Pha môi trường để thực hiệ n vi ệc phân lập , nhân gi ống , giũ gi ống vi sinh vật, đồng th ời để nuôi cấy v à nghiên c ứu các đặc điểm sinh học của chúng.. Nguyên t ắc pha môi trường?[r]
(1)BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI GIẢNG
THỰC TẬP
VI SINH ĐẠI CƯƠNG Biên soạn: ThS LÊ THỊ VU LAN
KS PHẠM MINH NHỰT
(2)-NỘI DUNG THỰC HÀNH
-Bài số 1: Các quy tắc an toàn phịng thí nghiệm vi sinh vật
Bài số 2: Các thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh cácphương pháp khử trùng Bài số 3: Thựchành pha môi trường dinh dưỡng
Bài số4: Phân lập – Nuôi cấy – Bảo quản vi sinh vật
(3)BÀI SỐ 1: CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
-Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh nên cần luôn cẩn thận với tất chủng thao tác Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có acid hóa chất có độc tính Do vậy, cần tuân thủ số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho thân cho người khác phịng thí nghiệm sau:
- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật
- Khơng ăn uống, hút thuốc phịng kiểm nghiệm Mang trang thao tác với vi sinh vật
- Mặc áo blouse thời gian làm việc
- Trước bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn giấy lau tẩm cồn 700 dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô Thực tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn đèn Bunsen tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng sau hồn thành cơng việc - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất hộp petri, ống
nghiệm mơi trường, bình nuôi cấy
- Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau thực khử trùng lại bàn làm việc
- Cẩn thận thao tác với đèn cồn đèn Bunsen Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua lửa Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút
bằng miệng
- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất mảnh vỡ vào túi rác riêng
- Tách riêng chất thải rắn chất thải lỏng
(4)vật cần ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước rửa tái sử dụng
- Cần gói ràng băng keo đặt chồng đĩa petri lên
- Không mở hộp petri dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp
- Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng đầu que cấy vào chân lửa để tránh văng nhiễm vi sinh vật vào không khí
(5)BÀI SỐ 2: CÁC THIẾT BỊ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG
-I MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU
1 Kiến thức lý thuyết: Củng cố kiến thức sau:
- Ảnh hưởng nhân tố vật lý, hóa học tồn phát triển vi sinh vật
+ Nhân tố vật lý bao gồm:nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH + Nhân tố hóa học bao gồm: acid, base, muối kim loại, cồn
- Nguyên nhân gây nhiễm dụng cụ tiếp xúc với khơng khí, dụng cụ hay vật phẩm có vi sinh vật
2 Kỹ thực hành: Hình thành rèn luyện kỹ năng: - Bao gói dụng cụvà làm nút bơng choống nghiệm
- Khử trùng dụng cụ môi trường nồi hấp áp suất cao tủ sấy II MỘT SỐDỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH
1 Các dụng cụ thủy tinh
a. Ống nghiệm: sử dụng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút gịn khơng thấm nước hay nhựa chịu nhiệt
Hình 1:Ồng nghiệm
b. Đĩa petri: gồm nắp lớn đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm, 12cm
Hình 2:Đĩa petri
Nút gịn
(6)c. Ống hút (pipette) - Ống hút có chia độ - Ống hút Pasteur
Nếu khơng có sẵn pipette Pasteur ta chế tạo từ ống thủy tinh đường kính 7mm, dài khoảng 25cm với đầu đốt trịn cạnh nhét gịn khơng thấm nước Để khoảng ống thủy tinh đẻn cồn, xoay thủy tinh chảy ra, mang khỏi lửa kéo tay ta có pipette Pasteur
Hình 3: Cách làm pipette Pasteur
d Micropipettes (Pipetman)
Đây pipet xác, cho phép ta hút lượng chất xác
Hình 4: Micropipette
e Các dụng cụ thủy tinh khác - Becher
- Bình cầu đáy đáy trịn - Bình tam giác (Erlen)
Gịn khơng thấm nước
Đèn cồn
(7)a Dây cấy
- Dây cấy thẳng: sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh vật môi trường đặc - Dây cấy vòng: dùng cấy ria vi sinh vật trên mặt thạch hay phân lập vi sinh
vật môi trường lỏng môi trường đặc
- Dây cấy thước thợ: dùng để cấy loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn
Những loại dây cấy thường làm kim loại khơng bị oxy hóa nhiệt độ cao b Tủ ấm:dùng để ủ vi sinh vật theo dõi tăng trưởng vi sinh vật
Hình 5: Tủ ấm
c Lị Pasteur (xem phần sau) d Autoclave (xem phần sau)
e Nồi chưng cách thủy III. BAO GÓI DỤNG CỤ
1 Nguyên tắc
- Dụng cụ bao gói phải đảm bảo khơ
- Bao gói phải kín cẩn thận để saukhi khử trùng đảm bảo vô trùng dụng cụ lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng
2. Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm khâu:
- Làm nút bông: cho cácống nghiệm, bình tam giác, pipet, que trang - Bao gói: cho hầu hết dụng cụkhác
a Cách làm nút bông
- Với ống nghiệm:
Lấy bơng khơng thấm nước cuộn lại
Dùng que treấn vào cuộn
Đẩy cuộn gập đôi từ từ vào miệng ống nghiệm
(8) Nút có kích thước độ chặt vừa phải
Đầu nút trịn, gọn, phần ngồi lớn phần
