ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA CÓ KHA NĂNG CHỊU HẠN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA CÓ KHA NĂNG CHỊU HẠN BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Thị Thanh Thuy Viện Di truyền Nông nghiệp MỞ ĐẦU Cây lúa (Oryza sativa L.) là một những lương thực có khả chịu hạn kém và khá nhạy cảm với mơi trường bên ngoài Tính trạng chịu hạn là mợt tính trạng đa gen phức tạp, những nghiên cứu sinh lý học tính chịu hạn lúa phụ thuộc vào các yếu tố sau: thứ nhất, khả đâm xuyên rễ tìm nước dưới tầng đất sâu phục vụ nhu cầu nước lớp nước bề mặt bị bốc hơi; thứ hai, khả điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào lá giúp trì sức căng bề mặt bảo vệ cho mô phân sinh khỏi bị nước; thứ ba, chế điều khiển thoát nước khí khổng (Nguyen & cs., 2000) Hiện nay, các nhà khoa học cho có khoảng 200 gen tham gia vào chế kháng hạn các gen này không quy tụ vào một giống cố định Kết quả nghiên cứu sơ bộ một số giống lúa cho thấy nước ta có nguồn gen chịu hạn phong phú từ các giống lúa địa phương Tuy nhiên, chưa có nhiều những phân tích, đánh giá đặc tính chịu hạn các giống lúa bản địa theo hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học Chính vậy, nghiên cứu này chúng tơi phân tích đa dạng di truyền tập đoàn 39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả chịu hạn thị phân tử SSR, với mục đích đưa nguồn thơng tin hữu ích cho những nghiên cứu tạo lập sở dữ liệu cho nguồn gen bản địa Việt Nam I TỔNG QUAN VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY LÚA 1.1 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng di truyền có vai trị quan trọng cơng nghệ sinh học nông nghiệp Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm trì đa dạng sinh học hỗ trợ xác định gen mục tiêu quá trình lai - chọn tạo giống thông qua lựa chọn các cặp bố mẹ phép lai Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng di truyền thực từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ tḥc vào mục đích người nghiên cứu 1.1.1 Chỉ thị hình thái Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa thị hình thái là phương pháp đánh giá thơng qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bợ phận) Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, khơng địi hỏi các thiết bị đắt tiền quy trình phức tạp Hiện phương pháp này sử dụng phổ biến trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác mắt thường Tuy nhiên, việc sử dụng thị hình thái phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: Thứ nhất, số lượng các tiêu hình thái có hạn, thị hình thái chịu tác đợng mơi trường và phụ thuộc vào giai đoạn định quá trình phát triển; hạn chế thứ hai, việc đánh giá mang tính chất thơng kê nên cần thực với số lượng lớn để đảm bảo tính xác; thứ ba, có nhiều tính trạng đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen biểu kiểu hình mà có thể đánh giá Vì thế, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng các tiêu hình thái với việc xác định thị sinh hoá và thị phân tử ADN để đạt kết quả xác 1.1.2 Chỉ thị sinh hóa Chỉ thị sinh hoá là loại thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm thị isozyme và các loại protein dự trữ Các protein khác có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau, vậy chúng có thể di chuyển với tốc đợ khác quá trình điện di tạo thành những đặc điểm đặc trưng gel điện di và có thể thị phương pháp nhuộm Cơ chế này điều khiển vật chất di truyền là ADN, thơng qua dịng thơng tin di truyền từ ADN  ARN  Protein Chỉ thị protein và thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao đồng thời có thể phát các biến dạng khác protein Tuy nhiên, số lượng không nhiều và sự biểu chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển cá thể, nên các thị protein và isozyme ứng dụng tương đối hạn chế 1.1.3 Chỉ thị phân tử ADN Các thị phân tử ADN là những thị dựa bản chất đa hình ADN Nó sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể một loài giữa các loài, phát loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài, dùng để lựa chọn tổ hợp lai Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen những đoạn ADN đặc hiệu, có tính ổn định cao và có thể xác định tất cả các loại mơ với đợ xác cao mà khơng bị ảnh hưởng điều kiện môi trường Chỉ thị phân tử chia làm hai nhóm chính: • Chỉ thị dựa sở nguyên lý lai ADN: thị RFLP • Chỉ thị dựa sở nhân bản ADN kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR, ) 2.1.3.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn) RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN cách lai axit nucleic, nguyên lý phương pháp: chiều dài ADN bộ gen sau cắt enzyme giới hạn thành những đoạn có kích thước khác Khi điện di những đoạn này phân bố những vị trí khác gel, qua biến tính các đoạn này trở thành sợi đơn và chuyển lên màng celulose nylon Trong quá trình lai ADN tiếp theo, chúng bổ sung với mẫu dị (là mợt đoạn ADN đánh dấu phóng xạ hoá học) cho phản ứng lai Kết quả phản ứng lai là chúng ta có thể xác định sự đa hình giữa các mẫu ADN khác Kỹ thuật RFLP các nhà di truyền học lần giới thiệu nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh người (Botstein và cs 1980) Chỉ thị RFLP là thị đồng trội sử dụng phổ biến tạo giống trồng với nhiều mục đích khác nhau: lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơn gen, phân tích đa hình di truyền Tuy nhiên, hạn chế kỹ thuật này là tốn nhiều thời gian, công sức, kỹ thuật phức tạp, độc hại sử dụng chất phóng xạ và đòi hỏi ADN chất lượng cao 2.1.3.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài đoạn nhân chọn lọc) Chỉ thị AFLP phát Zabeau Vos(1993) và mô tả chi tiết Vos và cs (1995) Ưu điểm kỹ thuật này là có độ nhạy cao, dễ phát đa hình toàn bợ hệ gen Kỹ thuật AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả ứng dụng lập bản đồ hệ gen (Thomas và cs 1995) và chọn giống (Vos và cs 1995) Nhược điểm kỹ thuật AFLP là thị di truyền trội đó không có khả phân biệt cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử, kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi phải có các phương pháp xử lý số liệu tự đợng quá trình phân tích, giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao 2.1.3.3 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ADN đa hình nhân bội ngẫu nhiên) Kỹ thuật RAPD cho phép phát đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên việc sử dùng một mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên Vào đầu thập kỷ 90, William và cs.(1990) những người thông báo việc sử dụng các đoạn mồi đơn dài 10 nucleotide và có trình tự tuỳ ý để phân tích đa hình bợ genome thực vật (khoai tây, lúa mì) Ngày kỹ thuật RAPD thống theo phương pháp William và cs (1990), sử dụng các đoạn mồi đơn dài từ - 12 nucleotide, tối thiểu là nucleotide, có trình tự ngẫu nhiên Ưu điểm kỹ thuật này là nhanh, giá thành cho mẫu phân tích thấp, khơng cần biết những thơng tin ban đầu trình tự, dễ dàng phân tích cho số lượng mẫu lớn Nhược điểm kỹ tḥt là nhạy cảm, phụ tḥc và điều kiện thí nghiệm, các thiết bị nghiên cứu và giai đoạn