NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT BIOGAS LÀM TĂNG HIỆU SUẤT TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THU HOÀI NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT BIOGAS LÀM TĂNG HIỆU SUẤT TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 420107 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2014 Cơng trình hồn thành tại: Đại học KHTN, ĐHQG Hà Nội Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: TS ĐinhThúy Hằng GS TS Nguyễn Lân Dũng Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại: vào hồi giờ, ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Ơ nhiễm mơi trường ven biển hải đảo ngày trở nên cấp bách chất thải hữu từ hoạt động khai thác thủy hải sản, du lịch sinh sống dân cư Hiện đơn vị quân đội, chất thải hữu xử lý thông qua thu gom chôn lấp, sử dụng chế phẩm vi sinh vật để thúc đẩy q trình phân hủy hiếu khí Các biện pháp sử dụng giải phần nhỏ chất thải rác hữu cơ, lại lượng lớn chất thải dạng lỏng từ hệ thống nhà tiêu hoạt động chăn nuôi gia súc gia cầm, nuôi trồng thủy sản chưa xử lý tới kết mong muốn thiếu công nghệ phù hợp trình phân hủy sinh học điều kiện mơi trường có nồng độ muối cao bị ức chế đồng thời diễn với tốc độ chậm Việc phát triển công nghệ xử lý chất thải hữu theo nguyên lý kỵ khí hứa hẹn giải pháp hữu hiệu góp phần xử lý nguồn chất thải sinh hoạt chăn nuôi cách hiệu quả, ngăn chặn ảnh hưởng chất thải (mùi, mầm bệnh) tới mơi trường sống, đồng thời tận thu lượng từ chất thải dạng khí sinh học Để đưa cơng nghệ vào hoạt động khu vực ven biển hải đảo, cổ khuẩn sinh methane (CKSMT) – nhóm vi sinh vật giữ vị trí then chốt cơng nghệ cần nghiên cứu tiến tới phát triển tạo nguồn vi sinh vật có hoạt tính cao, thích nghi tốt với mơi trường nước lợ nước mặn, chủ động cho trình vận hành cơng nghệ Dựa sở thực tiễn đó, tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu vi sinh vật ứng dụng cho sản xuất biogas làm tăng hiệu suất điều kiện nước lợ nước mặn ” với mục đích nội dung nghiên cứu sau: * Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu tập hợp vi sinh vật sinh methane có hoạt tính sinh học cao ứng dụng cho sản xuất khí sinh học điều kiện mơi trường nước lợ nước mặn * Nội dung nghiên cứu: - Làm giàu quần thể CKSMT sinh trưởng môi trường nước lợ nước mặn từ mẫu trầm tích biển với nhiều loại chất đặc hiệu khác - Nghiên cứu cấu trúc quần thể CKSMT dựa gen 16S rADN gen mcrA - Phân lập số chủng CKSMT, nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa phân loại chúng Bảo quản chủng đơn mẫu quần thể điều kiện đảm bảo hoạt tính ổn định - Đánh giá hoạt tính tạo khí sinh học quần thể làm giàu điều kiện môi trường khác (về nồng độ muối, nhiệt độ, pH) với chất thải bùn đầm nuôi tôm phế thải thực vật sau thu hoạch có bổ sung nước biển * Những đóng góp Luận án: Lần Việt Nam, nghiên cứu có hệ thống CKSMT môi trường nước nhiễm mặn (từ việc làm giàu, phân lập, nhân nuôi, nghiên cứu cấu trúc quần thể dựa 16S rADN gen mcrA) * Bố cục Luận án: Luận án gồm tổng số 110 trang, 10 bảng, 37 