Lấy nút hay đóng vào dễ dàng
- Với chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự sử dụng lượng nhiều
- Với pipet: dùng sợi dây thép nhỏ nhét bơng vào đầu lớn pipet để hạn chế khơng khí từ miệng người hút vào pipet
b Cách bao gói dụng cụ
Với dụng cụ sau làm nút cần bao gói phần có nút bơng giấy báo để khử trùng nút không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt Cách làm sau:
- Cắt đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói
- Quấn quanh phần đầu có nút - Cột lại thật chặt
Yêu cầu:
- Phần giấy bao bên ngồi phải chặt kín - Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
- Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt
Với dụng cụ pipet, que trang phải dùng giấy bao kín tồn Có thể dùng hộp nhơm để đựng dụng cụ để khử trùng
IV.CÁC PHƯƠNG PHÁPKHỬ TRÙNG DỤNG CỤ
1 Nguyên tắc
- Sau khử trùng cần đảm bảo:
Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ vật phẩm
Khônglàm thay đổi chất lượng mẫu vật - Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho người 2. Các phương pháp khử trùng
(9)- Số lượng tế bào
- Độ pH vật cần khử trùng
Do để khử trùng nhiệt hiệu cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp khoảng thời gian ngắn cần thiết để tiêu diệt tồn VSV bào tử chúng có dụng cụ cần khử trùng
Có thể khử trùng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt
a.Phương pháp nhiệt khô
Khử trùng tủ sấy
- Được thực tủ sấy - Cách tiến hành:
Đặt dụng cụ đãđược bao gói vào tủ sấy
Bật công tắc tủ hoạt động
Điều chỉnh thời gian nhiệt độ thích hợp (1600C 2h 1800C 30 phút)
Tắt tủ sấy, để nguội tới 600C mở tủ lấy dụng cụ Tránh mở tủ lấy dụng cụ nhiệt độ tủ cao làm dụng cụ thủy tinh dễ vỡ
Các dụng cụ sau sấy mà giấy bao có màu vàng đạt yêu cầu Nếu giấy bao có màu nâu chứng tỏ nhiệt độ khử trùng cao làm giấy biến thành gondron (hợp chất có tính sát trùng) khơng thể sử dụng dụng để nuôi cấy VSV
Khử trùng cách đốt que lửa nóng đỏ:
- Phương pháp dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau lấy nút
- Cách khử trùng:
Hơ dụng cụ lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến – lần Với dây mayxoở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy
Đợi dụng cụ nguội sử dụng để tránh vỡ vi khuẩn không bị tiêu diệt lấy giống
b Khử trùng bằng sức nóng ướt
Đun sơi nước
(10)Cách tiến hành:
- Dùng nước đổ ngập dụng cụ - Đun sôi từ 10 phút đến 1h
Đun cách thủy nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur)
Phương pháp dùng để khử trùng nhanh thực phẩm dễ biến tính nhiệt độ cao
Cách tiến hành:
- Đun nóng mơi trường lên 65– 700C 15– 30 phút Phương pháp có tác dụng ức chế VSV khơng có bào tử
Hấp cách quãng 1000C (phương pháp Tyndal)
Phương pháp dùng để khử trùng số loại môi trường ni cấy men bánh mì, men gia súc, mốc làm nước chấm
Cách khử trùng:
- Hấp trường 1000C từ 30 – 40 phút
- Lấy để tủ ấm 24 bào tử vi khuẩn phát triển
- Hấp môi trường lần thứ hai 1000C 30 – 40 phút tiêu diệt bào tử vừa nẩy mầm
- Lặp lại trình 3– lần
Kết quả: môi trường vừa khử trùng vừa đảm bảo không thay đổi chất lượng
Khử trùng nước bão hòa áp suất cao (Autoclave) Phương pháp thực nồi hấp vô
trùng áp suất cao Đó thiết bị làm kim loại có tính chịu nhiệt cao có khả tự động điều chỉnh nhiệt độ thời gian
Nguyên tắc hoạt động
- Làm tăng nhiệt để khử trùng vật nước áp suất lớn áp suất khí Khi áp suất tăng làm nhiệt độ tăng nhờ hệ thống van chặt chẽ
(11)- Mối quan hệ áp suất nhiệt độ nồi biểu qua bảng sau: Áp suất (atm) Nhiệt độ (0C)
0 0,5 1,0 1,5 2,0
100 112 121 128 134
Cách sử dụng:
- Chuẩn bị dụng cụ chứa môi trường cần khử trùng
- Cho 3l nướccấtvào nồi hấp kiểm tra mức nước cho phù hợp - Lần lượt đưa dụng cụ, mơi trường cần hấp vào bên nồi - Đóng chặt nồi hấp
- Điều chỉnh kim đồng hồ thời gian áp suất vị trí mong muốn - Cắm phích điện
- Bật cơng tắc khử trùng nồi hấp để tiến hành hấp - Khi kết thúc q trình hấp, nồi báo hiệu cịi - Gạt cơng tắc khử trùng vị trí “dry”
- Chờ kim áp suất trở mở nắp nồi lấy dụng cụ - Rút phích điện
- Ghi nhãn ngày - tháng– năm vào dụng cụ sau khử trùng
CHÚ Ý: Để đảm bảo an toàn hiệu việc khử trùng, người thực cần phải:
- Kiểm tra lại nồi hấp trước sử dụng - Thực quy trình hướng dẫn
- Tránh cung cấp điện đột ngột để không gây vỡ dụng cụ, nguyên liệu gây nổ nguy hiểm
- Trực dõi trình khử trùng kết thúc ngắt điện - Định kỳ kiểm tra chất lượng đồng hồ áp kế van an toàn
(12)c Khử trùng bằng lọc
Sử dụng cho mơi trường lỏng, trong, có độ nhầy yếu, không chịu nhiệt độ cao 600C Cho mơi trường qua màng lọc xốp có đường kính lỗ nhỏ đường kính vi khuẩn Khi đó, vi khuẩn bị giữ lại màng lọc cịn dung dịch qua vơ trùng Màng lọc thường màng cellulose
d Diệt trùng bằng xạ
Tia tử ngoại: Bức xạ thường dùng tia UV Dòng tia UV diệt trùng khơng khí phịng bệnh viện, phịng vơ trùng Tia UV khử trùng bề mặt mà không thấm sâu vào bên mẫu vật
Tia âm cực: Diệt trùng dụng cụ giải phẩu, thuốc, thực phẩm, tia âm cực tiêu diệt vật cho vào bao gói kín
CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP
1 Thực hành bao gói loại dụng cụ?
(13)BÀI SỐ 3: CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
-I MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU
1 Kiếnthức lý thuyết: Củng cố hình thành kiến thức sau: - Khái niệm môi trường dinh dưỡng
- Yêu cầu môi trường dinh dưỡng - Cơ sở phân loại môi trường dinh dưỡng
- Nguyên tắc việc chế tạo môi trường dinh dưỡng 2 Kỹ thực hành
- Kỹ sử dụng dụng cụ: cân phân tích, ống đong, pipet, autoclave, tủ ấm - Cân đong, pha chế hóa chất
- Làm môitrường
- Điều chỉnh pH khử trùng môi trường - Kiểm tra kết khử trùng
- Bảo quản môi trường
II HÓA CHẤT – NGUYÊN LIỆU – DỤNG CỤ
1 Hóa chất – nguyên liệu
Tùy theo yêu cầu điều kiện thực tế PTN mà ta chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất số loại môi trường để SV thực hành
2 Dụng cụ
- Ống nghiệm - Giá để ống nghiệm - Đĩa petri
- Bình tam giác 250 ml - Cốc thủy tinh 250 ml - Pipet loại
- Ống đong - Phểu thủy tinh
- Giấy lọc, giấy bao gói
- Bơng khơng thấm nước, y tế - Đèn cồn
(14)1 Khái niệm môi trường dinh dưỡng
- Các chất dinh dưỡng hợp chất tham gia vào q trình traođổi chất nội bào
- Mơi trường dinh dưỡng hỗn hợp chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxy hóa khử, áp suất thẩm thấucủa tế bào ổn định pH môi trường
2 Các yêu cầu môi trường dinh dưỡng
- Có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết - Có độ pH thích hợp
- Có độ nhớt định
- Không chứa yếu tố độc hại - Tuyệt đối vô trùng
3 Phân loại môi trường dinh dưỡng
Người ta dựa sở khác để phân loại môi trường
a. Căn theo thành phần và nguồn gốc: gồm loại
- Môi trường tự nhiên: có thành phần sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám Thành phần hóa học loại mơi trường khơng xác định xác khơng ổn định sản phẩm tự nhiên
- Môi trường tổng hợp: chứa chất hóa học mà thành phần chúng xác định định lượng cách cụ thể xác
- Mơi trường bán tổng hợp: chứa chất hóa học lẫn sản phẩm tự nhiên
b. Căn theo tính chất lý học: gồm loại
- Môi trường lỏng: thành phần môi trường không chứa agar thường sử dụng để nghiên cứu trình tổng hợp vi sinh vật
- Môi trường đặc: môi trường chứa 1,5 – 2% agar 10 – 20% gelatin Môi trường sử dụng để nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý vi sinh vật
- Môi trường bán lỏng: chứa 0,3 – 0,7% agar
c. Căn vào công dụng: gồm loại sau:
(15)- Môi trường kiểm định: môi trường cho phép phân biệt số đặc điểm số loài vi khuẩn xác định Thông thường, người ta cho vào môi trường chất thị màu để tạo màu đặc trưng
4. Phương pháp pha môi trường
Pha môi trường để thực việc phân lập, nhân giống,giũ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng
a Nguyên tắc pha môi trường
- Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hóa chất dinh dưỡng loài vi sinh vật
- Để đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ nồng độ cácchất thành phần môi trường dinh dưỡng
- Đảm bảo điều kiện hóa, lý cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật
b. Các bước pha môi trường dinh dưỡng
Pha chế
Cân, đong thật xác thành phần mơi trường pha chế theo trình tự hướng dẫn tài liệu
- Môi trường lỏng: cân, đong chất cho vào nước - Môi trường đặc:
Cân thành phần môi trường cho vào nước cất
Cân agar cho vào dung dịch
Làm môi trường
Việc làm môi trường giúp ta dễ dàng quan sát phát triển vi sinh vật
- Với môi trường lỏng: tiến hành lọcbằng vải thưa giấy lọc
- Với môi trường đặc: thường lọc qua vải lớp giấy lọc điều kiện có phễu lọc nóng
Điều chỉnh độ pH môi trường
- Dùng HCl 10% NaOH 10% để điều chỉnh pH
- Muốn kiểm tra độ pH, ta sử dụng máy đo pH nhạy cho độ xác cao Nếu khơng sử dụng giấy quỳ để đo pH khơng có độ xác cao
(16)Người ta thường phân phối môi trường vào đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác Trình tự phân phối sau:
- Đun cho môi trường hóa lỏng
- Một tay giữ dụng cụ chứa mơi trường - Tay cịn lại kẹp nút bơng kéo
- Nhanh tay đổ môi trường vào dụng cụ đậy nút lại - Chú ý:
Đối với ống nghiệm: Nếu môi trường làm thạch nghiêng lượng mơi trường cần phân phối chiếm 1/4 thể tích ống nghiệm Nếu làm thạch đứng lượng mơi trường phân phối chiếm 1/2- 1/3 thể tích ống nghiệm
Đối với bình cầu hay bình tam giác : lượng mơi trường phân phối chiếm 1/2 - 2/3 thể tích bình
Các thao tác phân phối phải nhanh gọn, khéo léo để mơi trường khơng dính vào miệng dụng cụ nút việc phân phối cần thực xong trước môi trường bị đông đặc
Khử trùng mơi trường
Tùy theo tính chất điều kiện cụ thể loại môi trường mà có chế độ phương pháp khử trùng khác
Các phương pháp khử trùng thường sử dụng là: - Phương pháp Pasteur
- Phương pháp Tyndal
- Phương pháp lọc dụng cụ lọc vi khuẩn
- Phương pháp hấp nước bão hòaở áp suất cao
Đối với dụng cụ chịu nhiệt (sứ, vải, thủy tinh) khử trùng 1,5 atm / 20 – 30 phút
Đối với dụng cụ chứa 1l mơi trường trở lên hấp atm / 30 phút
Với loại mơi trường chứa đường dễ biến tính nhiệt độ cao hấp khử trùngở 0,5 –0,6 atm / 15 phút
Làm thạch nghiêng, thạch đứng đổ thạch vào đĩa petri
(17)- Đặt ống nghiệm có mơi trường lên giá đặt nghiêng không để môi trường chạm vào nút
- Để yên môi trường đông đặc Yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn liên tục
Làm thạch đứng: Đặt ống nghiệm có mơi trường thạch đứng vào giá, để yên cho môi trường đông đặc
Đổ môi trường vào đĩa petri: Tồn q trìnhđổ thạch vào đĩa petri thực tủ cấy vô trùng gồm thao tác sau:
- Mở bao giấy gói đĩa petri
- Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường
