikuroi Ch t này đã kích thích s sinh

tr ng khi đ c áp d ng vào r m lúa và đ c g i là gibberellin A ây là l n đ u tiên thu t ng gibberellin đ c dùng trong danh pháp khoa h c Yabuta và Sumiki (1938) đã thành công trong vi c tinh th hoá gibberellin A và gibberellin B Tuy nhiên

do chi n tranh, nghiên c u v gibberellin đã b x p l i Vào th p niên 1950, các nhà khoa h c Anh, M và Nh t B n đã có nh ng nghiên c u sâu h n v đ c tính đi u hòa sinh tr ng c a gibberellic acid Các gibberellic trong nh ng d ch trích n m đã đ c

đ nh danh và chúng c ng đã đ c phát hi n th c v t b c cao Vào n m 1954, nh ng nhà nghiên c u ng i Anh (Brian và c ng tác viên, 1954) đã nh n th y nh ng đ c tính

đi u hòa sinh tr ng c a gibberelic acid t d ch trích n m Gibberella fujikuroi Vào

n m 1955, nh ng nhà khoa h c M đã nh n di n đ c ch t mà h g i là gibberellin A

và gibberellin X t d ch trích môi tr ng thanh trùng n m Gibberella fujikuroi C ng

vào n m 1955, nh ng nhà khoa h c Nh t B n đã th y r ng gibberellin A ch a ba h p

ch t phân bi t đ c g i là GA1, GA2, GA3 Ngày nay, gibberellic X, gibberellic acid và

GA3 đ c bi t là cùng h p ch t Radley (1956) đã phát hi n ra nh ng h p ch t t ng

t v i gibberellic acid trong th c v t b c cao Ngày nay, gibberellin đã đ c tìm th y trong nhi u th c v t b c cao Takahashi và c ng tác viên (1951), đã phát hi n GA4 t

n m Gibberella fujikuroi MacMillan và Takahashi (1968) đã đ ngh cách g i tên

gibberellin A1-Ax b t ch p ngu n g c c a chúng Cách n y v n còn dùng đ n ngày nay cho kho ng 136 gibberellin đã đ c phát hi n

1.1.3 Cytokinin

Haberlandt (1913) th y r ng ch t khu ch tán c a mô libe có kh n ng kích thích

t bào t ng sinh trong mô c khoai tây G n h n 30 n m sau Van Overbeek và c ng tác viên (1941) đã th y r ng s n ph m t nhiên tìm th y trong n c d a (n i nh l ng) có

kh n ng kích thích s t ng sinh t bào trong phôi non c a cà đ c d c Datura Van

Overbeek và c ng tác viên (1944) c ng phát hi n trong d ch trích thô c a phôi cà đ c

d c Datura, n m men, m m lúa mì và b t h ch h nh (Almondmeal) kích thích s

phân chia t bào trong nuôi c y phôi cà đ c d c Datura i u n y cho th y nh ng

ch t n y đã phân b r ng trong nhi u loài K th a công trình c a Haberlandt, vào n m

1945, Jablonski và Skoog đã phát hi n r ng nh ng t bào mô m ch ch a nh ng ch t kích thích s phân chia t bào cây thu c lá Miller và c ng tác viên (1955) đã công b

v s thành l p và đ nh danh kinetin (6-furfurylaminopurin) thu đ c t DNA c a tinh trùng cá trích tr ng thành hay t DNA c a tinh trùng cá trích đ c h p thanh trùng

H đã đ t tên h p ch t n y là Kinetin b i vì nó có kh n ng kích thích s phân chia t

bào (Cytokinesis) trong mô lõi thu c lá Hall và c ng tác viên (1955) nh n th y kinetin

có th đ c s n sinh b ng cách thanh trùng m t h n h p c a adenine và furfuryl alcohol i u này cho th y r ng kinetin có th đ c t o thành t nh ng s n ph m phân

rã DNA Miller (1961) đã xác đ nh đ c s n ph m gi ng nh kinetin t nhiên trong

b p, s n ph m n y sau đó đ c g i là zeatin S phát hi n ra ch t n y c ng ph i k đ n vai trò c a Letham và Miller (1963) K t khi phát hi n ra zeatin, m t s l ng l n cytokinin khác c ng đã đ c phát hi n và cho th y nó phân b r ng trong th c v t b c cao

1.1.4 Abscisic acid (ABA)

Liu và Carns (1961) đã phân l p m t ch t t qu bông chín và th y r ng nó kích thích s r ng cu ng lá bông C u trúc c a h p ch t n y đ c g i là abscisin I đã không

đ c xác đ nh N m 1963, nhóm c a Addicott M đã phân l p m t ch t t qu bông non và th y r ng nó c ng gây ra s r ng cu ng lá bông H đã đ c tính hoá nhóm n y thành t ng ph n, cho th y r ng nó là m t h p ch t ch a 15-carbon và đã g i là abscisin

II H u nh đ ng th i v i báo cáo v abscisin II, nhóm c a Wareing Anh c ng đã phân l p đ c m t ch t c ch t lá c a cây huê (birch) trong đi u ki n ngày ng n Khi

h p ch t n y đ c áp d ng lên cây huê non, nó đã c ch s sinh tr ng c a ch i

ng n i u n y đã d n đ n k t lu n r ng: H p ch t n y là tác nhân gây ra miên tr ng

và h p ch t ch a rõ đ c tính n y đ c g i là dormin Vào n m 1965, nh ng nhà nghiên

c u c a phòng thí nghi m Addicott đã đ xu t c u trúc hoá h c c a abscisin II M t l n

n a h u nh đ ng th i, k t qu c a Wareing c ng tác v i nh ng nhà nghiên c u c a công ty Shell Anh đã cho th y r ng dormin và abscisin II là cùng m t h p ch t

đ n gi n hóa v n đ v danh pháp, nh ng nhà th c v t h c hàng đ u trong l nh v c nghiên c u n y đã đ ng ý đ t tên abscisic acid và báo cáo ý ki n k t lu n c a h h i ngh qu c t l n th sáu v ch t đi u hoà sinh tr ng Ottawa vào n m 1967 Ngày nay, thu t ng abscisin I, abscisin II và dormin đã đi vào quên lãng T khi phát hi n, ABA đã cho th y tính phân b r ng trong th c v t b c cao và có nh ng nh h ng

r ng l n, thêm vào đó là nh h ng lên tính miên tr ng và s r ng

1.1.5 Ethylene

Nh ng ng d ng th c ti n c a ethylene đã b t đ u t x a b i nh ng ng i c

Ai C p, h đã v ch nh ng v t th ng lên trái đ kích thích s chín Nh ng ng i Trung Hoa đã đ t h ng tr m trong bu ng kín đ gia t ng s chín c a lê Ng i Vi t Nam c ng đã dùng khói than hay khói nhang đ làm chín trái cây Girardin (1864)

nh n th y r ng h i thoát ra t ánh sáng đèn đ ng đ t t than đã gây ra s r ng s m

c a lá g n ngu n sáng Ng i ta c ng th y h i t ánh sáng đèn c ng đã gây ra s c n

c i, v n v o và s sinh tr ng ngang b t th ng c a ch i N m 1901, nhà khoa h c Nga Neljubow cho r ng ethylene là thành ph n ho t tính c a h i ánh sáng đèn Khí ethylene đã gây ra m t đáp ng b ba nh trên v i nh ng cây đ u Hà Lan úa vàng K t

qu n y đã đ c dùng đ phát tri n sinh tr c nghi m đ u tiên v ethylene d a trên hi n

t ng làm gi m s v n dài thân c a nó, gia t ng s phát tri n bên, và kích thích s nghiêng ho c sinh tr ng ngang trong s đáp ng v i tr ng l c Doubt (1917) đã phát

hi n ra r ng Ethylene kích thích s r ng N m 1923, Denny đã giành đ c b ng sáng

ch b ng ph ng pháp dùng s n ph m đ t cháy đ kích thích s chín c a cam và quít

N m 1924, Denny ch ng minh r ng Ethylene chính là thành ph n ho t tính trong

nh ng s n ph m đ t cháy gây ra s chín N m 1910, Couins cho r ng trái c ng phóng thích ra h i kích thích s chín Trong báo cáo h ng niên v i B Nông Nghi p Jamaica, Couins đã công b r ng trái cam đã chín s m h n bình th ng khi đ c tr chung v i chu i Mãi đ n 20 n m sau, khí này m i đ c Gane (1934) ch ng minh là khí ethylene Ethylene đ c th c v t t ng h p và có liên quan t i t c đ c a quá trình chín