hình, 106 tài liệu tham khảo 03 phụ lục Trong đó, phần Mở đầu (02 trang), Chương – Tổng quan tài liệu (30 trang), Chương – Vật liệu phương pháp nghiên cứu (17 trang), Chương 3- Kết thảo luận (38 trang), Chương 4- Kết luận (02 trang), Danh mục công trình nghiên cứu tác giả (01 trang), Tài liệu tham khảo (13 trang), Phụ lục (07 trang) CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Xử lý chất thải hữu sinh theo cơng nghệ lên men kỵ khí sinh methane điều kiện nhiễm mặn 1.1.1 Ô nhiễm chất thải hữu môi trường nhiễm mặn 1.1.2 Xử lý ô nhiễm chất hữu lên men kỵ khí 1.1.3 Xử lý chất thải hữu phân hủy kỵ khí điều kiện nhiễm mặn 1.2 Bản chất sinh học lên men kỵ khí sinh methane 1.3 Đa dạng di truyền đặc tính sinh học CKSMT 1.3.1 Phân bố CKSMT tự nhiên 1.3.2 Vị trí phân loại CKSMT 1.3.3 Đặc tính sinh học CKSMT 1.3.3.1 Cơ chất trình sinh methane 1.3.3.2 Sinh hóa q trình lên men kỵ khí sinh methane 1.3.3.3 Phương pháp nghiên cứu quần thể CKSMT 1.3.3.4 CKSMT môi trường nước lợ nước biển 1.4 Công nghệ xử lý chất thải hữu lên men kỵ khí sinh methane 1.4.1 Một số cơng nghệ phổ biến 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phân hủy kỵ khí sinh methane 1.4.2.1 Cân dinh dưỡng 1.4.2.2 Các yếu tố lý hóa sinh học CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Mẫu trầm tích biển vùng biển Nha Trang Cát Bà độ sâu 20 - 30 cm để làm giàu phân lập CKSMT - Nguồn chất thải hữu cơ: Bùn đầm tôm thu công ty nuôi tôm Minh Thành (Quảng Ninh); rong xà lách (Ulva sp.), rong mơ (Sargassum sp.) thu ven biển Nha Trang, Khánh Hịa; nước thải chăn ni lấy từ hệ thống xử lý nước thải sau biogas trại nuôi lợn thịt (quy mô 2000 con) ông Dương Tấn Đức huyện Tam Dương, tỉnh Vĩnh Phúc 2.1.2 Hóa chất, mơi trường thiết bị Hóa chất: Các hóa chất có nguồn gốc từ hãng Sigma, Difco (Mỹ); Merck , Prolabo, Fermentas (Đức); Wako (Nhật); Bioneer (Hàn Quốc) Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Các loại mơi trường khống dịch thể, thạch bán lỏng; mơi trường dịch thể môi trường thạch LB Thiết bị nghiên cứu: Tủ cấy an toàn sinh học , máy ly tâm lạnh, máy PCR, máy định lượng DNA, máy so màu, hệ thống điện di biến tính DGGE, hệ thống điện di gel agarose, hệ thống sắc ký khí GC, máy soi gel Gel-Doc, kính hiển vi huỳnh quang kính lúp, tủ lạnh sâu 20C, hệ thống pipet cầm tay 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Làm giàu phân lập CKSMT 2.2.1.1 Làm giàu CKSMT: Các mẫu trầm tích ni mơi trường khống nước biển nước lợ cho CKSMT (Widdel, 1992) với chất methanol, acetate rong Ulva sp 2.2.1.2 Phân lập CKSMT: tiến hành mơi trường khống thạch bán lỏng dựa phương pháp dãy pha loãng 2.2.