- Tay cịn lại mở nút bơng hơ miệng bình lửa đền cồn - Mở nắp đĩa petri Nghiêng bình rót mơi trường vào đĩa petri
- Đậy nắp đĩa lại, xoay trịnđĩa để mơi trường phân phối bên đĩa
- Để yên cho môi trường đông đặc - Lật ngược đĩa lại bảo quản CHÚ Ý:
- Thao tác đổ môi trường phải nhanh khéo léo để hạn chế nhiễm khuẩn - Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm Thơng thường khoảng 200 ml môi trường phân phối từ 22 – 25 đĩa
- Sau phân phối môi trường vào đĩa petri, kiểm tra lại xem mơi trường có bị nhiễm khuẩn sau – ngày
- Ghi môi trường (tên môi trường, ngày khử trùng, hạn sử dụng)
Bảo quản kiểm tra môi trường
- Môi trường chưa sử dụng bảo quản chỗ mát (0 – 50C) không để môi trường bị khô
- Trước sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn môi trường, người ta thường đặt vào tủ ấm 37oC khoảng thời gian định Loại bỏ môi trường bị nhiễm khuẩn sử dụng môi trường đạt yêu cầu
IV CÔNG THỨC VÀ CÁCH PHA MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG THÔNG
DỤNG
(18)Công thức:
- Cao thịt: 5g
- Pepton: 10g
- Nước cất: 1000ml
Cách pha mơi trường ni cấy:
- Cân xác cho thành phần môi trường vào cốc chứa sẵn nước
- Khuấy cho tan hết thêm lượng nước theo yêu cầu - Đun lên cho tan hoàn toàn
- Để nguội lắng dung dịch vừa đun - Lọc vải hay giấy lọc
- Phân phối môi trường vào dụng cụ để khử trùng Môi trường nuôi cấy nấm men (Hansen)
Công thức:
- Saccharose Maltose: 50g
- Pepton: 10g
- KH2PO4: 3g
- MgSO4: 3– g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1000ml
Cách pha chế mơi trường ni cấy:
- Cân xác cho thành phần môi trường vào cốc chứa sẵn nước
- Khuấy cho tan hết thêm lượng nước theo yêu cầu - Đun lên cho tan hoàn toàn
- Để nguội lắng dung dịch vừa đun - Lọc vải hay giấy lọc
- Phân phối môi trường vào dụng cụ để khử trùng Môi trường nuôi cấy nấm mốc (môi trường Czapek)
(19)- MgSO4: 0,5g - FeSO4: 0,01g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1000ml pH = 6, khử trùng 1atm/30 phút
4 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (môi trường Gauze 1) - Tinh bột tan: 20g
- K2HPO4: 0,5g - MgSO4.7H2O: 0,5g
- KNO3: 1,0g
- NaCl: 0,5g
- FeSO4: 0,01g
- Agar: 20g
- Nước cất: 1000ml
pH = 7,2– 7,4 khử trùng 0,5 atm/30 phút
V CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG
1 Nguyên tắc khử trùng
Khử trùng môi trường dinh dưỡng nhằm mục đích:
- Tiêu diệt tồn vi sinh vật ngoại lai diện môi trường
- Tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết phân lập, ni cấy xác Do đó, khử trùngmơi trường phải đảm bảo số điều kiện sau:
- Khơng làm biến tính mơi trường, khơng làm biến tính số chất môi trường
- Sau khử trùng, môi trường không sản sinh chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy
- Phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khử trùng - Bảo đảm an toàn người sử dụng
2 Một số phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng
Phương pháp khử trùng sử dụng chủ yếu để khử trùng môi trường autoclave Tuy nhiên, tùy loại mơi trường khác có điều kiện khử trùng khác
(20)- Đối với môi trường chứa sữa: không khử trùng 1000C nhiệt độ cao sữa dễ bị biến tính Do đó, loại mơi trường này, ta tách làm phần:sữa tiến hành trùng Pasteur, thành phần khác khử trùng autoclave Sau đó, hịa trộn thành phần với
- Đối với số mơi trường chứa số chất dễ bị phân hủy nhiệt độ cao urea tự pha chế chia phần để khử trùng cịn mơi trường tổng hợp ta khử trùng cách sử dụng màng lọc có kích thước lỗ nhỏ (0,45m) để lọc khử trùng
b. Môi trường thơng thường
Tiến hành khử trùng bình thường với điều kiện thời gian nhiệt độ khuyến cáo cho loại môi trường
CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP
1 Trình bày nguyên tắc việc pha môi trường dinh dưỡng? Các bước pha mơi trường dinh dưỡng?
3 Mỗi nhóm sinh viên thực hành loại môi trường
4 Mỗi nhóm SV thực hành khử trùng loại vừa pha autoclave phân phối vàoống nghiệm, đĩaPetri
(21)BÀI SỐ 4: PHÂN LẬP – NUÔI CẤY – BẢO QUẢN VI SINH VẬT
-1 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA BÀI
1 Kiến thức lý thuyết
- Ý nghĩa việc phân lập, nuôi cấy bảo quản vi sinh vật công tác nghiên cứu vi sinh vật học
- Các nguyên tắc trình phân lập – ni cấy – bảo quản vi sinh vật 2 Kỹ thực hành
- Kỹ phân lập vi sinh vật hiếu khí
Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật
Tạo khuẩn lạc riêng rẽ môi trường đĩa petri để cấy chuyển
Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập - Kỹ nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí
Các thao tác cấy chuyển từ ống giống sang loại môi trường: thạch nghiêng, thạch đứng, thạch đĩa
Các kiểu cấy khác kiểu môi trường - Kỹ bảo quản chủng vi sinh vật khiết
Bảo quản môi trường thạch
Bảo quản cát, hạt
Bảo quản phương pháp đơng khơ 2 HĨA CHẤT – NGUN LIỆU – DỤNG CỤ
1 Hóa chất, nguyên liệu
- Môi trường thạch đứng, thạch đĩa, thạch nghiêng để ni cấy vi sinh vật hiếu khí
- Cácống giống nấm men, nấm mốc - Đất vườn, cát, lúa
2 Dụng cụ
- Que cấy đầu tròn,đầu nhọn, hình thước thợ - Que trang,ống hút chia độ 1ml
- Ống nghiệm, giá để ống nghiệm, đĩa petri - Đèn cồn, diêm quẹt
(22)1 Nguyên tắc
Pha loãng mẫu công đoạn quan trọng q trình phân tích vi sinh vật Việc pha lỗng mẫu nồng độ thích hợp giúp ích nhiều q trìnhđịnh lượng phân tích vi sinh vật
2. Phương pháp
- Đối với mẫu chất lỏng: dùng pipet hút ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha lỗng, ta nồng độ pha lỗng 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1ml cho vàoống nghiệm chứa ml dung dịch pha loãng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục đến nồng độ cần thiết