M t th i gian ng n sau, Crocker và c ng tác viên (1935) vi n Boyce Thompson đã

ch ng minh r ng ethylene là hormone gây ra s chín, ethylene c ng ho t đ ng nh

ch t đi u hoà sinh tr ng trong nh ng c quan th c v t Gi thuy t n y đã đ c nhi u

nhà nghiên c u ng h Biale và c ng tác viên (1954) đã dùng nh ng ph ng pháp tr c nghi m thích h p nh ng không nh y c m v i ethylene và đã tìm th y r ng trái cây đã không s n xu t đ l ng ethylene tr c khi chín đ t o nên s chín Công trình này

c ng đ t gi thuy t r ng ethylene nh h ng lên s chín c a trái Vào n m 1959, s phát hi n ethylene b ng ph ng pháp s c ký khí trong th c v t đ c phát tri n đã giúp xác đ nh ethylene v i m c đ nh h n g n m t tri u l n so v i nh ng ph ng pháp khác đang t n t i V i k thu t thích h p này, nh ng công trình nghiên c u v ethylene

đã ngày m t nhi u và ethylene đã đ c công nh n là ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t

có nhi u nh h ng lên th c v t t s n y m m c a h t đ n s lão hóa và ch t c a cây

1.1.6 Brassinosteroid (BR)

Công b đ u tiên v kh n ng có m t c a m t nhóm ch t đi u hòa sinh tr ng

th c v t m i đã xu t b n vào n m 1968 Nh t B n T 430 kg lá t i c a cây isunoki

(Distilium racemosum Sieb Et Zucc.), 3 nhóm có ho t tính là Distilium factor A1 (751

µg), A2 (50 µg) và B (236 µg) đã đ c phân l p Ba nhóm này đ u cho ho t tính m nh

h n IAA trong sinh tr c nghi m v s nghiêng c a lá lúa (rice lamina inclination test, lamina joint test (LJT)) Tuy nhiên, vì gi i h n c a s l ng trích đ c đã không cho phép đ nh danh đ c t ng h p ch t vào th i đi m này Vào n m 1970, “Brassins” đã

đ c các nhà khoa h c M trích đ c t ph n hoa cây c i d u (Brassica napus L.)

c ng cho ho t tính sinh h c r t m nh Brassins gây s v n dài c a lóng th hai c a cây đ u lên đ n 155 mm li u l ng 10 µg/ cây, trái l i đ i ch ng ch có 12 mm

Vi c phân l p và đ nh danh nó g p r t nhi u khó kh n Tr c h t ng i ta ngh r ng nó

là β-glycoside c a ch t béo N m 1974, m t ch ng trình đ c bi t c a B Nông Nghiêp M đã kh i đ ng 227 kg ph n hoa c i d u thu đ c t các t ong đã đ c s

d ng cho ti n trình B ng ph ng pháp phân tích tinh th h c v i tia X đã cho th y

r ng h p ch t m i này là m t lactone steroid v i c u trúc đ c đ t tên là brassinolide (BL) (Grove & c ng tác viên, 1979) D a trên khám phá này các nhà khoa h c Nh t

B n đã đ nh danh tr l i Distilium factor A1 là h n h p c a castasterone và

28-norcastasterone, B là h n h p c a brassinolide và 28-norbrassinolide, A2 v n ch a

đ nh danh đ c và đ c đ ngh là 2-deoxy-type brassinolide

K t khi BL đ c phát hi n, các nhà khoa h c Nh t B n và các nhà khoa h c khác đã phát hi n thêm nhi u ch t thu c nhóm này, vi c t ng h p c ng đã thành công

T đó nh ng nghiên c u v BL và nh ng ch t có liên quan đã phát tri n r t nhanh Nhóm ch t đi u hoà sinh tr ng này đã đ c xem nh là nhóm th sáu k t khi vai trò sinh lý c a auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylene đ c phát hi n

BR đã đ c tìm th y trong nhi u loài th c v t bao g m cây song t di p, đ n t di p,

kh a t và t o BR c ng đ c tìm th y trong nhi u b ph n khác nhau c a th c v t nh túi ph n, lá, hoa, h t, ch i, m n lá và thân Ngày nay đã có h n 40 ch t đ c phát hi n thu c nhóm này Trong s đó BL và castasterone đ c xem là quan tr ng nh t vì tính phân b r ng và ho t tính sinh h c m nh

1.1.7 Salicylate (SA)

Nh ng ng i Hy l p c và th dân Hoa K đã phát hi n r ng lá và v cây li u

tr đ c b nh đau nh c c c b và nh ng b nh s t Vào n m 1828, Johann Buchner làm

vi c Munich, c l n đ u tiên phân l p nh ng v t c a salicin là glucoside c a salicyl alcohol và salicylate trong v cây li u (Weissmann 1991) Raffaele Piria (1838) đã đ t tên cho thành ph n ho t tính trong v cây li u là salicilic acid (SA) t ch latin “salix”,

có ngh a là cây li u Vào n m 1874, s n ph m th ng m i đ u tiên c a SA đã đ c bán

c Vào n m 1898, aspirin tên th ng m i c a acetylsalicylic acid đã đ c công ty Bayer gi i thi u Có nhi u tài li u tham kh o, trong đó nh ng nhà th c v t h c đã dùng aspirin và salicylic acid thay th cho nhau trong thí nghi m Tuy nhiên, nên chú ý r ng aspirin không đ c xem là m t s n ph m t nhiên Nó có th có hi u qu b i vì acetylsalicylic acid s n sàng đ c chuy n thành saliclic acid trong h th ng dung d ch

n c Ngày nay salicylic acid đ c bi t trên nhi u loài cây và đ c xem nh là m t

ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t quan tr ng

1.1.8 Jasmonate (JA)

Demole và c ng tác viên (1962) l n đ u tiên đã phân l p (-) jasmonic acid

methylester t d u thi t y u c a Jasminum grandiflorum (h lài) Ngày nay, Jasmonic

acid (JA) và đ ng phân l p th c a nó (+) 7-iso-JA là nh ng đ i di n chính c a nhóm jasmonate m c dù m t s l ng l n c a acid béo cyclopentane có quan h c u trúc khác đã đ c xác đ nh Kh i đ u, jasmonic acid đã đ c nh n ra do ho t đ ng c ch sinh tr ng c a nó Ngày nay nó đã cho th y s phân b r ng trong th c v t b c cao và

đi u lý thú là kh n ng c a nó trong vi c gia t ng s th hi n c a nh ng gene th c v t

đ c bi t, trong s đó có nh ng đáp ng v i s t n th ng

1.2 Các khái ni m c b n và thu t ng

1.2.1 Yêu c u đ i v i m t ch t đi u hòa sinh tr ng

N m 1959, Jacobs đã đ a ra cách đánh giá v nh h ng c a các hóa ch t lên sinh v t và ch y u đ c áp d ng đ i v i auxin và tính quang h ng đ ng (phototropism) Các ph ng pháp này v n còn dùng đ n ngày nay đ đánh giá nh

h ng c a m t ch t t ng tr ng th c v t lên các quá trình sinh tr ng và phát tri n PESIGS (Presence/ parallel variation, Excision, Substitution, Isolation, Generality và Specificity) là 6 ch cái đ c dùng đ đ t tên cho ph ng pháp này t ng đ ng v i 6 qui lu t sau:

(1) S t n t i và bi n đ i t ng đ ng: Ch t kh o sát ph i hi n di n trong sinh

v t và có s bi n đ i t ng đ ng v s l ng c a nó v i ho t đ ng có liên quan S

bi n đ i này ph i th a hai yêu c u sau:

a Hàm l ng ch t t ng tr ng th c v t ph i đ c đo chính xác trong mô, t bào

ho c ngay c d i m c t bào, n i có các ph n ng x y ra

b Ch t đó ph i đ c tìm th y trong nhi u loài sinh v t

(2) S c t r i: Là s tách r i c a m t c quan, mô, ho c m t c quan t có kh

n ng s n sinh ra m t lo i hoá ch t nào đó Khi c t r i b phân này thì các quá trình có liên quan s b ng ng tr

(3) S thay th : M t lo i hóa ch t tinh khi t có th đ c thay th cho m t b

ph n bình th ng đã b c t đi và nó có th ph c h i l i các quá trình sinh tr ng và phát tri n

(4) S cô l p: Th c hi n m t quá trình cô l p v i các h th ng ph n ng khác

đ n m c có th ch p nh n đ c và xác đ nh đ c nh h ng c a hóa ch t t ng t nh trong h th ng ít đ c cô l p