nghiên cứu Mặt khác, RAPD là thị trội nên nhận biết cá thể dị hợp tử, khó nhận biết những đoạn kích thước từ mẫu ADN khác thực sự có tạo từ vị trí hệ gen 2.3.1.3 Chỉ thị Microsatellite (SSR - Simple Sequence Repeats - lặp lại trật tự đơn giản) Trong thể thực vật, tượng lặp lại một trật nucleotide đơn giản là khá phổ biến Tuy nhiên, tuỳ loài mà số lượng nucleotide đơn vị lặp lại có thể hay nhiều và số lần lặp có thể biến động từ đến hàng trăm ngàn lần Phương thức lặp lại phong phú, chia làm kiểu lặp lại sau: • Lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại xếp nối tiếp nhau) • Lặp lại khơng hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một một số nucleotide khác) • Lặp lại phức tạp (có sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau) Chỉ thị SSR có ưu điểm so với các thị ADN khác: - Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR thiết kế dựa vùng trình tự sườn có tính bảo thủ cao các đoạn lặp SSR, đó sản phẩm nhân gen phản ứng SSR - PCR đặc hiệu và ổn định các thị ADN ngẫu nhiên - Di truyền đồng trội và mức đợ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motip SSR thay đổi nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác Do đó phản ứng SSR - PCR có thể phát các allene khác một locus SSR, qua đó phát các cá thể đồng hợp tử/dị hợp tử locus đó Nhược điểm bản việc sử dụng thị này là: tốn công sức, giá thành cao việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho locus đa hình bao gồm việc tách dịng và đọc trình tự mợt số lượng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR, loại mồi đặc trưng cho một loài 2.1.3.4.Một số loại thị ADN khác Phân tử ADN không khác trình tự mà cịn khác hình dạng không gian ADN trạng thái sợi xoắn kép Hai trình tự ADN cần có mợt vị trí nucleotide khác có thể mang hình dạng khác Bằng phương pháp điện di có thể phát sự đa hình (về hình dạng) giữa các đoạn ADN này (chỉ thị CS.GE- Conformation Sensitive Gel Electrophoresis) Cùng với những thành tựu công nghệ sinh học, nhiều loại thị mới phát triển và ứng dụng, làm phong phú những công cụ sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền Với mục tiêu làm sáng tỏ bản chất phân tử các nghiên cứu, các thị mới sâu vào phân tích trình tự ADN các gen cụ thể (chỉ thị STS, EST và ADN microarray…) giúp nghiên cứu đa dạng di truyền xác và chi tiết Tuy nhiên, những thị này yêu cầu kỹ thuật và chi phí cao so với các loại thị ADN “thế hệ cũ” (RAPD, SSR, …) Đây xem là điểm bản hạn chế sự phổ biến những thị này nghiên cứu đa dạng di truyền 1.2 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền lúa 1.2.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền lúa giới Sự phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học với sự đời nhiều loại thị thị số lượng loại thị làm tăng hiệu quả quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng với mục đích khác Chỉ thị ADN ứng dụng hiệu quả nghiên cứu di truyền thực vật mà phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát các tính trạng, hay chọn giống phân tử là các lĩnh vực triển khai hiệu quả Tác giả Virk và cs.