- Đối với mẫu rắn:cân xác 10 g mẫu, sau cho vào 90 ml dung dịch pha loãng nồng độ pha loãng 10-1 Và tiếp tục pha loãng tương tự mẫu nước
Hình 7: Phương pháp pha lỗng 4. PHÂN LẬP VI SINH VẬT
1 Nguyên tắc
- Tách rời tế bào vi sinh vật
- Nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ 2 Quá trình phân lập vi sinh vật dạng khiết: gồm bước:
- Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu - Phân lập vi sinh vật khiết
- Kiểm tra độ tinh khiếtcủa vi sinh vật
a Tạo khuẩn lạc riêng rẽ môi trường phân lập
(23)Sau thực mẫu dạng lỏng:
Tiếp tục pha loãngở nồng độ cần thiết
Cấy mẫu môi trường đặc trưng
- Chú ý: khơng có mơi trường đặc trưng sử dụng mơi trường mà vi sinh vật phát triển bình thường có bổ sung chất ức chế vi sinh vật khác phát triển
b Phân lập vi sinh vật trênmôi trường thạch đĩa petri
Đối với vi sinh vật hiếu khí
- Hút 0,1 ml dịch mẫu pha lỗng cho vàođĩa petri có mơi trường thích hợp - Dùng que trang trải mẫu khắp mặt thạch
- Tiếp tục sử dụng que trang để trải khắp mặt thạch đĩa thứ 2, thứ - Ủ đĩa nhiệt độ thích hợp khoảng thời gian định ta thu khuẩn lạc riêng rẽ
c Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập
Kiểm tra vết cấy
Quan sát sinh trưởng vi sinh vật môi trường thạch
- Nếu vết cấy có bề mặt màu sắc đồng đều, chứng tỏ giống phân lập tinh khiết giữ lại
- Nếu vết cấy khơng loại bỏ
Kiểm tra độ khuẩn lạc
- Chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường thạch nghiêng
- Tách khuẩn lạc ra, hòa tan pha loãngở nồng độ cần thiết nước cất vô trùng
- Nhỏ giọt dịch vào đĩa petri có mơi trường
- Dùng que trang trải dịchkhắp mặt đĩa petri thứ nhất, đĩa thứ 2, thứ - Ủ đĩa petri nhiệt độ thời gian thích hợp
- Sau quan sát khuẩn lạc riêng rẽ Sự khiết khuẩn lạc biểu khiết giống
3 Phân lập số vi sinh vật thực tế
a Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis - Cỏ khơ cắt nhỏ cho vào bình tam giác
(24)- Đunsôi 15 phút để diệt tế bào sinh dưỡng tế bào không sinh bào tử - Đậy nút để tủ ấm 25 – 260C vòng 48– 72h
- Kết quả:
Xuất lớp váng xám có nhiều vi khuẩn B.subtilis cỏ khơ xuất bào tử vi khuẩn
Trên kính hiển vi: Tế bào vi khuẩn B.subtilis có hình que, dài, bào tử hình ovan nằmởxa tâm hay gần tâm khuẩn lạc Tế bào có kích thước – x 0,6m
Hình 8: Tế bào vi khuẩnBacillus subtilis quan sát kính hiển vi
b Phân lập nấm mốcAspergillus oryzae, Aspergillus niger Mucor
- Có thể phân lập nấm mốc cơm nguội, xơi làm mốc tương, bánh mìđể khơ ngày
- Thông qua màu sắc mốc nhận diện:
Mốc có màu trắng:Mucor hoặc Rhizopus
Mốc có màu đen:Aspergillus niger
Mốc có màu xanh lục:Penicillum italicum
(25)c Thu nhận nấm men
- Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ môi trường như:
Bề mặt trái dịch ép số trái táo, lê, nho, dâu
Trong rượu nếp, bánh men rượu, bia, nước mía để vài hơm, hạt kefir
- Dưới kính hiển vi, nấm men có dạng hình cầu hay hình trứng Tế bào có kích thước lớn, có khả nẩy chồi Khuẩn lạc có màu trắng sữa
- Chọn khuẩn lạc nấm men riêng rẽ cấy vào môi trườngthích hợp (mơi trường Hansen)
(a) (b)
Hình 10: Nấm menSaccharomyces cerevisiae kính hiển vi quang học (a) và kính hiển vi điện tử (b)
d Thu nhận xạ khuẩn
- Có thể thu nhận xạ khuẩn dễ dàng từ đất, nước, chất động vật, thực vật sửdụng môi trường Gauze để phân lập
- Phân biệt xạ khuẩn môi trường Gauze 1: Khuẩn lạc vi khuẩn nhầy, ướt
Khuẩn lạc vi khuẩn xốp, có dạng sợi
- Sau cấy 0,1 ml dịch mẫu đất vào môi trường, cần ý: nuôi tủ ấm (280C) từ – 15 ngày lấy chọn khuẩn lạc riêng rẽ để cấy chuyển
(26)5. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT
1 Khái niệm
Q trình ni cấy vi sinh vật gồm khâu: nuôi cấy
- Ni: q trình đảm bảo trì điều kiện thuận lợi cho hoạt động phát triển vi sinh vật
- Cấy: thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường sống sang môi trường thuận lợi cho phát triển chúng
Hai khâu gắn bó với q trình nghiên cứu vàứng dụng vi sinh vật 2 Mục đích
- Phát có mặt vi sinh vật nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu
- Tiến hành nhân giống vi sinh vật cách nhanhchóng - Bảo tồn giống khiết
- Nghiên cứu đặc tính sinh học hệ thống sinh học chúng 3 Nguyên tắc
- Mọi thao tác nuôi cấy phải thực điều kiện vô trùng để tránh nhiễm khuẩn
- Môi trường dụng cụ nuôi cấy phải khử trùng - Duy trì cácđiều kiện thuận lợi để vi sinh vật phát triển 4. Các phương pháp cấy
(27)- Dán nhãn ghi: tên giống vi sinh vật + ngày cấy
- Một tay cầm ống nghiệm: ống giống 1ống môi trường
- Tay lại cầm que cấy đốt đỏ dây cấy lửa đèn cồn để khử trùng - Dùng ngón út ngón áp út rút nút bơng ống giống
- Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm
- Đợi que cấy nguội, đưa que cấy vàoống nghiệm lấy khuẩn lạc ống giống - Rút que cấy tiến hành cấy chuyển ống môi trường
- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm đậy nút bơng - Khử trùng lại que cấy sau sử dụng xong
CHÚ Ý:
- Nếu ống giống canh trường dùng pipet hút canh trường thay cho que cấy - Thao tác khử trùngống hút đầu nhỏ ống hút sau tháo giấy bao
gói
- Sau sử dụng, cắm ống hút vào cồn 70% để khử trùng b/ Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
Phương pháp để cấy chuyển cácvi sinh vật hiếu khi:
- Sử dụng que cấy vòng tiến hành thao tác theo trình tự nêu - Thực việc cấy giống vàoống thạch nghiêng thao tác tiếp theo:
Hòa giống đầu que cấy vào giọt nước đáy ống nghiệm
Nhẹ nhàng lướt que cấy mặt thạch theo kiểu: hình chữ chi, vòng xoắn, vạch ngang song song