(5) Tính t ng quát: Cho th y r ng vi c áp d ng hóa ch t này trong nhi u tr ng

h p là t ng t nhau

(6) Tính chuyên bi t: Hóa ch t này ph i đ c tr ng

1.2.2 Các khái ni m và thu t ng

1.2.2.1 Hormone th c v t (Plant hormone, phytohormone)

bi t gây ra m t s thay đ i ho c m t tác đ ng trong m t t bào ho c mô nào đó trong

ho t đ ng

1.2.2.2 Ch t sinh tr ng th c v t (Plant growth subtance)

Thu t ng hormone th c v t đã đ c dùng nhi u n m, nh ng ngày nay ng i ta

có khuynh h ng thay th b ng thu t ng ch t sinh tr ng th c v t (plant growth subtance) hay ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t (plant growth regulator) T ch c

qu c t nghiên c u v nh ng ch t này đ c g i là Hi p H i Ch t Sinh Tr ng Th c

V t Qu c T (International Plant Growth Substances Association) T ch c này nhóm

h p 3 n m m t l n

b r ng th c v t b c cao

- Nó ph i đóng vai trò c n b n trong vi c đi u hoà các hi n t ng sinh lý trong

mô trong su t quá trình phát tri n

nh ngh a này bao g m toàn b nh ng ch t sinh tr ng th c v t đã đ c ch p

nh n nh auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid, ethylene, brassinosteroid, salicylate, jasmonate và nh ng h p ch t khác b ng cách lo i b yêu c u v v n chuy n Yêu c u ph i có s v n chuy n đã đ c lo i b vì khái ni m cho r ng các ch t t ng

tr ng th c v t tác đ ng xa n i chúng đ c t ng h p không còn hoàn toàn đúng Ví

d : Cytokinin có th đ c sinh ra trong r và di chuy n đ n các ch i và làm ch m s hoá già đây Trái l i, ethylene có th đ c di chuy n hay kích thích nh ng thay đ i ngay n i nó đ c t ng h p nh ngh a m i này còn nói lên s t ng tác c a t t c

nh ng ch t đã bi t v i nh ng ch t khác ch a đ c phát hi n C ng nên l u ý r ng, hormone đ ng v t nói chung là nh ng h p ch t nh protein có tr ng l ng l n Trái

l i, ch t sinh tr ng th c v t có tr ng l ng phân t nh Nó ch cung c p m t tính

hi u t t ho c m b ng cách kích thích m t vài s ki n trong t bào d n đ n m t đáp

ng nào đó

1.2.2.3 Ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t (Plant growth regulator, PGR)

Thu t ng ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t (Plant growth regulator, PGR) đã

đ c dùng r t nhi u b i các công ty nông d c đ ch các ch t đi u hoà sinh tr ng

t ng h p nh ngh a c a Van Overbreek và c ng tác viên (1954) v n còn đ c dùng

đ n ngày nay

quá trình sinh lý nào trong th c v t

ti n l i và d hi u trong cách dùng t ti ng Vi t, thu t ng ch t đi u hoà

và nh ng ch t sinh tr ng th c v t có ngu n g c t nhiên đ c s n sinh t th c v t

1.2.2.4 Ch t c ch và ch t làm ch m sinh tr ng (Inhibitor và retardant)

Thu t ng ch t c ch (Inhibitor) và ch t làm ch m sinh tr ng (retardant) hi n

nay ch a đ c phân bi t rõ Abscisic acid và nh ng ch t c ch khác đã c ch ho c làm ch m hay trì hoãn nh ng quá trình sinh lý ho c sinh hóa, tuy nhiên, vi c ng d ng chúng đ làm ch m quá trình sinh tr ng thì ch a đ c áp d ng hoàn toàn vào th c

ti n vì nhi u lý do, trong đó giá c c ng là m t v n đ Ngày nay có nhi u h p ch t

h u c t ng h p đ c dùng trong nông nghi p đ làm ch m s sinh tr ng c a th c

v t Ch t làm ch m sinh tr ng c a th c v t (plant growth retardant) là m t h p ch t

h u c làm ch m s phân chia t bào và s v n dài t bào trong mô ch i và nh v y

nó đi u hoà chi u cao cây mà không gây ra s bi n d ng c a lá và thân Cây đ c x

lý v i m t ch t làm ch m sinh tr ng có lá màu xanh đen đi n hình và s tr hoa b

nh h ng tr c ti p S phát tri n c a nh ng cây này thì không hoàn toàn b ng n c n

nh ng xu ng d c h i đ t ng t và cho ra m t d ng cây c n c i h n

M t vài ví d v nh ng ch t làm ch m sinh tr ng th c v t là:

- Cycocel: 2-chloroethyl trimethyl-ammonium chloride

- Paclobutrazol: 1-(4-chlorophenyl) -4,4 dimethyl -2- (1H-1,2,4- triazol-1-yl) pentan-3-ol

- Bonzi: (2 RS, 3RS)-1-(4-chlorophenyl-4-dimethyl-2- (1,2,4-triazol-1-yl) penten-3-ol

- Prohexadione-calcium: Calcium enecarboxylate

Nhi u ch t làm ch m sinh tr ng th c v t có tác d ng ch ng l i nh h ng c a gibberellin còn đ c g i là antigibberellin

Ch ng 2

PH NG PHÁP TRÍCH, TINH L C VÀ XÁC NH

CH T SINH TR NG TH C V T

Ch t đi u hòa sinh tr ng th c v t liên quan đ n h u h t các chu trình s ng

c a th c v t Th c t cho th y vi c áp d ng ngo i sinh c ng có nh ng nh h ng lên th c v t rõ nét Tuy nhiên, không d phát hi n ch t đi u hoà sinh tr ng trong

th c v t v i nhi u lý do khác nhau trong đó k thu t phân tích chúng v n còn ph c

t p Có nhi u ph ng pháp đ trích, thanh l c và đ nh l ng ch t đi u hoà sinh

tr ng th c v t tu theo nhóm đ c kh o sát Trong ch ng này s gi i thi u khái quát nh ng ph ng pháp c b n t chu n b mô đ n đ nh tính và đ nh l ng ch t

đi u hoà sinh tr ng

2.1 Ph ng pháp ly trích

2.1.1 Ph ng pháp khu ch tán

Mô đ c dùng cho sinh tr c nghi m

M t c t c a mô đ c đ t trên

đ a agar ch a ch t ch ng oxy hóa

Ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t khu ch tán vào trong môi tr ng b o hoà m

Ph ng pháp này ch có th áp d ng cho nh ng mô nguyên còn t i ho c

nh ng ph n c a cây Mô tr c h t đ c nhúng vào dung d ch gelatin 300

C đ gi

m ng n s b t ho t c a nh ng ch t đi u hoà sinh tr ng trên b m t v t c t, butylate hydroxytoluen (BHT) (1-2%) đ c tr n đ u vào trong agar và có tác d ng

nh m t ch t ch ng oxy hoá khi mô đ c nhúng vào trong agar Mô đ c đ t lên

kh i agar và đ c gi trong bu ng m t vài phút đ n vài gi tu thu c vào lo i mô

s d ng

Sau m t th i gian, kh i agar có th đ c dùng cho nhu c u sinh tr c nghi m

ây là m t ph ng pháp r t t t đ c l ng m i quan h v m c đ c a ch t đi u hoà sinh tr ng trong nh ng ph n khác nhau c a cây C n chú ý r ng quá trình này

ch cho th y m i quan h c a nh ng ch t hi n di n b i vì nh ng ch t kích thích hay

c ch b m t v t c t có th gây tr ng i đ n sinh tr c nghi m đang áp d ng ây

là m t ph ng pháp đ n gi n và không th áp d ng cho vi c đ nh tính hay đ nh

l ng m t cách hoàn h o vì ch t đi u hòa sinh tr ng thu đ c v i m t l ng c c

nh , do đó, b t k m t s th t thoát nào do phân hu thu c v enzyme ho c s chuy n đ i qua l i gi a các ch t đ u có th d n đ n nh ng k t qu không chính xác Cách hi u qu nh t đ gi m u sau khi thu là ngay l p t c đông m u trong nitrogen

l ng, p l nh và làm khô r i tr -800C ho c th p h n d i nh ng đi u ki n khan,

đi u này s h n ch t i đa các v n đ b t tr c x y ra

2.1.2.2 Ly trích

Có nhi u ph ng pháp dùng đ trích ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t, c n

ch n ph ng pháp thích h p cho đi u ki n nghiên c u c a mình Có nhi u lo i dung môi có th đ c dùng đ trích ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t nh methanol ho c ethanol có th đ c dùng đ trích IAA, ABA, GA, BR, cytokinin,

SA và JA; acetone có th đ c dùng đ trích IAA, ABA và GA; isopropanol ho c cloroform có th đ c dùng đ trích BR; h n h p Bieleski g m methanol/ chloroform/ 90% formic acid/ n c (12:5:1:2 v/v) ho c perchloric acid có th đ c dùng đ trích cytokinin