(1995) tiến hành nghiên cứu 12 giống lúa trồng châu Á đại diện cho các vùng sinh thái, địa lý khác thị RAPD Kết quả cho thấy 18 số 24 mồi cho 83 băng, đó có 48 băng đa hình Số lượng băng đa hình xuất từ 1- băng/mồi, các băng nằm khoảng 300 - 2700bp Tác giả Xu (2004) sử dụng 113 thị RFLP và 60 thị SSR để định lượng đa dạng allene 125 giống lúa thu từ các bang miền Tây và miền Nam nước Mỹ và 111 giống từ tập đoàn lúa Quốc tế IRRI Các tác giả nhận thấy sở di truyền các giống lúa có Mỹ hẹp nhiều so với các giống từ tập đoàn lúa Quốc tế (56% SSR allele so với 96% và 92 RFLP so với 99%) Với 31 số 236 giống lúa có số lượng các allele cao (chiếm 95% số allele RFLP và 74% số allele SSR) có thể sử dụng làm tập đoàn hạt nhân Kết quả cho thấy, thị SSR sử dụng hữu hiệu RFLP cả khả phát các allele lẫn chi phí và kỹ thuật Tác giả Victoria và cs (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng 24 giống lúa Philippin có chất lượng tốt 164 thị SSR Trong số 164 thị SSR có 151 thị cho đa hình với tổng số allele thu là 890, trung bình 5,89 allele/locus Trong đó, có 89 thị cho 147 allele Hệ số đa dạng di truyền PIC từ 0,18 - 0,91, đạt trung bình 0,68/chỉ thị Theo kết quả phân tích UPGMA, độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa chia thành ba nhóm: Nhóm gồm giống Japonica, nhóm và là các giống lúa Indica Nghiên cứu này cho ta thấy việc sử dụng thị SSR là hiệu quả phân nhóm các loài phụ lúa, những giống lúa có chất lượng tốt thường có khoảng cách di truyền cao và chúng là nguồn vật liệu cho cơng tác chọn giống 1.2.2 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền lúa Việt Nam Việt Nam xem là trung tâm khởi nguyên lúa, tài nguyên di truyền lúa nước ta phong phú cả số lượng và chất lượng Những nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng Việt Nam hạn chế Tuy nhiên, những năm gần đây, các nhà khoa học bắt đầu quan tâm ứng dụng các kỹ thuật thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nước ta Tác giả Bùi Chí Bửu (1999) sử dụng 20 mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền 72 giống lúa địa phương Trong 20 mồi thử nghiệm thuộc nhóm OPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59 băng Kết quả có hai nhóm bao gồm các giống lúa mùa, lúa chiêm đồng sông Hồng, lúa nước sâu đồng sông Cửu Long, lúa nếp Tây Nguyên và lúa nước trời Duyên Hải Trung bộ Tác giả Nguyễn Đức Thành và cs (2001) sử dụng 10 mồi RAPD, 50 cặp mồi SSR, 15 cặp mồi AFLP để nghiên cứu 72 giống lúa nương Kết quả cho thấy, các giống lúa nương có đa dạng di truyền cao và là nguồn vật liệu tốt phục vụ công tác chọn giống Tác giả Trần Danh Sửu và cs (2006) sử dụng 48 thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền 17 giống lúa Tám Hệ số đa dạng gen thu từ các giống lúa là 0,35 Số allele thu trung bình 3,37 allele/mồi 17 giống lúa này phân loại Indica và Japonica dựa sự khác biệt ADN lục lạp Kết quả 17 giống lúa Tám thuộc nhóm Japonica Tác giả Phạm Thị Bé Tư và cs (2008) đánh giá đa dạng 90 giống lúa mùa địa phương thị SSR Hệ số đa dạng từ 0,68 - 9,95, trung bình là 0,88 Kết quả thu từ 90 giống lúa mùa địa phương phân thành nhóm giống khác II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu: - Tổng số có 40 giống lúa (Bảng 1), đó:  Có 39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả chịu hạn tốt cung cấp Trung tâm Tài nguyên Thực vật và Viện Lúa đồng sông Cửu Long  Có 01 giống lúa (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn - Có 50 mồi SSR cung cấp hãng IDT, Mỹ, bao phủ 12 nhiễm sắc thể hệ gen lúa (Bảng 2) Bảng 1: Danh sách giống lúa địa phương sử dụng nghiên cứu TT SĐK Tên giống Ký hiệu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 412 930 1832 1837 2021 2125 2127 2131 2135 2642 3351 3371 7099 3429 3483 3525 6430 3588 4666 3895 3935 3947 3970 4123 4723 4726 4748 4762 4792 4793 4794 4806 4840 4843 5057 5015 5018 5020 Nếp bồ hóng Hải Dương Lia tón Khẩu nuột cung Lúa mộ trắng Khẩu mèo B'le tolo Ble blu Ble