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học CKSMT 2.2.2.1 Quan sát đặc điểm hình thái: Tế bào pha sinh trưởng CKSMT đưa lên phiến kính phủ thạch 3% chụp ảnh kính hiển vi phản pha độ phóng đại 1000 2.2.2.2 Xác định ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng CKSMT: yếu tố nhiệt độ, pH, thành phần muối hay chất khác nghiên cứu, mức ảnh hưởng đánh giá thơng qua hàm lượng khí methane số OD600 dịch nuôi 2.2.3 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường chủng khiết 2.2.3.1 Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường: DNA tổng số mẫu làm giàu mẫu thí nghiệm mơ hình tách chiết theo phương pháp Zhou cộng (1996) mô tả với số cải biến 2.2.3.2 Tách DNA genome chủng khiết: DNA genome chủng khiết tinh theo phương pháp Marmur (1961) 2.2.3.3 Điện di DNA gel agarose: Sản phẩm DNA kiểm tra điện di gel agarose 1% đệm TAE 100 V thời gian 15 phút, nhuộm EtBr soi GelDoc 2.2.4 Phương pháp PCR- DGGE 2.2.4.1 Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA cho phân tích DGGE: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho cổ khuẩn 0348aF (TCCAGGCCCTACGGG) 0691R (GGATTACARGATTTCAC) (Wanatabe, 2004) 2.2.4.2 Điện di biến tính DGGE: tiến hành gel polyacrylamide 8% với dải biến tính urea/formamid từ 25% đến 60% Q trình điện di thực điện di DcodeTM System (BioRad) đệm 1 TAE, nhiệt độ 60C, 200 V, 3,5 2.2.4.3 Cắt băng gel: Băng điện di cắt nước MQ khử trùng qua đêm 4C 2.2.5 Phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng CKSMT * Sử dụng DNA genome tách từ chủng CKSMT làm khuôn * Khuyếch đại đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi đặc hiệu cho cổ khuẩn A109f (ACKGCTCAGTAACACGT) A934b (GTGCTCCCCCGCCAATTCCT) (Grosskopf, 1998) Sản phẩm PCR sau tinh kit giải trình tự Vị trí phân loại CKSMT xác định thông qua so sánh trình tự gen 16S rDNA dựng phân loại theo phương pháp neighbor joining (Felsenstein, 1985; Saitou, 1987) 2.2.6 Phương pháp phân tích đa dạng thơng qua thiết lập thư viện gen mcrA(clone library) 2.2.6.1 Nhân PCR tinh sản phẩm 2.2.6.2 Phản ứng ghép nối gen vào vector 2.2.6.3 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt 2.2.6.4 Tách dịng giải trình tự gen mcrA 2.2.7 Phân tích hóa học 2.2.7.1 Phân tích COD hịa tan: Sử dụng chất oxy hóa mạnh mơi trường axit kali dicromat (K2Cr2O7) (Lê Văn Khoa, 2000) 2.2.7.2 Xác định hàm lượng muối nước: phương pháp cân trọng lượng (Lê Văn Khoa, 2000) 2.2.7.3 Xác định tổng thể tích khí sinh q trình lên men kỵ khí: phương pháp cột nước (Lettinga, 1995) có cải biến 2.2.7.4 Xác định hàm lượng methane mơ hình thí nghiệm: Phân tích thiết bị sắc ký khí (Agilent 7890A), khí mang heli (tốc độ dịng 30 ml/phút), đầu dò cảm ứng nhiệt TCD (Haskin, 2013) 2.2.7.5 Xác định hoạt tính sinh methane: lượng khí CH4 tính mol sinh điều kiện tiêu chuẩn đơn vị thời gian 2.2.8 Thiết lập mơ hình lên men kỵ khí với nguồn chất khác điều kiện nước lợ nước mặn Mơ hình lên men kỵ khí thiết lập bình Scott lít chứa 1800 ml mơi trường khống nước lợ nước biển tổ hợp chất khác nhau, bổ sung nguồn CKSMT làm giàu từ trầm tích biển để khởi động CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Làm giàu CKSMT từ trầm tích biển Cát Bà Nha Trang Ở môi trường nước mặn nước lợ, mẫu làm giàu CKSMT từ trầm tích biển Nha Trang Cát Bà với chất xác định (acetate, methanol) chất không xác định (rong xà lách, Ulva sp.) sinh khí tốt, lượng khí sinh tăng theo thời gian lần làm giàu Với chất