Ph n l n dung d ch trích đ c dùng thông th ng cho t t c các ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t là 80% methanol c ng thêm m t ch t ch ng oxy hoá nh BHT M u đ c nghi n trong m t l ng d dung môi l nh r i có th đ c pha thêm v i r u n ng đ cao theo m t l ng tiêu chu n đ hi u ch nh s th t thoát thình lình trong quá trình trích và nh ng b c làm s ch ti p theo M u sau đó đ c

l c và mô đ c s d ng đ trích tr l i đ thu đ c s n ph m nhi u nh t Nhìn chung, s l n trích tu thu c vào mô và nh ng y u t khác, m c đích nh m thu

đ c s n ph m t i đa, thông th ng quá trình trích có th l p l i 3-4 l n D ch trích

đ c nên tr n l n v i nhau và cô đ c b ng cách cho b c h i trong chân không ho c làm khô ho c pha trong dung d ch đ phân đo n ho c l c xen k v i các quá trình làm khô Sau khi lo i b dung môi h u c t d ch trích, m t l ng đáng k c a

nh ng mãnh v n r n th ng g p trong pha n c và trong s phân đo n mang tính acid ti p theo Nh ng ch t r n này s hoà tan trong pha h u c , do đó s làm nhi m

đ c gi i thi u đây i v i nh ng ch t đi u hoà sinh tr ng có tính acid thì pH

c a pha ch a n c t d ch trích thô nên đ c đi u ch nh đ n kho ng 2,5 và dung

d ch đ c cho vào trong bình chi t v i m t l ng t ng đ ng c a diethyl ether r i

l c c n th n Bình chi t sau đó đ c đ yên vài phút đ các pha tách nhau N u nh

t ng t o thành do l c quá m nh, bình chi t nên đ t vào máy p l nh cho đ n khi phân bi t thành hai pha riêng bi t ho c dùng CaCl2 hay Na2SO4 đ lo i nh t ng

M t ph n c a nh ng ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t s đi t pha ch a n c đ n pha ch a diethyl ether Quá trình này có th l p l i t 3 đ n 4 l n ho c h n n a đ

l y h t ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t có tính acid ra kh i pha ch a n c C n

c l ng s l n th c hi n đ thu đ c t i đa l ng ch t đi u hoà sinh tr ng Pha

ch a n c sau đó s đ c b đi và pha ch a diethyl ether s đ c làm khô trong chân không M c dù phân đo n b ng dung môi là cách th ng đ c s d ng t

tr c đ n nay, đôi khi nó c ng không hoàn h o cho m i tr ng h p Ngày nay, nó đang đ c thay th b ng ph ng pháp trích ly l ng-r n Vi c s d ng m t pha r n

nh i vào trong m t c t nh và s d ng m t l n đã làm cho vi c chu n b m u nhanh

h n, hi u su t thu h i cao h n và th tích dung môi s d ng l i ít h n Vi c s d ng

nh ng c t nh đã đ c dùng đ trích cho h u h t các ch t đi u hoà sinh tr ng và

đã cung c p m t s thay đ i đ c đáo đ n s phân đo n b ng dung môi Vi c thanh

l c ch t đi u hoà sinh tr ng c ng đã có nhi u thành công trong vi c s d ng s c

ký gi y, s c ký l p m ng, s c ký c t, s c ký khí và s c ký l ng cao áp M t ph ng pháp s c ký có th cung c p đ cho quá trình l c đ đ nh l ng, tuy nhiên ph n l n

ph i k t h p nhi u ph ng pháp cho quá trình l c

2.3 nh l ng ch t sinh tr ng th c v t

Theo sau quá trình trích và l c c a ch t đi u hoà sinh tr ng là vi c đ nh

l ng Ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t có th đ c đ nh l ng b ng sinh tr c nghi m, nh ng ph ng pháp hoá lý h c (s c ký khí ho c s c ký l ng cao áp), ho c

ph ng pháp mi n d ch h c

2.3.1 Sinh tr c nghi m (Bioassay)

có m t sinh tr c nghi m h u d ng, c n l u ý nh ng tiêu chu n sau:

1 Nó ch đ c bi t cho h p ch t đang th nghi m

2 Nó ph i r t nh y c m đ có th phát hi n m t l ng nh ch t đi u hoà sinh tr ng

3 Nó ph i nhanh và d đ thu đ c m t l ng l n mô th c v t đ ng nh t

S đáp ng c a mô đ i v i m t ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t đ c bi t c ng

ph i nhanh và d th c hi n

4 Ch t đang đ c sinh tr c nghi m ho c nh ng ch t có liên quan ph i hi n

di n m c đ th p ho c không có trong cây

Có r t nhi u h th ng sinh tr c nghi m cho m i nhóm ch t đi u hoà sinh

tr ng th c v t đã bi t i u quan tr ng là ch n ph ng pháp sinh tr c nghi m phù

h p v i nh ng tình hu ng riêng bi t Có th chia sinh tr c nghi m thành 5 nhóm sau:

- (1) Sinh tr c nghi m ch n đoán: Sinh tr c nghi m đ c bi t dùng đ phát

hi n m t ch t đi u hoà sinh tr ng đ c thù

- (2) Sinh tr c nghi m dùng đ xác đ nh nh ng quan h v ho t tính và c u trúc: Sinh tr c nghi m di n t s khác bi t v tính nh y c m đáp ng v i c u trúc

c a nh ng ch t khác nhau trong cùng m t nhóm ch t đi u hoà sinh tr ng

- (3) Sinh tr c nghi m ki m tra th và phát hi n: Sinh tr c nghi m có tính

nh y c m m nh và đáp ng nhanh cùng v i tính chuyên bi t đ y đ , cho phép có

th s d ng trong vi c phát hi n ch t đi u hoà sinh tr ng n ng đ r t th p trong

t ng phân đo n s c ký khác nhau

- (4) Sinh tr c nghi m t ng ho t tính sinh h c c a nhóm: Sinh tr c nghi m

đ ho c g n đ nh y c m đ nh ng ch t có c u trúc đa d ng thu c m t nhóm ch t

đi u hoá sinh tr ng cho phép xác đ nh đ c ho t tính t ng s c a m t nhóm đ c

bi t trong d ch trích

- (5) Sinh tr c nghi m có yêu c u đ n gi n: Nh ng sinh tr c nghi m có yêu

c u v thi t b chuyên bi t và không gian th p, giá thành r và d thu đ c m u

2.3.1.1 Sinh tr c nghi m auxin

2.3.1.1.1 Sinh tr c nghi m s cong di p tiêu y n m ch (Avena): D a trên kh n ng

kích thích s sinh tr ng cong c a auxin và s v n dài

2.3.1.1.2 Sinh tr c nghi m s th hi n gene thu c lá (Nicotiana): D a trên s th

hi n c a gene th kh m (chimeric) trong nguyên bào th t lá cây thu c lá đ c chuy n gene đáp ng v i c auxin và cytokinin S đ nh l ng c a m i ch t đi u hoà sinh tr ng d a trên ph n ng màu tác đ ng b i ánh sáng

2.3.1.1.3 Sinh tr c nghi m v s sinh tr ng th ng đo n di p tiêu y n m ch

nh sinh tr c nghi m s nghiêng c a Avena

2.3.1.1.4 Sinh tr c nghi m lóng đ u cove (Phaseolus): D a trên kh n ng kích

thích s sinh tr ng cong c a auxin Nó không nh y c m v i nhi t đ và có th

th c hi n trong đi u ki n sáng

2.3.1.1.5 Sinh tr c nghi m s t o r b t đ nh trên đ u xanh (vigna): D a trên kh

n ng kích thích s t o r b t đ nh c a auxin trên đo n thân

2.3.1.2 Sinh tr c nghi m gibberellin

2.3.1.2.1 Sinh tr c nghi m v s t o đ ng kh n i sinh trong lúa m ch

(Hordeum): D a trên kh n ng c a gibberellin kích thích ho t đ ng c a enzyme α-amylase đ t o đ ng kh

2.3.1.2.2 Sinh tr c nghi m cây chút chích lá r ng (Rumen): D a trên kh n ng làm

gi m lão hoá (màu vàng) c a gibberellin trong cây chút chích lá r ng

2.3.1.2.3 Sinh tr c nghi m tr c h di p rau di p (Lactuca): D a trên kh n ng kích

thích s v n dài c a gibberellin lên tr c h di p rau di p

2.3.1.2.4 Sinh tr c nghi m nh ng cây lùn nh đ u Hà Lan (Pisum), lúa (Oryza) và

b p (Maize): Sinh tr c nghi m này s d ng nh ng bi n d lùn đ n gene và d a trên

kh n ng kích thích s v n dài c a gibberellin

2.3.1.3 Sinh tr c nghi m cytokinin

2.3.1.3.1 Sinh tr c nghi m mô s o lõi thân thu c lá (Nicotiana): Khi không đ c

x lý cytokinin thì mô lõi thu c lá s không t o đ c callus ho c r t ít callus đ c

t o ra Tuy nhiên khi cytokinin đ c thêm vào thì callus s phát tri n r t nhanh cùng v i s gia t ng tr ng l ng t i