la tong Ble lenh xi Ble’ la Lúa can đỏ Nếp mậm Kháu căm pị Chiêm đỏ Lúa muối Ba chơ K'tê Khẩu kẻn Tan ngần IR64 Ble mạ mùa Mồng lu Khẩu bò khá Ble ch cấu Khẩu lẩy khao Chăm soóng Nếp cái cạn Hang ngụa Lọ cang Khẩu mà giàng Khẩu nón Khẩu hin Blào sinh sái Blào đóng Blào cô ném Khẩu cụ Chạo lựu Khẩu sán Khẩu đó đón Nàng quớt biển H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22 H23 H24 H25 H26 H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 H34 H35 H36 H37 H38 H39 Nguồn gốc Hải Dương - QNam ĐNẵng QNam ĐNẵng Quảng Trị Quảng Ngãi Bình Định Yên Bái IRRI Sơn La Lai Châu TT 40 SĐK Tên giống Nàng quớt vàng Ký hiệu H40 10 Nguồn gốc - Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0.5µg/ml - Chuẩn bị khay gel và lược - Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút - Tra sản phẩm PCR - Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di - Chạy điện di tại 100mA giờ - Rửa gel H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh - Phân tích số liệu: Những số liệu thống kê bao gồm số allen locus, tần số allele phổ biến nhất, số allele độc nhất, số PIC (Polymorphism Information Content) tính toán sử dụng phần mềm Excel, đó: - Chỉ số Tần số allele phở biến nhất tính tỷ lệ % số cá thể xuất allele phổ biến tổng số allele xuất locus nghiên cứu - Allele độc thị SSR xác định là allele xuất giống toàn bộ các giống lúa nghiên cứu - Đa dạng di truyền allele các thị SSR đánh giá thông qua hệ số PIC (Botstein,1980) và tính theo phương trình: Trong đó: Pij : là tần số xuất alelel thứ j tương ứng với mồi i Giá trị PIC càng lớn tức là mức đợ đa hình locus mồi i khuếch đại càng lớn, tức là càng nhiều allen sinh Sự có mặt hay vắng mặt các allele thị SSR ghi nhận cho tất cả các giống lúa nghiên cứu, đó là không có băng ADN và là có băng ADN mợt vị trí Số liệu nhập vào chương trình NTSYS-pc v 2.1 (Rohlf, 1997) để xây dựng ma trận tương đồng di truyền sử dụng hệ số Dice (Dice, 1945; Nei and Li, 1979) Tiếp theo, sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền 14 giữa các giống lúa nghiên cứu xây dựng phương pháp phân nhóm UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical averages) III KẾT QUA VÀ THAO LUẬN 3.1 Kết phân tích đa hình ADN thị phân tử SSR Trong nghiên cứu này, chúng sử dụng tổng số 50 thị SSR để khảo sát đa hình với mợt số giống lúa đại diện, kết quả thu 27 thị cho đa hình, số thị này tiếp tục sử dụng để phân tích đa dạng di truyền toàn bợ 40 giống lúa nghiên cứu Còn lại 23 thị khơng cho đa hình giữa các giống lúa cho băng sản phẩm mờ không cho sản phẩm PCR, nên bị loại bỏ khỏi nghiên cứu này Mợt số hình ảnh minh họa kết quả điện di sản phẩm PCR 40 giống lúa nghiên cứu với các thị SSR gel agarose 3.0% (Hình 1) 15 16 17 Hình 1: Kết phân tích đa dạng di truyền 40 giống lúa sử dụng thị phân tử SSR gel agarose 3.0% 18 Bảng 3: Các tiêu allele, chi sô đa dang PIC cua cac locus SSR nhân biêt 40 giông lua nghiên cứu TT Chỉ thị SSR NST 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 RM145 RM152 RM267 RM566 RM1155 RM1364 RM1367 RM3288 RM3431 RM3455 RM3467 RM3468 RM3476 RM3483 RM3515 RM3534 RM5599 RM5811 RM6051 RM6648 RM7003 RM7372 RM7419 RM7654 RM8214 RM25271 RM25319 Tống số Trung bình Min Max 12 12 11 12 11 12 10 10 Số allele 11 11 9 10 7 6 5 7 193 7,1 11 Tần số allele phổ biến nhất 39,024 43,636 38,235 48,718 46,154 44,444 61,111 34,375 56,757 31,476 17,500 31,707 20,000 35,294 24,390 27,027 23,684 43,590 24,390 57,107 32,500 32,500 29,723 38,182 25,324 39,024 35,000 36,329 17,500 61,111 Số allele