methanol, acetate, CKSMT từ trầm tích biển Nha Trang phát triển tốt điều kiện nước lợ, CKSMT từ trầm tích biển Cát Bà thích hợp với điều kiện nước mặn Với chất rong xà lách, CKSMT từ hai mẫu trầm tích biển tích lũy tới mức có hoạt tính cao qua bước làm giàu, điều kiện nước lợ tốt nước mặn Tuy nhiên khả sinh khí chất rong biển thấp so với chất methanol acetate 3.2 Nghiên cứu quần xã CKSMT mẫu làm giàu 3.2.1 CKSMT làm giàu với chất xác định methanol acetate Thành phần loài phân tích phương pháp PCR-DGGE NTMAcE3 NTMMeE3 CBLAcE3 CBLMeE3 CBMMeE3 NTLMeE3 CBMMeE1 NTMMeE1 CBLMeE1 NTMAcE1 CBLAcE1 NTLMeE1 đoạn gen 16S rDNA ( 350 bp) (Hình 3.3) 10 11 12 b1 b2 A B b1 b2 b2 Lần cấy truyền I Lần cấy truyền III Hình 3.3 Phân tích PCR-DGGE gen 16S rDNA quần xã CKSMT mẫu làm giàu từ trầm tích từ biển Nha Trang (NT) Cát Bà (CB) phương pháp PCR-DGGE A – Các mẫu làm giàu lần cấy truyền (E1); B – Các mẫu làm giàu lần cấy truyền (E3); b1 – Methanolobus sp., b2 – Methanosarcina sp.; Cơ chất methanol (Me), acetate (Ac) Kết cho thấy mối liên hệ nguồn chất làm giàu nhóm chiếm ưu Cụ thể, với chất methanol (đường điện di số 1, 3, 5, 6, 7, 11, 12) nhóm đại diện băng b1 chiếm ưu thế, với chất acetate (đường điện di số 2, 4, 8, 10) nhóm đại diện băng b2 chiếm ưu Các nhóm có mặt mẫu làm giàu lần cấy truyền với số lượng thấp (băng điện di mờ) tăng thêm số lượng sau lần cấy truyền (băng điện di đậm nét) Riêng mẫu NTMMeE1có băng b1(Hình 3.3A, đường điện di số 3), sau băng biến mất, thay vào băng b2 xuất 10 (đường điện di số 9) Hai băng b1 b2 cắt, thơi gel giải trình tự So sánh với trình tự ngân hàng liệu GenBank cho thấy băng b1 b2 tương ứng đại diện cho loài thuộc chi Methanolobus spp Methanosarcina spp 3.2.2 CKSMT làm giàu với rong biển Ulva sp 3.2.2.1 Phân tích quần xã điện di biến tính gen 16S rDNA Phân tích PCR-DGGE cho thấy khác biệt đáng kể mẫu làm giàu từ Nha Trang Cát Bà Tuy nhiên việc cắt băng nhân lại đoạn gen để giải trình tự không thành công, phương pháp thiết lập phân tích thư viện gen mcrA sử dụng 3.2.2.2 Phân tích quần xã thiết lập thư viện gen mcrA Gen mcrA mã hóa cho tiểu đơn vị  methyl coenzyme M reductase có mặt lồi CKSMT có tính bảo thủ cao, thường sử dụng làm thị phân tử để nghiên cứu đa dạng CKSMT tự nhiên Thư viện đoạn gen mcrA (550 bp) thiết lập mẫu làm giàu NTLRE3 (trầm tích Nha Trang điều kiện nước lợ) lần cấy truyền III (E3) sử dụng vector pGEM®T Kit pGEM®-T easy vector System (Promega) Hình 3.6 Cấu trúc quần xã CKSMT mẫu làm giàu NTLRE3 dựa phân tích thư viện gen mcrA (44 dòng tế bào) Thư viện gồm 44 dòng tế bào thiết lập, giải trình tự so sánh với ngân hàng liệu GenBank, kết thể hình 3.6 11 Bên cạnh số lượng lớn trình tự thuộc nhóm cổ khuẩn chưa xác định (54,5% uncultured archaea), đa dạng CKSMT thuộc chi Methanoplanus (18,2%), Methanosaeta (9,1%), Methanogenium (9,1%) Methanosarcina (9,1%) xác định thư viện gen mcrA thiết lập nghiên cứu 3.3 Phân lập CKSMT từ trầm tích biển Cát Bà Nha Trang Tổng số 10 chủng methanogen phân lập từ mẫu làm giàu sau ba lần cấy