2.3.1.3.2 Sinh tr c nghi m s th hi n gene thu c lá (Nicotiana): D a trên s th

hi n c a gene th kh m trong nguyên bào th t lá cây thu c lá đ c chuy n gene đáp

ng v i c auxin và cytokinin S đ nh l ng c a m i ch t đi u hoà sinh tr ng d a trên ph n ng màu tác đ ng b i ánh sáng

2.3.1.3.3 Sinh tr c nghi m s n r ng c a t di p c c i (Raphanus): Sinh tr c

nghi m này d a trên kh n ng c a cytokinin kích thích s n r ng c a t di p c

c i

2.3.1.3.4 Sinh tr c nghi m trên s v n dài tr c h di p đ u nành (Glycine): Sinh

tr c nghi m này d a trên kh n ng c a cytokinin kích thích s v n dài tr c h di p

đ u nành

2.3.1.3.5 Sinh tr c nghi m kích thích s t o betacyanin c a c d n tr m

(Amaranthus) trong t i: S s n sinh s c t đ betacyanin th ng yêu c u có ánh sáng S sinh tr c nghi m này d a trên kh n ng kích thích s s n sinh betacyanin

c a cytokinin trong t i

2.3.1.4 Sinh tr c nghi m abscisic acid

2.3.1.4.1 Sinh tr c nghi m v s c ch n y m m h t rau di p (Lactuca) Sinh tr c

nghi m d a trên kh n ng c a ABA c ch s n y m m c a h t rau di p b i s

kh ng ch tr c h di p và s phát tri n c a r b t đ nh

2.3.1.4.2 Sinh tr c nghi m s r ng cu ng lá bông (Gossypium): Sinh tr c nghi m

này d a trên kh n ng c a ABA kích thích s r ng bông M c đ x lý ABA

càng nhi u thì s r ng s càng gia t ng

2.3.1.4.3 Sinh tr c nghi m v s c ch sinh tr ng m lúa (Oryza): D a trên s c

ch sinh tr ng b lá lúa c a ABA S gi m chi u dài b lá lúa liên quan đ n s gia

t ng n ng đ ABA đ c x lý

2.3.1.4.4 Sinh tr c nghi m s đóng khí kh u cây thài lài (Commelina): S l ng và

m c đ đóng c a khí kh u đ c quan sát đ c l ng hàm l ng c a ABA hi n

di n trong m u

2.3.1.5 Sinh tr c nghi m ethylene

2.3.1.5.1 Sinh tr c nghi m đáp ng b ba d a trên tính sinh tr ng ngang, s

ph ng lên và s c ch thân đ u Hà Lan (Pisum): Sinh tr c nghi m này d a trên

kh n ng c a ethylene c ch s v n dài, c ch s m móc tr c th ng di p và kích thích s sinh tr ng ngang M t trong ba tính ch t này đ u có th đ c dùng

đ c l ng hàm l ng ethylene trong m u

2.3.1.5.2 Sinh tr c nghi m gây ra s sinh tr ng nghiêng c a thân và lá cà chua

(Lycopersicon): S sinh tr ng nghiêng đây là s g p xu ng c a cu ng lá nghiêng c a cu ng lá t l v i hàm l ng ethylene ch a trong m u

2.3.1.5.3 Sinh tr c nghi m kích thích s chín c a trái (cà chua, chu i, chanh ): Nguyên lý c a sinh tr c nghi m này là d a trên s chín c a trái Th i gian chín c a các lo i trái nh cà chua, chu i, chanh… t l v i hàm l ng ethylene có trong m u

2.3.1.5.4 Sinh tr c nghi m s r ng t di p bông (Gossypium): Sinh tr c nghi m

này gi ng nh sinh tr c nghi m c a ABA kích thích s r ng bông Ethylene c ng kích thích s r ng M c đ r ng gây ra do ethylene t l v i l ng ethylene có trong

m u

2.3.1.6 Sinh tr c nghi m brassinosteroid

2.3.1.6.1 Sinh tr c nghi m lóng th nh t đ u cove (Phaseolus): Khi auxin đ c áp

d ng v m t phía c a lóng thì lóng cong đi và theo sau là m t chu k ch m BR làm

gi m chu k ch m khi đ c áp d ng m t gi tr c khi x lý auxin Khi BR đ c x

lý nhi u h n, IAA gây ra s sinh tr ng cong s nhanh h n

2.3.1.6.2 Sinh tr c nghi m s sinh tr ng nghiêng c a phi n lá lúa: Sinh tr c nghi m này d a trên kh n ng c a BR kích thích s nghiêng c a phi n lá lúa nghiêng c a phi n lá lúa t l v i hàm l ng c a BR có trong m u

2.3.1.6.3 Sinh tr c nghi m v s c ch : nh ng n ng đ t i h o, BR gây ra s

v n dài và cong Tuy nhiên, khi n ng đ t ng cao, BR c ch sinh tr ng và làm tét mô M c đ gi m v n dài d i giá tr đ i ch ng t l v i hàm l ng BR có trong m u

2.3.2 Hoá lý tr c nghi m

Hai ph ng pháp hoá lý tr c nghi m đ c dùng ph bi n ngày nay đ xác

đ nh ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t là s c ký l ng cao áp (HPLC: High performance liquid chromatography) và s c ký khí c t mao qu n (GC: Gas chromatography) Ngày nay HPLC ch đ c dùng v i nh ng đ u dò (detector) có

đ nh y cao ho c v i nh ng m u l c r t s ch

2.3.2.1 Phát hi n ch t sinh tr ng th c v t b ng s c ký kh i ph

S c ký kh i ph (GC-MS: Gas chromatography - Mass spectrometry) đ c xem là ph ng pháp t t nh t đ phân tích ch t đi u hoà sinh tr ng vì nó đ n gi n

và chính xác Ph ng pháp này đã đ c dùng đ phân tích IAA và nh ng h p ch t

có liên quan, ABA và các ch t bi n d ng c a nó, gibberellin, cytokinin, brassinosteroid và jasmonate Không gi ng nh đ u dò dùng cho ph ng pháp HPLC, đ u dò cho GC th ng phá hu m u và không d dàng khôi ph c l i ch t chu n đ c đánh d u phóng x S phát tri n c a ph ng pháp kh i ph cho phép

đo đ c ch t đ ng v và đ c dùng ph bi n đ xác đ nh và đ nh l ng t t c các nhóm ch t đi u hoà sinh tr ng tr ethylene vì ch t này d dàng đ c xác đ nh

2.3.2.3 Phát hi n ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t b ng HPLC

M c dù HPLC không ph i là ph ng pháp t t nh t đ phát hi n và đ nh

l ng ch t đi u hoà sinh tr ng, v n có nh ng ph ng pháp v i đ u dò đ c bi t

đ c dùng Vi c phát hi n hu nh quang đã đ c dùng đ đ nh l ng tr c ti p IAA, trái l i ABA và jasmonic acid ph i đ c chuy n hoá thành hyrazone hu nh quang

và brassinosteroid thành bisboronate hu nh quang tr c khi phát hi n b ng ph ng

đo hu nh quang Ph ng pháp này r t nh y và đ c tr ng, tuy nhiên yêu c u m u

ph i đ c l c th t s ch tr c khi phân tích S c ký l ng có th k t h p v i kh i ph thành s c ký l ng kh i ph (LC-MS: Liquid chromatography – mass spectrometry)

đ xác đ nh nh ng liên h p không d n xu t c a gibberellin và IAA M c dù có nhi u u vi t nh ng đ nh y c a LC-MS v n không b ng GC-MS, chính vì v y GC-MS ngày càng đ c s d ng nhi u