c. Phương pháp cấy trên thạch đứng: dùng để cấy vi sinh vật kỵ khí - Sử dụng que cấy hình kim
- Sau lấy sinh khối, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch Đâm sát đáy ống nghiệm đâm thành đường: đường đường sát thànhống - Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường
d. Phương pháp cấy đĩa petri
(28)Hình 12: Phương pháp cấy chuyển từ mơi trường lỏng sang môi trường thạch
- Để đĩa petri lên bàn
- Dùng que cấy lấy sinh khối vi sinh vật - Mở nắp đĩa petri đủ que cấy vào
- Nhẹ nhàng nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo kiểu sau Theo hình chữ chi tồn mặt thạch
(29)- Cách 1:
Trộn dịch cấy vào thạch cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có môi trường thạch nhiệt độ 500
C
Đậy nút lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối môi trường
Đổ thạch vào đĩa petri khử trùng Xoay trònđĩa để thạch phân bố mặt đĩa
Để yên cho môi trường đông đặc vàủ nhiệt độ thích hợp - Cách 2:
Hút 0,1 ml dịch cần nghiên cứu cho vào đĩa petri có môi trường đặc Dùng que trang trải khắp mặt đĩa
Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp
e Kết việc ni cấy
Sau nuôi cấy nhiệt độ thời gian thích hợp cho loại vi sinh vật ta thấy:
- Trong môi trường lỏng: vi khuẩn phát triển làm đục môi trường - Trong môi trường rắn thạch nghiêng:
Nấm men, vi khuẩn phát triển tạo vệt thạch hay trắng đục
Nấm mốc tạo nên sợi mảnh từ vết cấy
6 BẢO QUẢN CHỦNG VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT
1 Nguyên tắc
- Đảm bảo tốt điều kiện trình bảo quản để khơng làm thay đổi phẩm chất ban đầu giống
- Làm chậm trình trao đổi chất hô hấp vi sinh vật đồng thời ngăn cản trình sinh sản chúng
2. Các phương pháp bảo quản
a. Phương pháp cấy chuyển định kỳ môi trường mới Phương pháp áp dụng để bảo quản tất loại vi sinh vật - Với nấm men, vi khuẩn: cấy chuyển sau 1– tháng
- Với nấm mốc: cấy chuyển sau – tháng
(30)- Ưu điểm: phương pháp đơn giản, dễ làm, thời gian bảo không lâu - Nhược điểm: Tốn môi trường, công sức, thời gian Phẩm chất ban đầu giống bị thay đổi nhiều nguyên nhân khó xác định cụ thể trình cấy chuyển
b. Phương pháp giữ giống đất, cát, hạt
Trên đất, cát: bảo quản bào tử tiềm sinh (bào tủ vơ tính) thời gian bảo quản hoặcnhiều năm
Cách bảo quản:
- Đất, cát đem rây để lấy hạt ngâm HCl hay H2SO4 đậm đặc – 12h để loại bỏ acid hữu cát
- Rửa kỹ vòi nước pH trung tính - Sấy khơ giữ điều kiện vô trùng
- Đổ đầy cát vàoống nghiệm chứa vi sinh vật phát triển môi trường thạch lắc thật
- Rót tồn cát vi sinh vật vào ống nghiệm khác - Hàn kín miệng ống nghiệm giữ lâu
Trên hạt: bảo quản chủng có dạng sợi dạng sinh bào tử không Thời gian bảo quản đạt năm
Cách bảo quản:
- Hạt ngũ cốc rửa - Nấu cho hạt vừa nứt, để nước
- Cho hạt ngũ cốc vào cácống nghiệm
- Phủ mặt hạt lớp thấm nước nấu hạt ngũ cốc - Cấy giống vi sinh vật lớp cho mọc thật đầy
- Giữ nhiệt độ 15 – 200C
c. Phương pháp đông khô
- Phương pháp làm cho tế bào nước trạng thái tự Đồng thời làm giảm, chí ngừng hẳn q trình phân chia vi sinh vật Nhờ chúng chịu nhiều tác động ngoại cảnh
(31)CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP
1 Nêu tóm tắt nguyên tắc phương pháp chung để phân lập vi sinh vật dạng khiết
(32)BÀI SỐ 5: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT TRÊN KÍNH HIỂN VI
-I MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU
1 Kiến thức lý thuyết
- Đặc điểm sinh học nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm men - Ý nghĩa việc nghiên cứu đặc điểm sinh học nhóm vi sinh vật - Các đặc điểm sinh học đặc trưng nhóm vi sinh vật
2 Kỹ thực hành
- Kỹ sử dụng kính hiển vi quang học
- Kỹ làm tiêu tạm thời, tiêu cố định - Kỹ nhuộm màu tiêu
- Kỹ quan sát đặc điểm sinh học vi sinh vật kính hiển vi quang học
II HÓA CHẤT – NGUYÊN LIỆU – DỤNG CỤ
1 Khái niệm thuốc nhuộm
- Thuốc nhuộm hợp chất hóa học dùng để nhuộm màu
- Căn vào tính chất hóa lý, chia làm loại thuốc nhuộm chính:
Thuốc nhuộm kiềm thuốc nhuộm gốc kiềm có khả nhuộm màu, chúng kết hợp chặt chẽ với phần nhân tế bào
Ví dụ: thuốc nhuộm tím gentian, fuchsin kiềm, safranin
Thuốc nhuộm acid thuốc nhuộm mà gốc kiềm có khả kết hợp chặt chẽ với thành phần tế bào chất
Trong nghiên cứu vi sinh vật, người ta sử dụng chủ yếu thuốc nhuộm kiềm tế bào chúng bắt màu tốt với loại thuốc nhuộm
2 Một số loại thuốc thuộm sử dụng
Thuốc nhuộm Fuchsin:
1/ Rượu ethylic 960: 10 ml Fuchsin kiềm: 0,3g
(33)Xanh Methylen 0,001%
Xanh methylen: 0,1g
Nước cất: 1000ml
Xanh Methylen Loeffler
Rượu ethylic: 300ml Xanh methylen: 20g Hòa tan hỗn hợp lọc (1)
Dịch lọc (1) 30ml
KOH 1%: 1ml
Nước cất: 1000ml
Dung dịch lactophenol
Phenol kết tinh: 10g Acid lactic: 10g
Glycerin: 20g
Nước cất: 10ml
Tím gentian
- Cơng thức:
1/ Gentian violet: 1g Rượu ethylic 960
: 10ml
2/ Phenol tinh khiết 5g
Nước cất 100ml
- Cách pha chế:
Dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho tan hết gentian violet rượu
Trộn dung dịch (1) (2) lọc Để dịch lọc lọ màu
- Ghi chú: Hòa phần cồn với thuốc nhuộm cho tan hết cho acid vào, lắc Tiếp tục thêm cồn hết váng kim loại mặt
Dung dịch lugol
- Công thức: Iod tinh thể : 1g
KI: 2g
- Cách pha chế:
(34)Hòa KI vào 5ml nước cất cho tan hết cho iod tinh thể vào Bổ sung đủ 300ml nước sau iod tan hết
Cồn 95%
Aceton
3 Nguyên liệu
- Ống thạch nghiêng cấy loài vi sinh vật sau: Bacillus subtilis, Sarcina lutea
Penicillum italicum, Aspergillus niger
Streptomyces grisea
Saccharomyces cerevisiae
- Môi trườngHansen nuôi cấy nấm menSaccharomyces cerevisiae
- Môi trường cao thịt – pepton dịch thể cấyE.Coli.