truyền có hoạt tính sinh methane ổn định, gồm: M7, M18a, M20a, M21, M23a, M23b, M24, M25a, M25b M37 Các chủng có khả sinh trưởng tốt điều kiện môi trường nước lợ (17 g NaCl/L), chứng tỏ khả chúng có nguồn gốc từ biển 10 18a 20a 21 23a 23b 24 25a 25b 25b Hình 3.4 Phân tích PCR-DGGE gen 16S rDNA chủng CKSMT phân lập Độ tinh mối liên quan vị trí phân loại chủng phân lập đánh giá phương pháp PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNA (Hình 3.4) Các chủng phân lập thể băng gel điện di biến tính, chứng tỏ chúng tinh khiết Chủng số 10 (đường điện di thứ 2) bị loại khơng có băng gel điện di, thay chủng M37 phân lập sau, khơng có mặt phân tích 12 Dựa vị trí băng điện di, chủng methanogen phân lập (trừ chủng M37) xếp vào nhóm, nhóm I gồm M7, M20a, M21; nhóm II gồm M23a, M23b, M24 nhóm III gồm 18a, 25a, 25b Ba chủng đại diện cho nhóm M21, M23b, M25a M37 chưa có mặt thí nghiệm phân tích DGGE giải trình tự gen 16S rDNA xác định vị trí phân loại (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Vị trí phân loại chủng CKSMT phân lập dựa so sánh trình tự gen 16S rDNA Tên nhóm Các chủng nhóm Chủng đại diện Lồi gần gũi (% tương đồng đồng trình tự gen 16S rDNA) I M7, M20a, M21 M21 Methanosarcina semesiae (97%) II M23a, M23b, M24 M23b Methanolobus profundii (96%) III M18a, M25a, 25b M25a Methanosarcina vacuolata (96%) IV M37 M37 Methanosarcina siciliae (98%) Trình tự gen 16S rDNA chủng lưu ngân hàng liệu GenBank với mã số tương ứng sau: M21 KC571195, M23b - KC571193, M25a - KC571194 M37 KC951109 3.4 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủng CKSMT phân lập 3.4.1 Khả sinh methane chủng CKSMT phân lập Mười chủng CKSMT phân lập có khả sinh khí hỗn hợp chất methanol, acetate trimethylamine Hai chủng M37 M7 tương ứng phân lập từ trầm tích biển Nha Trang Cát Bà trội cả, tạo 25 ml 19,5 ml khí tương ứng sau ngày nuôi (Bảng 3.4) 13 Bảng 3.4 Khả sinh khí biogas mức độ phát huỳnh quang chủng CKSMT phân lập TT 10 Tên chủng M7 M18a M20 M21 M23a M23b M24 M25a M25b M37 Tổng tích khí tạo (ml)* 19,5 5,4 15 15,6 19,2 19 18 15 16 25 Nguồn gốc phân lập Nha Trang Cát Bà Cát Bà Cát Bà Cát Bà Cát Bà Nha Trang Nha Trang Nha Trang Cát Bà Mức phát huỳnhquang tế bào ++ + + + ++ ++ ++ + + ++ Chú thích: * tổng thể tích khí xác định phương pháp cột nước, thực sau ngày ni bình serum thể tích 100 ml +: phát sáng trung bình; ++: phát sáng mạnh (so sánh với mức độ phát sáng quan sát mẫu bùn kỵ khí sinh biogas với hàm lượng methane > 70%) 3.4.2 Ảnh hưởng độ mặn tới sinh trưởng hai chủng M7 M37 Sinh trưởng hai chủng M7 M37 điều kiện mơi trường có nồng độ NaCl là: 1, 5, 10, 15, 20, 26 33 g/L, chất hỗn hợp Na-acetate, methanol trimethylamine (10 mM mỗi loại) Khả sinh trưởng đánh giá dựa mật độ quang OD600 hàm lượng khí methane tạo thành thể tích ni sau thời gian ngày nhiệt độ 37oC (Bảng 3.5) Ở nồng độ NaCl ≤ 26 g/L hai chủng có mức sinh trưởng hoạt tính methane tương đương Tuy nhiên nồng độ NaCl tăng lên mức 33 g/L chủng M37 tiếp tục sinh trưởng tạo methane tốt, hoạt tính chủng