2.3.2.4 Sinh tr c nghi m mi n d ch h c

Sinh tr c nghi m mi n d ch h c hi n r t ph bi n và có nhi u giá tr trong khoa h c th c v t Ph ng pháp này yêu c u s tinh l c m u t i thi u, do đó vi c phân tích s m u l n thì r t nhanh và không đ t ti n, tuy nhiên giá thành không th t

s quan tr ng Trong nhi u tr ng h p, HPLC v n c n thi t đ thu đ c m u s ch

và k t qu thu đ c có th dùng đ so sánh v i các ph ng pháp sinh tr c nghi m hoá lý Nh ng tr ng i trong sinh tr c nghi m mi n d ch h c là có th d n đ n s

tr ng đ ly trích đ c hoàn ch nh, đ làm s ch m u mà không b tr ng i b i

ph ng pháp đang dùng, đ trích và làm s ch m u đ c t i đa và đ cung c p đ

l ng m u đ t ch t l ng đ cho vi c xác đ nh cu i cùng khi sinh tr c nghi m

Hi n t i có nhi u k thu t phân tích hi n đ i đ c dùng trong nghiên c u ch t đi u hoà sinh tr ng th c v t hay phân tích hoá h c nói chung Các thi t b c n thi t đ

th c hi n các b c phân tích hoàn ch nh là s c ký l ng cao áp, s c ký khí, s c ký

khí - kh i ph và c ng h ng t h ch tâm (Nuclear magnetic resonance: NMR) Các thi t b này cho phép thay đ i đ u dò ho c ph ng pháp phân tích đ nhà nghiên c u đ t đ c m c đích c th

Mô th c v t

Dung môi ly trích

Phân đo n và làm s ch b ng

s c ký l ng cao áp (HPLC)

Phân đo n và làm s ch b ng cách tách pha n c

v i pha dung môi h u c ho c s c ký c t

Tách thành nhi u phân đ an

Sinh tr c nghi m (bioassay)

các phân đo n thu đ c đ xác

đ nh ho t tính sinh h c

Tr c nghi m lý hóa đ đ nh tính và đ nh l ng: GC, GC-MS, LC-MS, NMR

Ch ng 3

C U TRÚC HÓA H C, SINH T NG H P VÀ NH H NG SINH LÝ

C A CÁC NHÓM CH T I U HÒA SINH TR NG TH C V T

Trong ch ng này ch y u đ c p đ n c u trúc hóa h c, sinh t ng h p và

nh h ng sinh lý c a tám nhóm ch t đi u hòa sinh tr ng th c v t chính là auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid, ethylene, brassinosteroid, salysilate và jasmonate Các ch t thu c nhóm polyamine và các ch t khác s đ c đ c p các

ch ng sau tu thu c vào vai trò sinh lý c a nó Nhìn chung đ ng cong đáp ng

li u l ng cho t t c nh ng ch t đi u hòa sinh tr ng th c v t đã bi t có d ng hình chuông (hình 3.1) Ch t đi u hòa sinh tr ng có tác d ng kích thích s th hi n tác

đ ng kích thích n ng đ th p và t ng d n đ n nh h ng t i đa Khi n ng đ v t qua m c kích thích t i đa s gây nh h ng c ch

gi ng nh indole-3-acetic acid (IAA) trong ho t đ ng sinh lý Auxin c ng có nh ng

nh h ng khác bên c nh s v n dài, nh ng s v n dài đ c xem là then ch t

nh t Auxin nói chung mang tính acid v i m t nhân không b o hòa ho c nh ng d n

xu t c a chúng

3.1.1 Sinh t ng h p auxin

Sau khi phát hi n ra IAA, nhi u h p ch t g c indole c ng đã đ c phát

hi n Tuy nhiên ho t tính c a nh ng ch t này đ c xem nh là s chuy n hóa c a

nó thành IAA Nói chung ng i ta ch p nh n r ng IAA đ c t ng h p t tryptophan, m t amino acid, trong h t ph n và nh ng mô sinh tr ng ho t đ ng nh

N ng đ ch t đi u hòa sinh tr ng

mô phân sinh ch i, kh i s kh i c a lá, lá non đang l n, h t đang phát tri n và trái qua con đ ng kh amin, kh carboxy và oxy hóa

CO2

N H

CH2 CH COOH

NH2

N H

CH2 CH2 NH2

NH3

N H

CH2 C COOH O

CH2 C S glucose NOSO3

2H

N H

CH2 C O H

N H

CH2 C N

H2O

N H

de ca rbox

yla se

Tryptophan transaminase

Amise oxidase

Indole pyruvate decarboxylase

Myrosinase

Indole acetaldehyde dehydrogenase

Indole ethanol

oxidase

Nitratase

Có m t h th ng các enzyme tham gia vào quá trình sinh t ng h p auxin

nh các enzyme tryptophan decarboxylase, tryptophan transaminase, amine oxidase, indole pyruvate decarboxylase, myrosinase, indole ethanol oxidase, indole acetaldehyde dyhydrogenase và nitralase Trong quá trình t ng h p auxin đ u có s tham gia c a k m Có hai con đ ng chính đ bi n đ i tryptophan thành IAA tùy theo loài th c v t (Hình 3.2) Con đ ng th nh t bi n đ i tryptophan thành indole-3-pyruvic acid b i enzyme tryptophan transaminase, k đó đ c decarboxyl hóa b i indole pyruvate decarboxylase thành indole-3-acetaldehyde (IAAld), r i

đ c bi n đ i thành IAA qua con đ ng indole acetaldehyde dehydrogenase Con

đ ng th hai liên quan đ n s decarboxyl hóa c a tryptophan thành tryptamin b i tryptophan decarboxylase, k đó đ c bi n đ i thành IAAld b i amine oxidase và

cu i cùng thành IAA b i IAAld dehydrogenase Trong m t vài loài th c v t, IAA có

th đ c t ng h p t nh ng ti n ch t khác không ph i là tryptophan d a leo, indole-3-ethanol đã đ c tìm th y và khi x lý ngo i sinh có th d n t i s t o ra

IAAld do enzyme indole ethanole oxidase Nhi u loài thu c h Cruciferae ho c

enzyme myrosinase và cu i cùng thành IAA b i enzyme nitralase M c dù có nhi u

h th ng khác nhau t n t i trong cây, tuy nhiên ph n l n ghi nh n đ c là s t ng

h p IAA t ti n ch t là tryptophan

Trung tâm t ng h p c a các auxin là các mô phân sinh, lá non, m m hoa,

h t đang phát tri n, m t l ng r t ít auxin đ c di chuy n đ n các c quan S v n chuy n này theo nhu mô, t ng t ng và có tính cách phân c c v i v n t c 5 - 15 mm/ h R t ít th y auxin v n chuy n theo chi u t d i lên và theo chi u ngang

ch t có ho t tính t ng t nh IAA, nh ng không hoàn toàn t ng t v c u trúc Auxins có th đ c chia thành 6 nhóm sau (hình 3.3):

- Nh ng d n xu t indole: Indole-3-acetic (IAA) và Indole-3-butyric acid (IBA)

- Nh ng benzoic acid: 2,3,6-trichlorobenzoic acid và 2-methoxy-3-6- dichlorobenzoic acid (Dicamba)

- Nh ng chlorophenoxyacetic acid: 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

- Picolinic acid: 4-amino-3,5,6-trichloropiconic acid (Tordon hay Pichloram)

- Nh ng naphthalene acid: α và β-naphthaleneacetic acid (α và β-NAA)

- Nh ng naphthoxyacetic acid: α và β-naphthoxyacetic acid (α và β-NOA)

N H

(IBA)

Cl

COOH Cl

Cl

OCH3 Cl

benzoic acid (dicamba)

2-methoxy-3,6-dichloro-D n xu t indole Benzoic acid

Cl Cl OCH2COOH

2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D)

CH2COOH OCH2COOH

β-Naphthalene acetic acid (β-NAA) α-Naphthoxyacetic acid

OCH2COOH

β-Naphthoxyacetic acid

N Cl

h ng m nh lên ho t tính c a auxin đ i v i nhóm phenoxy acid Do tính ch n l c

c a chúng, nh ng phenoxyacetic acid đ c bi t nh 2,4-D và 2,4,5-T đã đ c dùng

r t ph bi n đ làm thu c tr c lá r ng trong nhi u n m qua m c dù hi n nay đã

h n ch và không s d ng Nh ng ch t này c ng đã đ c dùng r t nhi u trong chi n tranh hóa h c Quinclorac là thu c c ch n l c do công ty BASF c a c s n xu t

và đ c dùng làm thu c tr c l ng v c trên ru ng lúa Nh ng h p ch t phenoxyacetic acid th ng r t b n Th t ra, ph n l n c lá r ng hai lá m m không

th phân h y nh ng h p ch t này vì v y th ng đ c dùng v i n ng đ th p Ch t

đ c màu da cam đã đ c dùng đ làm r ng lá cây trong chi n tranh Vi t Nam là

m t h n h p c a 2,4-D t do và n-butyl ester c a 2,4,5-T Trong quá trình t ng h p

c a 2,4,5-T và nh ng phenol g c chlor đã sinh ra nhi u s n ph m ph khác nh

nh ng chlorodioxin r t nguy hi m cho ng i đi n hình là 2,3,8,9-tetrachlorodibenzo-para-dioxin (hình 3.4)