độc nhất 2 3 2 1 2 0 33 1,2 PIC 0,778 0,727 0,765 0,721 0,753 0,748 0,562 0,777 0,627 0,791 0,881 0,827 0,865 0,732 0,846 0,761 0,838 0,644 0,815 0,762 0,769 0,756 0,714 0,709 0,772 0,760 0,779 0,759 0,562 0,881 Kết quả phân tích đa hình các thị SSR nghiên cứu chúng tổng hợp Bảng Với tổng số 27 locus SSR phân tích, chúng thu nhận 193 allele, số allele/locus nằm khoảng từ - 11, trung bình allele/locus Các locus cho allele (5 allele) bao gồm các thị RM3455, 19 RM3483, RM5811, RM7372, RM7654, RM7419; hai locus cho nhiều allele (11 allele), đó là RM3467 và RM1155 Trong nghiên cứu này, chúng tiến hành đánh giá và phân tích mợt số số tần số allele phổ biến nhất, số allele độc tại locus và số đa dạng PIC locus SSR Kết quả phân tích cho thấy, tần số allele phổ biến giao động khoảng từ 17,5% đến 61,1%, tương ứng với thị RM3467 và RM1367 Số allele độc thay đổi từ - allele, đó một số thị không cho allele độc nhất, đó là các thị RM267, RM3288, RM3476, RM5599, RM6051, RM7372, RM7419, RM7654 và RM25319, có ba thị cho allele độc nhất, là các thị RM1364, RM3431 và RM6648 Chỉ số đa dạng PIC các locus nghiên cứu thay đổi từ 0,562 - 0,881, với giá trị trung bình đạt 0,759 So sánh kết quả nghiên cứu chúng với một số kết quả công bố nước và giới (Bảng 4), chúng nhận thấy số allele trung bình nghiên cứu thu khá cao - là7,1 - một số nghiên cứu thu số allele trung bình dưới (Wong, 2009, Nagaraju, 2002; Alvarez, 2007, T.H Herrera , 2008, S B Yu , 2003) Đặc biệt, so sánh số đa dạng PIC giữa các nghiên cứu, chúng nhận thấy số PIC thu nghiên cứu này có giá trị trung bình cao (0,76), các nghiên cứu tương tự có giá trị PIC trung bình giao đợng từ 0,52 đến 0,74 Giá trị PIC trung bình phản ánh mức đợ đa dạng chung cho tất cả các locus nghiên cứu Điều này chứng tỏ những thị SSR sử dụng nghiên cứu này cho kết quả đa dạng cao giữa các giống lúa nghiên cứu 20 Bảng 4: Mợt số kết phân tích đa dạng di truyền SSR lúa đã được công bố T T Số Tác giả Số giống thị Tổng số allele Trung bình Số allele Số PIC đợc allele (allele hiếm*) 8,4 0,69 1,7 2,6 0,52 3,8 6,6 0,74 1,4 13,1 0,66 9* 4,23 0,52 6,2 0,68 - L.E.Giarrocco, 2007 69 26 219 S.C Wong, 2009 12 31 J Nagaraju, 2002 24 19 70 Alba Alvarez, 2007 50 10 66 J Thomson, 2007 330 30 394 T.H Herrera , 2008 18 48 203 S B Yu , 2003 193 101 628 B.K Chakravarthi, 15 30 462 2006 Nghiên cứu này 40 27 193 7,1 (*): allele là allele có tần số xuất hiện 5% 0,76 1,2 3.2 Kết phân tích mối quan hệ di truyền của giống lúa nghiên cứu Chúng tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền 40 giống lúa thông qua ma trận tương đồng (Bảng 5) và sơ đồ hình thiết lập phương pháp UPGMA thể mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa (Hình 2) Kết quả cho thấy đợ tương đồng di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu giao đợng từ 0,00 đến 0,78 với giá trị trung bình là 0,22, điều này cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa mặt di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu Trong đó, hai giống lúa Khẩu sán Khẩu đó đón (H37 - H38) có hệ số tương đồng di truyền cao là 0,78 Ở mức độ tương đồng di truyền khoảng 0,14, tổng số 40 giống lúa nghiên cứu phân tách thành nhóm riêng biệt: - Nhóm I: Bao gồm 10 giống lúa với hệ số tương đồng Dice giao động khoảng 0,15 - 0,73 là H1, H9, H10, H11, H12, H14, H15, H19, H23, H24 21 - Nhóm II: Gồm 24 giống lúa với hệ số tương đồng giao động từ 0,15 - 0,70 Tại hệ số tương đồng khoảng 0,23, các giống lúa thuộc nhóm này phân thành phân nhóm chính:  Phân nhóm 1: Gồm