M7 giảm đáng kể Chủng M37 14 lựa chọn đối tượng để tiến hành nghiên cứu chi tiết cho mục đích ứng dụng Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ muối tới sinh trưởng hai chủng CKSMT M7 M37 NaCl (g/L) Yếu tố đánh giá Chủng M7 Chủng M37 OD600 % CH4 OD600 % CH4 0,34 0,91 0,65 1,3 2,34 18,48 1,83 16,09 10 3,72 18,27 2,9 16,46 15 3,39 17,64 2,83 18,34 20 3,04 17,83 3,2 16,23 26 3,04 17,11 3,06 16,3 33 3,04 15,01 3,06 21,92 3.4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng M37 Đặc điểm hình thái Tế bào hình cầu khơng chuẩn, kích thước thay đổi theo thời gian sinh trưởng, có tượng tế bào cụm thành nhóm đơi, ba nhiều Về phân loại chủng M37 thuộc chi Methanosarcina, loài gần gũi M siciliae với độ tương đồng trình tự 16S rDNA 98% Chủng M37 đặt tên khoa học Methanosarcina sp M37, lưu bảo tàng giống chuẩn Việt Nam với mã số VTCC-B1271 trình tự gen 16S rDNA lưu ngân hàng liệu GenBank với mã số KC951109 Đặc điểm sinh lý Chủng M37 sinh trưởng tăng sinh sinh methane tốt nhiệt độ 37C, mơi trường pH 7.5, có hàm lượng muối từ 17 - 40 g/L tối ưu mức nước biển 26 – 33 g/L Cơ chất phù hợp để sinh trưởng trimethylamine, lại tạo methane tốt với acetate Hydro methanol sử dụng để tăng sinh chuyển hóa thành methane (Hình 3.13) 15 B OD600 CH4 (mol) A Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Hình 3.13 Sinh trưởng sinh methane chủng M37 nguồn chất khác A – Giá trị mật độ quang OD600; B – Hàm lượng CH4 sinh 3.5 Tạo nguồn CKSMT để hỗ trợ trình lên men kỵ khí điều kiện nước lợ nước mặn 3.5.1 Lựa chọn nguồn CKSMT phù hợp Khởi động sinh methane chủng M37 tập hợp methanogen làm giàu mẫu NTLRE3 điều kiện tương đương (tuần đầu tiên), sau mức sinh methane mẫu NTLRE3 tăng ổn định mức ~ 20% cao so với chủng M37 (Hình CH4 (%) 3.14) Thời gian (ngày) Hình 3.14 Khả sinh methane chủng M37 so với tập hợp mẫu NTLRE3 điều kiện môi trường Như hai nguồn CKSMT tổ hợp NTLRE3 chủng M37 có khả hỡ trợ q trình phân hủy kỵ khí, 16 thí nghiệm vận hành mơ hình lên men kỵ khí sinh methane sử dụng tổ hợp CKSMT từ NTLRE3 chủng M37 3.5.2 Tạo sinh khối nguồn CKSMT từ tổ hợp NTLRE3 chủng M37 Cơ chất để nuôi CKSMT phục vụ cho mơ hình (hoặc ứng dụng thực tế sau này) cám gạo lên men Cám gạo khử trùng bổ sung vào mơi trường khống kỵ khí nước lợ (tỷ lệ 10%) với dịch làm giàu NTLRE3 (10% thể tích) để khởi động lên men thời gian 10 ngày nhiệt độ phịng Các nhóm vi khuẩn lên men có mặt dịch làm giàu NTLRE3 bên cạnh CKSMT chuyển hóa cám gạo thành axit hữu cơ, hạ pH dịch lên men tới 4,0, dịch lên men bảo quản 4oC Dịch lên men sau bổ sung vào mơi trường nuôi CKSMT theo tỷ lệ 1:20 (v:v) làm chất để sinh trưởng A B Hình 3.16 Bình ni nguồn CKSMT NTLRE3 M37 với cám gạo lên men môi trường nước biển sau 15 ngày (A) quan sát kính hiển vi huỳnh quang (B) Nhân giống cấp II thực trong bình Scott lít chứa 1,5 lít mơi trường khống nước biển nhân tạo kỵ khí, 100 ml cám gạo lên men, 200 ml dịch nuôi cấp I, nuôi 37 C thời 17 gian 15 ngày Hoạt tính CKSMT bình nhân giống cấp II xác định đạt ~ 350 mol/ml.ngày số lương