O

OCl

Cl

ClCl

Hình 3.4 C u t o c a dioxin (2,3,8,9- tetrachlorodibenzo-para-dioxin)

Auxin hi n di n trong các t bào th c v t d i nhi u hình th c khác nhau: auxin t do, ti n auxin và auxin liên k t Các ph ng pháp ly trích thông th ng s thu đ c auxin t ng s (c ba lo i trên) Các hình th c trích auxin theo ki u khu ch tán th ng thu đ c auxin t do và auxin liên k t th ng k t ch t v i protein

3.1.3 Nh ng nh h ng sinh lý

Auxin liên quan đ n nhi u quá trình sinh lý trong cây Vài nh h ng quan

tr ng c a auxin đi u hòa các quá trình sinh lý c a th c v t có th k đ n nh sau:

(1) V n dài t bào: Các b c nh h ng lên s v n dài do auxin tác

đ ng có th tóm t t nh sau:

- Gi m tính ch ng ch u c a vách t bào đ i v i s c c ng i u này gây ra

do s b gãy nh ng liên k t không c ng hóa tr gi a xyloglucans và cellulose trong vách t bào

- Có m t s thay đ i v nh ng ch đ n c v i t bào Ngay c khi áp su t

th m th u trong t bào không thay đ i, th n ng n c trong t bào đ c x lý

v i auxin tr nên y u h n do s giãm th n ng áp su t

- S gi m th n ng n c cho phép n c di chuy n vào bên trong t bào và

t o ra m t áp su t v phía vách t bào có tính d o t o ra s v n dài

- Khi s v n dài hoàn t t, nh ng liên k t không c ng hóa tr gi a cellulose

và nh ng polysaccharide tái l p tr l i Quá trình này không thu n ngh ch

(2) Quang h ng đ ng: Quang h ng đ ng là s phát tri n c a m t mô

th c v t h ng v phía sáng do s đáp ng v i thông l ng tr c ti p ho c gradient Theo gi thuy t Cholodny-Went thì ánh sáng chi u t m t phía s gây ra s di chuy n c a auxin v phía t i, do đó n ng đ auxin v phía t i cao h n phía đ c chi u sáng S phân ph i auxin không đ u đ c xem là nguyên nhân gây ra s nghiêng

(3) a h ng đ ng: Là s h ng đ ng c a m t c quan th c v t đáp ng

v i tr ng l c N u m t cây đ c đ t n m ngang, ch i c a nó s nghiêng lên phía trên ng c chi u v i tr ng l c (đ a h ng đ ng âm), trái l i r s nghiêng xu ng theo chi u c a tr ng l c (đ a h ng đ ng d ng) Theo thuy t Cholodny-Went v

đ a h ng đ ng thì thân và r đáp ng v i tr ng l c tích l y IAA v phía th p h n Trong thân IAA kích thích s sinh tr ng trên m t đáy c a thân và làm cho thân nghiêng v phía trên Khi c t chóp r đi thì kh n ng đáp ng c a r đ i v i tr ng

l c b m t đi và khi đ t chóp r tr l i thì tính đ a h ng đ ng đ c ph c h i

(4) u th ch i ng n: Ch i ng n đ c bi t là nguyên nhân kh ng ch s phát tri n c a ch i bên Khi c t ch i ng n, ch i bên s phát tri n Tuy nhiên theo

th i gian, ch i bên phát tri n tr i lên và c ch s phát tri n c a nh ng ch i bên

m c sau Sau khi auxin đ c phát hi n, hàm l ng cao c a nó trong đ nh ch i c ng

đã đ c ghi nh n u th ch i ng n đã đ c ghi nh n nhi u loài th c v t và đ c

đi u khi n b i ch t đi u hòa sinh tr ng

(5) S t ng r : Julius Von Sachs (1880) cho r ng trong lá non và nh ng

ch i ho t đ ng có ch a m t ch t đi u hòa sinh tr ng có kh n ng d n truy n và kích thích s t ng r IAA c ng đã đ c bi t là ch t có kh n ng kích thích s

t ng r c a cành giâm và c ng đã cho th y kh n ng ng d ng trong th c ti n

Nh ng auxin t ng h p th ng đ c dùng thay vì IAA t nhiên vì chúng không b phân h y b i enzyme IAA oxidase hay nh ng enzyme khác và s t n t i trong mô trong m t th i gian dài Áp d ng auxin ngo i sinh có th kích thích s t ng r và

s phát tri n s m c a r , trái l i s v n dài c a r nói chung b c ch tr khi áp

d ng v i n ng đ đ nh S c ch sinh tr ng c a auxin th ng có liên quan đ n

s kích thích sinh t ng h p ethylene

(6) S s n sinh ethylene: S kích thích s n sinh ethylene gây ra do auxin

đ c ghi nh n đ u tiên trên cà chua b i Zimmerman và Wilcoxon (1935) Ngày nay, auxin đã đ c bi t là ch t đi u hòa sinh tr ng kích thích s sinh t ng h p ethylene trên nhi u loài th c v t nh đ u xanh, lúa, c l ng v c…

(7) S phát tri n trái: S gia t ng kích th c trái ch y u do s n r ng c a

t bào gây ra Auxin có liên quan đ n s n r ng c a t bào và đóng vai trò c b n trong vi c quy t đ nh s phát tri n c a trái Vai trò m nh m c a auxin trong s phát tri n c a trái g m hai y u t Th nh t là m i quan h gi a s phát tri n h t v i kích th c cu i cùng và hình d ng trái Th hai là vi c áp d ng auxin lên trái nào

đó nh ng giai đo n đ c thù c a s phát tri n s gây ra s đáp ng Ví d dâu tây,

n i phôi nh và phôi trong b qu s n xu t auxin, nó di chuy n ra ngoài và kích

thích s sinh tr ng V trí c a b qu trên trái có m t nh h ng l n đ n hình d ng trái B qu dâu tây n m bên ngoài đ hoa th t qu và d dàng tác đ ng Khi tách t t

c b qu thì trái không phát tri n Tuy nhiên, n u tách t t c b qu và áp d ng auxin lên đ hoa thì trái phát tri n bình th ng

(8) Trinh qu sinh: Là s phát tri n c a trái không qua quá trình th tinh

nh h ng c a auxin lên trinh qu sinh thì không n i b t b ng nh h ng c a gibberellin lên quá trình này

(9) S r ng: N u c t b phi n lá non thì lá s d r ng Tuy nhiên cu ng lá

s không r ng n u đ c x lý auxin nh IAA S r ng lá là do s thành l p t ng r i

và hi n t ng này b chi ph i b i auxin S r ng s gia t ng khi l ng auxin n i biên b ng ho c l n h n auxin ngo i biên X lý auxin v phía lá c a t ng r ng làm

gi m s lão hóa, v phía thân c a t ng r ng kích thích s lão hóa và gây ra s r ng

S gi m auxin n i sinh trong lá ho c các c quan khác c a cây s gây ra s r ng

Vi c x lý NAA hay 2,4 D c ng làm gi m s r ng trái

(10) S th hi n gi i tính: Vi c x lý auxin có th làm thay đ i gi i tính

c a hoa trên m t s loài cây và s thay đ i gi i tính này đ c ghi nh n có liên quan

đ n s kích thích sinh t ng h p ethylene Khi x lý auxin ngo i sinh đã làm t ng s

l ng hoa cái trên h b u bí Các nghiên c u c a Khoa Nông Nghi p, Tr ng i

H c C n Th c ng ghi nh n đ c r ng auxin ngo i sinh làm t ng s l ng hoa đ c trên chôm chôm

3.1.4 S phân h y auxin

S hi n di n hay có m t c a auxin có m t nh h ng sâu s c lên s sinh

tr ng và phát tri n c a th c v t Các d ng liên k t thu n ngh ch và b t thu n ngh ch c a auxin, enzyme oxy hóa và quang oxy hóa là nh ng y u t phân h y ho c làm b t ho t auxin Enzyme IAA oxidase đã đ c tìm th y trên nhi u loài th c v t

có kh n ng phân h y IAA S n ph m chính t o thành trong chu trình decarboxyl hóa oxy hóa là 3-methylene-oxindole Ngoài ra còn có các ch t khác nh 3-hydroxymethyl oxindole, indole-3-methanol, indole-3-aldehyde và indole-3- carboxylic acid Trong chu trình oxy hóa decarboxy hóa không hoàn toàn đ i v i IAA thì thu đ c s n ph m chính là oxindole-3-acetic acid Nhi u loài cây có enzyme IAA oxidase có th phân h y đ c IAA Các h p ch t phenoxy acetic acid

th ng r t b n và không b enzyme IAA oxidase phân h y Ph n l n cây lá r ng song t di p không th phân h y 2,4-D và 2,4,5-T Ph n l n 2,4-D và 2,4,5-T đ c dùng thông th ng là nh ng acid t do, mu i và mu i amine C n chú ý r ng nh ng acid t do r t d bay h i và phân tán