giống H2 và H3 với hệ số tương đồng 0,44  Phân nhóm 2: Gồm giống là H6, H7, H8, H32, H33, H34, H35, H36 với hệ số tương đồng giao động từ 0,30 - 0,67  Phân nhóm 3: Gồm 14 giống là H13, H16, H17, H18, H20, H21, H22, H25, H26, H27, H28, H29, H30, H31 với hệ số tương đồng giao động từ 0,34 - 0,71 - Nhóm III: Gồm giống lúa với hệ số tương đồng di truyền từ 0,23 - 0,64 là H4, H5, H39, H40 - Nhóm IV: Gồm giống H37 và H38 với hệ số tương đồng di truyền là 0,78 Kết hợp kết quả phân nhóm di truyền thị phân tử SSR với những thông tin liên quan đến khả chịu hạn nguồn gốc các giống lúa, chúng chọn giống lúa đại diện cho các nhóm di truyền đồng thời có kiểu hình chịu hạn tốt và có nguồn gốc khác (Bảng 6) Đây là những giống lúa chúng sử dụng làm nguồn vật liệu cho nghiên cứu tạo lập sở dữ liệu cho nguồn gen lúa địa phương Việt Nam 22 Bảng Mối quan hệ di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu 23 H1 H9 H11 H12 H10 H19 H23 H24 H14 H15 H2 H3 H6 H7 H8 H32 H33 H34 H35 H36 H13 H20 H21 H22 H31 H18 H17 H25 H26 H27 H28 H29 H30 H16 H4 H5 H39 H40 H37 H38 H10MW 0.10 0.27 0.44 Dice coefficient 0.61 Hình Sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 40 giống lúa địa phương chịu hạn (Ký hiệu mũi tên đỏ những giống dùng để giải trình tự) 24 0.78 Bảng Danh sách những giống lúa sử dụng để giải trình tự DNA Ký hiệu Nguồn gốc TGST Năng suất Phẩm chất Kháng Đạo Bạc rầy ôn Chịu Chịu Chịu Chịu Đặc điểm hạn mặn rét ngập Nếp bồ hóng Hải Dương H1 Hải Dương 145 39,47 Kthơm NC Ktb K Tốt - 930 Lia tón H2 - 123 47,04 Kthơm NC N NC Tốt - 3429 Chiêm đỏ H14 x x 3525 Ba chơ K'tê H16 3588 Tan ngần H18 Quảng Trị Bình Định Yên Bái 4806 Blào sinh sái H32 5018 Khẩu sán H37 Nàng quớt biển H39 TT SĐK Tên giống 412 x ngon 25 x Cứng yếu, đẻ nhánh mạnh Cây trung bình, đẻ nhánh mạnh x IV KẾT LUẬN - Với 27 thị phân tử SSR sử dụng nghiên cứu, tổng số 40 giống lúa (39 giống lúa địa phương có khả chịu hạn tốt và giống lúa IR64 mẫn cảm với khô hạn) phân tích đa dạng di truyền, kết quả thu 193 allele, vậy tính trung bình 7,1 allele/locus Chỉ số đa dạng PIC các thị SSR 40 giống lúa giao động từ 0,56 - 0,88 (giá trị trung bình 0,76), điều này chứng tỏ sự đa dạng cao mặt di truyền các locus SSR nghiên cứu - Ma trận tương đồng và sơ đồ hình biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 40 giống lúa xây dựng dựa hệ số tương đồng DICE Kết quả cho thấy độ tương đồng di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu giao động từ 0,00 đến 0,78 với giá trị trung bình là 0,22 Ở hệ số tương đồng 0,14, tổng số 40 giống lúa nghiên cứu phân thành nhóm riêng biệt cho thấy sự đa dạng lớn giữa các giống lúa nghiên cứu - Từ kết quả phân nhóm di truyền và những thông tin kiểu hình chịu hạn, nguồn gốc các giống lúa nghiên cứu chọn giống lúa đại diện cho các nhóm di truyền đồng thời có kiểu hình chịu hạn tốt và có nguồn gốc khác Những giống này là nguồn vật liệu cho nghiên cứu tạo lập sở dữ liệu cho nguồn gen lúa địa phương Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHAO Tài liệu Tiếng Việt Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999), “Ứng dụng DNA marker đánh giá quỹ gen lúa”, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nợi Tr 1216-1273 Trần Danh Sửu, Lưu Ngọc Trình, Bùi Bá Bổng (2006), “ Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa Tám thị microsatellite”, Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn (12): 15-18 26 11 Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng và Trần Văn Diễn (1995), Di truyền học, NXB Khoa học