CKSMT xác định theo phương pháp MPN 1,1  109 MPN/ml Như nguồn methanogen có hoạt tính ổn định nhân thành cơng từ tổ hợp NTLRE3 chủng M37 ký hiệu BKM (Hình 3.16) 3.5.3 Bảo quản nguồn CKSMT điều kiện phịng thí nghiệm Dịch làm giàu NTLRE3 chủng Methanosarcina sp M37 bảo quản dụng cụ mao quản thủy tinh đảm bảo tính kỵ khí hoàn toàn theo phương pháp Hippe (1991) CKSMT ni ống nghiệm thủy tinh có nút cao su thể tích ml (chứa 5ml mơi trường ) tới OD600 ≥ 0.3, sau ly tâm (trực tiếp ống nuôi) 5000 v/p 15 phút Sinh khối tế bào sau loại dịch môi trường hịa ml mơi trường khống kỵ khí chứa 5% DMSO chuyển vào mao quản thủy tinh nhờ dụng cụ hút chuyên dụng (25μl/mao quản) Các mao quản sau bảo quản lạnh sâu (­ 20oC -80 oC), kiểm tra định kỳ mỗi tháng đến năm 3.6 Thiết lập vận hành mơ hình xử lý chất thải hữu lên men kỵ khí sinh methane điều kiện nước mặn nước lợ 3.6.1 Thiết lập mơ hình Hỡn hợp chất điều kiện vận hành mơ hình nghiên cứu trình bày Bảng 3.6 Nước mặn sử dụng để bổ sung vào mơ hình nước biển Nha Trang Cát Bà, có hàm lượng NaCl tương ứng 26 g/L 17 g/L Nguồn chất phối trộn gồm rong xà lách, bùn thải đầm tôm nước thải từ trang trại nuôi lợn thịt bổ sung 20% mỗi loại 18 Bảng 3.6 Phối trộn nguồn hữu mô hình lên men kỵ khí Tên mơ hình Thành phần hữu phối trộn Điều kiện mơi trường COD hịa tan (mg/L) Nguồn methanogen Nước mặn 7200  MH1A Rong xà lách (Ulva sp.) MH1B Bùn đầm tôm Nước lợ 3900  - Rong xà lách - Bùn đầm tôm - Rong xà lách - Bùn đầm tôm - Chất thải chăn nuôi* - Rong xà lách - Bùn đầm tôm - Chất thải chăn nuôi* -Na-molybdat (1 mM) Nước lợ 9760 BKM Nước lợ 12560 BKM Nước lợ 12560 BKM MH2 MH3A MH3B * Đã khử trùng trước bổ sung vào hỡn hợp thí nghiệm 3.6.2 Theo dõi vận hành mơ hình Q trình chuyển hóa đánh giá thơng qua mức giảm COD hịa tan tăng tỷ lệ methane khí biogas sinh bình thí nghiệm (Hình 3.18) Kết cho thấy: - Trong mơ hình đối chứng MH1A MH1B, trình loại COD diễn mức thấp: loại 23% COD sau 90 ngày MH1B, không thay đổi MH1A A 19 B Hình 3.18 Chuyển hóa COD (A) khí methane sinh (B) mơ hình thí nghiệm lên men kỵ khí - Trong mơ hình MH2, MH3A MH3B có bổ sung nguồn CKSMT BKM, phân hủy kỵ khí sinh methane diễn tích cực Đặc biệt MH3B, có mặt Na2MoO4 (1mM) để ức chế vi khuẩn khử sulfate, 64,4 % COD bị loại sau 60 ngày (từ 12560 mg/L 4480 mg/L) 98% COD bị loại tiếp tục (còn 240 mg/L) sau 90 ngày Hàm lượng methane khí sinh tương ứng 40% 81,8% - Thời gian phân hủy kỵ khí điều kiện nước mặn mơ hình thí nghiệm dài đáng kể so với điều kiện nước (thường loại tới 90% COD 30 ngày) Bổ sung Na-molybdate (1 mM) vào MH3B làm tăng mức chuyển hóa sinh methane (do vi khuẩn khử sulfate bị ức chế) mà tăng hiệu suất loại COD nói chung 20 CHƯƠNG KẾT LUẬN CKSMT từ trầm tích biển Việt Nam (Cát Bà Nha Trang) làm giàu thành công với nguồn chất methanol, Naacetate rong biển Ulva sp điều kiện môi trường nước lợ (17 g NaCl/L) nước biển (26,4 g NaCl/L) Theo kết phân tích PCR-DGGE gen 16S rDNA Methanosarcina spp Methanolobus spp chiếm ưu mẫu làm giàu với methanol Na-acetate Với rong Ulva