- Nước cất vô trùng 4 Dụng cụ
- Lame, lamelle - Que cấy, đèn cồn - Giấy lọc
- Bocan, cầu thủy tinh - Bình tia
- Tăm tre vơ trùng - Kính hiển vi, dầu soi
III. LÀM TIÊU BẢN TẠM THỜI
1. Các đặc điểm tiêu tạmthời
- Thao tác làm tiêu đơn giản, tiến hành nhanh
- Quan sát trạng thái sống tế bào như: chuyển động tiên mao, sinh sản, hình thành bào tử
- Chỉ sử dụng lần bỏ
2 Cách lấy giống vi sinh vật để làm tiêu bản
- Đốt đèn cồn lên
(35)- Đưa que cấy vào lấy sinh khối vi sinh vật - Rút que cấy ra, khử trùng miệng ống nghiệm
- Đưa giọt môi trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật đầu que cấy đặt vào lame để làm vết bôi
- Khử trùng lại que cấy 3 Cách làm tiêu giọt ép
- Dùng que cấy lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi - Đặt lamelle lên giọt canh trường, tránh tạo bọt khí - Quan sát kính hiển vi
- Chú ý:
Nếu giọt dịch q nhiều, tràn ngồi lamelle dùng giấy thấm bớt nước Nếu cần quan sát lâu dùng vaselin bơi quanh mép lamelleđể giọt dịch khỏi bị khô
4 Cách làm tiêu tạm thời có nhuộm màu
a Nguyên tắc
Phương pháp sử dụng thuốc nhuộm khơng độc vi sinh vật pha loãng nồng độ đảm bảo cho vi sinh vật sống hoạt động sau nhuộm màu
b Cách nhuộm: Có cách nhuộm vi khuẩn sống:
Cách 1:
- Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên lame - Nhỏ giọt canh trường vi sinhvật với thuốc nhuộm - Đậy lamelle
- Quan sát tiêu vật kính X10 X40
Cách 2
- Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên lame - Dùng que cấy dàn thành vùng nhỏ để khô tự nhiên - Nhỏ giọt dịch vi khuẩn lên vùng màu khơ
- Quan sát tiêu với vật kính X10 X40 IV LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH
(36)Quan sát tiêu cố định phương pháp phổ biến nghiên cứu vi sinh vật học cóưu điểm sau:
- Tuy thao tác phức tạp tiêu có máu sắc đẹp, giữ lâu
- Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng cấu tạo tế bào, dễ dàng đếm số lượng vi sinh vật
- Không sợ lây nhiễm làm việc với vi sinh vật gây bệnh 2. Các bước tiến hành tiêu cố định
a Làm vết bôi
- Chọn lame khô
- Lấy sinh khối vi sinh vật cho vào lame - Để vết bơi khơ tự nhiên khơng khí - Chú ý:
Lượng vi sinh vật lấy vừa phải
Vết bơi trịn gọn, thật mỏng
Các tế bào vi sinh vật dàn dễ quan sát
b Cố định vết bôi
- Việc cố định vết bơi nhằm mục đích sau:
Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu an toàn tiếp xúc Gắn chặt vi sinh vật vào lame để lúc rửa không bị trôi mẫu - Các cách cố định:
Cố định nhiệt
Là phương pháp đơn giản phổ biến Dùng kẹp gỗ haykẹp sắt để kẹp lame
Hơ mặt lam lửa đèn cồn, tránh khơng để q nóng
Cố định hóa chất:
Cách phức tạp không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu trúc tế bào không làm đứt tiên mao
Dùng hóa chất rượu aceton để cố định vết bôi Cách cố định:
(37) Nhỏ vài giọt rượu 95% lên vết bôi Đốt cháy dậy tắt Làm vài lần để khô
3 Nhuộm màu tiêu cố định
a Nguyên tắc
- Sử dụng thuốc nhuộm có khả thẩm thấu qua màng tế bào kết hợp với thành phần khác tế bào thành hợp chất màu đặc trưng bền vững
- Tùy theo mục đích nghiên cứu khả bắt màu khác thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm cách nhuộm cho phù hợp
- Có cách nhuộm chính:
Nhuộm đơn: Chỉ dùng loại thuốc nhuộm tiêu
Nhuộm kép: Dùng đồng thời hay nhiều loại thuốc nhuộm tiêu
b Cách nhuộm
- Đặt tiêu lên cầu thủy tinh
- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin, để yên 1– phút
- Rửa vết bơi cách nghiêng lame, dùng bình tia xịt nước cho chảy nhẹ qua vết bôi khơng cịn màu
- Dùng giấy thấm khơ tiêu hơ nhẹ tiêu đèn cồn - Quan sát tiêu vật kính X40 X100 dùng dầu soi
V. QUAN SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT
1. Quan sát đặc điểm sinh học vi khuẩn (Bacteria)
a. Các đặc trưng sinh học cần quan sát vi khuẩn - Các kiểu hình dạng tế bào
- Các kiểu liên kết tế bào - Khả di động
- Khả hình thành bào tử - Nhuộm Gram
b Cách quan sát
Quan sátở cầu khuẩn
- Làm tiêu giọt ép với ống thạch nghiêng cấy vi khuẩnSarcina lutea.