3.2 Gibberellin (GA)

CH3

CH3H H

ent-Kaurene

X ent-Kaurenol

GA3 là gibberellin đ c th ng m i hóa đ u tiên và đã đ c dùng cho m t

h th ng sinh tr c nghi m chu n Chính vì v y nó đ c xem nh là ch t đ i di n cho 136 gibberellin đã đ c phát hi n Gibberellin đ c phân l p đ u tiên t n m

th c v t nh th c v t h t kín, th c v t h t tr n, d ng x , t o nâu, t o l c, n m và vi khu n

3.2.1 Sinh t ng h p gibberellin

Nói chung ng i ta ch p nh n r ng gibberellin đ c t ng h p t mevalonic acid trong nh ng ch i non đang sinh tr ng tích c c và h t đang phát tri n Chu trình mevalonic acid không ch có liên quan đ n sinh t ng h p gibberellin mà còn liên quan đ n sinh t ng h p cytokinin, abscisic acid và brassinosteroid (hình 3.6) Sau khi mevalonic acid bi n đ i thành mevalonic acid pyrophosphate r i thành isopentenyl pyrophosphate s tách ra theo h ng t ng h p cytokinin, abscisic acid

và con đ ng khác theo các b c ti p theo đ t o thành ent-kaurene s d n đ n s thành l p các phân t gibberellin Quá trình t ng h p gibberellin có th b c ch

b i các ch t làm ch m sinh tr ng trong b c chuy n hóa t geranylgeranyl pyrophosphate thành copyl pyrophosphate Các ch t làm ch m sinh tr ng g c pyrimidine, triazole, tetcyclacis và inabenfide c ng c ch s bi n đ i t ent-kaurene thành ent-kaurenol, t ent-kaurenol thành ent-kaurenal, t ent-kaurenal

thành ent-kaurenoic acid

Quá trình sinh t ng h p gibberellin c a n m G fujikuroi và th c v t b c cao

có th chia thành 3 giai đo n chính:

- Chuy n hóa mevalonic acid thành ent-kaurene

- Chuy n hóa ent-kaurene thành gibberellin prototype, GA12-aldehyde

- Chuy n hóa GA12-aldehyde thành C20-, r i thành C19-GA v i con đ ng không 13-hydroxyl hóa và con đ ng 13-hydroxyl hóa s m các v trí khác nhau

và sau cùng thành các d ng GA khác nhau

S chuy n hóa t isopentenyl diphosphate (pyrophosphate) đ n các d ng gibberellin đ c di n t chi ti t nh trong hình 3.7

O HO

CO H H

OH

CO2H

O

H H

2 H

O CO

OH H

H

CO2H

O CO

OH HO

H H

CO2H

O CO HO

OH HO

H H

OH H

H

OH

H CO

2 H H

O CO

OH OH

CO2H

O

CO H H

CO2H CHO

CO2H

OH H

H OH

CO2H

CH2

CO H H

HO

CO2H

O

CO H H

CO2H

O

CO H H

CO2H CHO

CO2H

H H

CO2H

CH2

CO H H

CO2H

O CO HO HO

H H

CO2H

CO2H

CO2H

H H

CO2H

CO2H HO

O

H H

H 20

CO2H

O

H H

CH2OH

H H CHO

H H

CO2H

H H

H H

GA7

Copalyl diphosphate ent-Kaurene

ent-Kaurenol ent-Kaurenal

ent-Kaurenoic ent-7 α -Hydroxykaurenoic acid

GA3

GA3 GA3

LE GA4

LE GA4

CO2H

O

O

Con đ ng không 13-hydroxyl hóa

Con đ ng 13-hydroxyl hóa s m

OH

CO2H CO

CO2H

O

CO HO

OH HO

OH

CO2H CHO

CO2H

OH

CO2H CHO

OH

CO2H

CO2H

CO2H HO

HO

CO2H

O

CO HO

OH

CO2H

CH2CO O

HO

CO2H

CO2H

CO2H HO

OH

CO2H

O

CO HO

H H

H H

H H

H H

H H

H H H

H H

H H

H H

H H

H H H

H H

H H

H H

H H

H H

H H

H H H

H H

H H

H

H

H

H H

H H

H H

H H

H H H

- (F): Ch các gibberellin có ngu n g c t n m

- (P): Ch các gibberellin có ngu n g c t cây xanh

CO 2 H CO

HO

CO2H

O

CO HO

CO 2 H

O

CO HO

CO2H

O

CO HO

OH OH

CO 2 H

O

CO HO

OH O

CO 2 H CHO

CO2H

O

CO

OH HO

CO 2 H

O

CO

OH OH

CO2H

O

CO HO

HO OH

CO 2 H

O

CO HO

HO OH

CO 2 H

O

CO HO

CO2H

O

CO HO

OH OH

H

H

H H

H

H

H H

H

H

H H

H

H

H H

H H

CO2H

O

CO HO

CO2H

O

CO HO

CO 2 H

O

CO

OH HO

HO

CH 2

OH O

CO 2 H CO

O

CO 2 H CO

O HO

O

HO

CO 2 H CO

O HO

CH 2

O

OH OH

CO 2 H CO

3.2.2 Nh ng nh h ng sinh lý c a gibberellin

Gibberellin có liên quan đ n nhi u quá trình sinh lý trong cây Tuy nhiên

nh ng chi, loài v i nh ng y u t khác nhau s quy t đ nh gibberellin đ c hi u hi u

qu nh t Gibberellin nh h ng đ n nhi u quá trình sinh tr ng và phát tri n c a

th c v t nh s phát tri n thân, s n y m m c a h t, miên tr ng, tr hoa, phân hóa

gi i tính, trinh qu sinh, đ u trái và lão hóa

- nh h ng trên s phát tri n c a th c v t s ng: Các gibberellin đã bi t

đ u có kh n ng kích thích s v n dài c a thân hay s phân chia t bào S kích thích v n dài c a GA th hi n r t rõ trên nh ng cây non ho c b ph n non, cây

đã tr ng thành hay c quan đã già thì nh h ng s kém đi Nhìn chung, GA kích thích s sinh tr ng c a nhi u loài cây đ c bi t là nh ng cây lùn Khác v i auxin,

nh h ng v n dài c a GA lên th c v t s ng thì rõ h n trên các đo n m u đ c

c t Th c v t đáp ng v i các lo i gibberellin khác nhau c ng khác nhau i v i

tr c h di p rau di p, nh h ng kích thích s v n dài c a GA8 không rõ nét, nh

h ng kích thích s v n dài c a GA4, GA1 và GA3 m nh d n và GA9 l i có nh

h ng m nh h n c Trong m t vài tr ng h p thì nh h ng kích thích s v n dài tr c h di p d a leo c a gibberellin c ng kém hi u qu

- nh h ng lên tính tr ng lùn: Có nhi u bi n d thi u sinh t ng h p GA

đã đ c phát hi n ây là tính tr ng đ n gene, kích th c c a cây bi n d có th ch

b ng m t ph n n m cây bình th ng và s lùn ch y u là do lóng b ng n l i Các

d ng đ t bi n lùn nh đ t bi n b p lùn (Zea mays L.) d1 và d5 và lúa lùn (Oryza

là GA1 Vi c x lý GA ngo i sinh làm cho các cây này cao tr l i bình th ng

C ng có nh ng d ng đ t bi n lùn không đáp ng v i vi c áp d ng gibberellin ngo i sinh và cây v n lùn sau khi x lý

bi t là nh ng ch t có kh n ng kích thích n y m m và phá v miên tr ng trên nhi u

lo i cây tr ng GA có th kích thích ho t đ ng c a các enzyme th y phân hydrolase trong h t ng c c GA ngo i sinh tác đ ng lên l p aleurone c a h t ng c c và kích thích s s n sinh enzyme α-amylase đ tác đ ng lên s phân h y tinh b t thành

đ ng đ n Tác đ ng này có tác d ng kích thích n y m m và phá v miên tr ng Khoai tây có th n y m m s m khi x lý v i GA3 GA c ng có th kích thích s n y

m m c a h t rau di p mà không c n x lý ánh sáng đ GA c ng có th thay th

đi u ki n nhi t đ th p ho c ngày dài đ phá v miên tr ng

- nh h ng lên s tr hoa: Gibberellin có kh n ng thúc đ y quá trình tr