sp., Methanoplanus spp., Methanosarcina spp., Methanogenium spp., Methanosaeta spp nhóm tìm thấy bên cạnh lượng lớn loài chưa phân lập (theo kết phân tích thư viện gen mcrA) Tổng số 10 chủng CKSMT phân lập từ mẫu làm giàu, xếp vào chi Methanosarcina spp (7 chủng) Methanolobus spp (3 chủng) theo kết phân tích PCR-DGGE gen 16S rDNA chủng Bốn chủng đại diện giải trình tự gen 16S rDNA, gồm Methanosarcina sp M21 (GenBank KC571195), Methanosarcina sp M25a (KC571194), Methanosarcina sp M37 (KC951109) Methanolobus sp M23b (KC571193) Hai nguồn CKSMT gồm: chủng Methanosorcina sp M37 sinh trưởng tốt phổ rộng hàm lượng muối, tối ưu mức nước biển 26 – 33 g/L tổ hợp NTLRE3 làm giàu từ trầm tích biển Nha Trang với rong Ulva sp lựa chọn để tạo nguồn CKSMT hỗ trợ hệ thống xử lý kỵ khí điều kiện nước mặn Các nguồn CKSMT bảo quản điều kiện kỵ khí hồn toàn mao quản thủy tinh nhiệt độ lạnh sâu  20C 80C 21 Quy trình nuôi CKSMT BKM từ hai nguồn Methanosorcina sp M37 tổ hợp NTLRE3 thiết lập sử dụng cám gạo lên men chất môi trường nước biển nhân tạo, đạt mật độ 1,1  109 TB/ml hoạt tính sinh methane cao (350 mol CH4/ml.ngày) sau ngày ni Bổ sung BKM vào mơ hình lên men kỵ khí xử lý chất thải hữu (rong biển Ulva sp., bùn đầm tôm, chất thải chăn ni) điều kiện nước lợ nước biển có tác dụng rõ rệt việc chuyển hóa COD thành methane Cùng với có mặt Na2MoO4 (1 mM) để ức chế vi khuẩn khử sulfate, MH3B vận hành điều kiện nước lợ (17 g NaCl/L) với chất hỗn hợp rong, bùn chất thải chăn nuôi đạt hiệu xử lý cao nhất, loại 64,4% COD sau 60 ngày 98% sau 90 ngày, tỷ lệ CH4 biogas đạt tương ứng 40% 81,8% KIẾN NGHỊ Hoàn thiện quy trình tạo nguồn CKSMT BKM hỡ trợ hệ thống xử lý kỵ khí hoạt động điều kiện nước mặn Lựa chọn cơng nghệ kỵ khí phù hợp, thiết kế vận hành (có sử dụng nguồn CKSMT BKM) xử lý chất thải hữu đơn vị đóng quân ven biển từ có sở áp dụng triển khai cho nhiều khu vực ven biển hải đảo 22 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thu Hoài, Nguyễn Thị Tuyền, Đinh Thúy Hằng (2011), « Nghiên cứu methanogen trầm tích biển Việt Nam » Tập san Hội nghị khoa học, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga 12/2011 Nguyen Thu Hoai, Dương Chi Cong, Đinh Thuy Hang (2012), « Poster Methane fermentation of seaweed in saline water condition » Young scientist seminar 2012 Hanoi Poster presentation Nguyễn Thu Hoài, Nguyễn Thị Hải, Dương Chí Cơng, Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng (2013), « Phân lập cổ khuẩn sinh methane ưa mặn Methanosarcina sp M37 từ trầm tích biển Cát Bà, Việt Nam » Tạp chí Cơng nghệ sinh học 11(2): 363-368 Nguyễn Thu Hồi, Dương Chí Cơng, Đinh Thúy Hằng (2013), « Tận thu lượng từ rong biển qua phân hủy kỵ khí điều kiện nước mặn» Báo cáo khoa học – Tập san Hội nghị khoa học Cơng nghệ sinh học tồn Quốc năm 2013, 2, tr 233-236 Nguyễn Thu Hoài, Nguyễn Thị Tuyền, Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng (2014), « Làm giàu phân lập vi sinh vật nhóm methanogen từ trầm tích biển Việt Nam» Tạp chí Cơng nghệ sinh học 12(1): 373-380 23