(38)- Yêu cầu:
Vẽ hình dạng tế bào, kiểu liên kết tế bào Nhận xét chuyển động tế bào
Quan sátở trực khuẩn
- Làm tiêu giọt ép với vi khuẩnE.Coli môi trường dịch thể (1)
- Làm tiêu nhuộm đơn với vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy thạch nghiêng (2)
- Yêu cầu:
Tiêu 1: quan sát vật kính X40 Vẽ hình, nhận dạng chuyển động tế bào
Tiêu 2: quan sát vật kính X40 X100 dầu soi
Vẽ hình nhận xét hình dạng tế bào; hình dạng, số lượng vị trí bào tử tế bào
Quan sátở xoắn khuẩn
- Làm tiêu cố định nhuộm màu với bựa để quan sát vi khuẩn Vibrio, Spirochae, Spirillum.
- Chú ý: dùng tăm lấy bựa làm vết bôi
- Lấy bựa vừa phải, dàn quan sát - Quan sátở vật kính X40 X100 dầu soi
- Vẽ hình dạng xoắn khác vi khuẩn (xoắn từ vòng đến nhiều vòng)
a) b) c)
Hình 13: Các hình dạng vi khuẩn
(39)a. Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Hình dạng bào tử
- Đặc điểm cuống sinh bào tử
- Phương thức hình thành chuỗi bào tử
b Cách quan sát
- Làm tiêu giọt ép với Streptomyces grisea thạch nghiêng (khi làm tiêu phải dùng que cấy đầu nhọn dìm khuẩn ty xạ khuẩn giọt nước tách rời sợi, sau đậy lamelle quan sát)
- Làm tiêu nhuộm đơn với xạ khuẩn
- Yêu cầu: Quan sát tiêu vật kính X10 X40 Vẽ hình nhận xét hình dạng chung xạ khuẩn
- Làm tiêu quan sát cuống sinh bào tử:
Cấy xạ khuẩn vào môi trường đĩa petri
Dùng lamelle cắm vào bề mặt thạch nghiêng góc 450 Đậy đĩa petri thích hợp vàủ nhiệt độ thích hợp
Sau lấy lamelle ra, đậy lên lame quan sát - Làm tiêu quan sát bào tử
Dùng lameấn nhẹ lên mặt thạch có xạ khuẩn mọc Quan sát kính hiển vi với vật kính X100
Vẽ hình nhận xét cuống sinh bào tử bào tử xạ khuẩn 3. Quan sát đặc điểm sinh học nấm mốc (Molds)
a. Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát
- Đặc điểm sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay không?
- Đặc điểm quan sinh sản: hình dạng, cách xếp phận quan sinh sản
- Hình dạng, cấu tạo, cách xếp bào tử
b Cách quan sát
- Làm tiêu nấm mốc không nhuộm màu Nhỏ giọt lactophenol lên lame
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nấm Penicillum hoặc Aspergillus niger và
dàn mỏng
(40)Vẽ hình nhận xét chung hình dạng sợi nấm; vị trí, hình dạng, cách xếp chung bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đính loại nấm mốc
- Làm tiêu nấm mốcnhuộm màu:
Nhỏ giọt dung dịch xanh cotton lên lame Lấy sợi nấm dàn lame
Đậy lamelle quan sátở vật kính X40 Vẽ hình cấu tạo sợi nấm quan sinh sản 4. Quan sát đặc điểm sinh họccủa nấm men (Yeasts)
a Những đặc điểm sinh học cần quan sát - Hình thái, kích thước tế bào nấm men - Sự nẩy chồi nấm men
- Hình dạng, số lượng bào tử túi bào tử
b Cách quan sát
- Làm tiêu nhuộm đơn nấm men cấy môi trường xanh methylen Loffler - Yêu cầu:
Quan sát kính hiển vi vật kính X40 X100
Vẽ hình thích màng tế bào chất, khơng bào tế bào
VI. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM
1 Hóa chất – nguyên liệu- dụng cụ
a Hóa chất – Nguyên liệu
Hóa chất
- Các loại thuốc nhuộm
- Nước muối sinh lý: dung dịch NaCl 0,85%
Nguyên liệu
- Cácống thạch nghiêng nuôi cấy giống vi sinh vật:B.subtilis, E.Coli.
b Dụng cụ
- Ống nghiệm đựng nước cất vô trùng - Lame, lamelle
(41)- Kính hiển vi, dầu soi kính - Giấy lọc, kẹp sắt
2 Nguyên tắc nhuộmgram
Dựa khả bắt màu tế bào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác
- Loại phức chất thứ giữ nguyên màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi xử lý cồn Vi sinh vật có phức chất vi khuẩn gram dương
- Loại phức chất thứ hai không giữ màu thuốc nhuộm nên màu xử lý cồn bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram âm
3. Các bước tiến hành - Làm tiêu
Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi lame (hai đầu lame)
Dùng que cấy lấy chút sinh khối làm vết bôi theo thứ tự sau:
Bên trái lame B.subtilis
Bên phải lame là E.Coli
Ở lame là B.subtilis trộn lẫn vớiE.Coli
Để khô vết bơi khơng khí cố định nhẹ đèn cồn - Nhuộm tiêu bản:
Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi
Nhuộm tiêu thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc phút Nhuộm lugol phút
Rửa nước
Tẩy cồn 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từtừng giọt cồn tan hết màu
Rửa nước
Nhuộm bổ sung Fuchsin safranin từ 10 – 30 giây Rửa nước
Làm khô soi tiêu với vật kính dầu - Kết quả:
(42) Vết bôi trộnB.subtilis + E.Coli có màu hồng lẫn màu tím Vết bơi củaE.Coli màu hồng - gram âm
Hình 14: Các bước nhuộm gram
Hình 15: Kết sau nhuộm gram
CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP
1) Thựchành làm tiêu giọt ép vi khuẩn E.Coli Vẽ hình thích đặc điểm quan sát
(43)3) Làm tiêu nhuộm màu A.niger Vẽ hình thích quan mang bào tử chúng
4) Trình bày nguyên tắc ý nghĩa việc nhuộm kép 5) Nêu tên loại thuốc nhuộm sử dụng nhuộm gram 6) Trình bày nguyên tắc nhuộm gram