kỹ thuật 13 Phạm Thị Bé Tư, Bùi Thị Dương Khuyều, Nguyễn Thị Lang ,Celsa Quinio, Bùi Chí Bửu (2008) “Phân tích đa dạng di truyền 90 giống lúa mùa địa phương lưu trữ ngân hàng gen Viện Lúa Đồng sơng Cửu Long” , Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn (4):12-18 Tài liệu Tiếng Anh Alvarez A., Fuentes J L., Puldón V., Gómez P J., Mora L., Duque M C., Gallego G and Tohme J M (2007) Genetic diversity analysis of Cuban traditional rice (Oryza sativa L.) varieties based on microsatellite markers Genetics and Molecular Biology 30 (4): 1109-1117 Chakravarthi B K., and Naravaneni R (2006) SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa L) African Journal of Biotechnology (9): 684-688 Coburn JR, Temnykh SV, Paul EM and McCouch SR (2002) Design and application of microsatellite marker panels for semiautomated genotyping of rice (Oryza sativa L.) Crop Sci 42:2092-2099 GIARROCCO, L.E.; MARASSI, M.A and SALERNO, G.L Assessment of the genetic diversity in Argentine rice cultivars with SSR Markers Crop Science, March 2007, vol 47, no 2, p 853-860 Herrera T G., Duque D P., Almeida I P., Núñez G T., Pieters A J., Martinez C P., Tohme J M (2008) Assessment of genetic diversity in Venezuelan rice cultivars using simple sequence repeats markers Electronic Journal of Biotechnology 11(5): 14pp Jeanine M P., Dun S., Mulawarman B., Rice K J (2005) Biocultural diversity in traditional rice-based agroecosystems: indigenous research and conservation of 27 mavo (Oryza sativa L.) upland rice landraces of eastern Indonesia Environ Dev Sustain DOI 10.1007/s10668-006-9047-2 Lang N T., Tu P T B, Thanh N C., Buu B C and Ismail A (2009) Genetic diversity of salt tolerance rice landraces in Vietnam Plant Breeding and Crop Science 1(5): 230-243 Nagaraju J., Kathirvel M., Ramesh Kumar R., Siddiq E A., and Hasnain S E (2002) Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and non-Basmati rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and SSR markers PNAS 99 (9): 5836–5841 Rabbani M A., Pervaiz Z H., Masood M S (2008) Genetic diversity analysis of traditional and improved cultivars of Pakistani rice (Oryza sativa L.) using RAPD markers Electronic Journal of Biotechnology 11(3): 10pp Rohlf F (1997) NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate analysis system, 2.1 edn Department of Ecology and Evolution, State University of NY, Stony Brook Thomson M J., Septiningsih E M., Suwardjo F., Santoso T J., Tiur S, Silitonga, McCouch S R (2007) Genetic diversity analysis of traditional and improved Indonesian rice (Oryza sativa L.) germplasm using microsatellite markers Theor Appl Genet 114:559–568 Wong S.C., Yiu P.H., Bong S.T.W., Lee H.H., Neoh P.N.P and Rajan A (2009) Analysis of Sarawak Bario Rice Diversity Using Microsatellite Markers American Journal of Agricultural and Biological Sciences (4): 298-304, 2009 Internet Resource www.gramene.org 28 ... Với 27 thị phân tử SSR sử dụng nghiên cứu, tổng số 40 giống lúa (39 giống lúa địa phương có kha? ? chịu hạn tốt và giống lúa IR64 mẫn cảm với khô hạn) phân tích đa dạng di truyền,... thị phân tử SSR với những thông tin liên quan đến kha? ? chịu hạn nguồn gốc các giống lúa, chúng chọn giống lúa đa? ?i di? ??n cho các nhóm di truyền đồng thời có kiểu hình chịu hạn. .. VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÂY LÚA 1.1 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng di truyền có vai trò quan trọng công nghệ sinh học nông nghiệp Từ những kết quả đa? ?nh giá đa dạng