Với mục tiêu tìm hiểu tác nhân gây bệnh listeria monocytogenes trong thủy sản và tìm hiểu các phương pháp xác định listeria monocytogenes trong các thủy sản sản phẩm đông lạnh, mời các bạn cùng tham khảo khóa luận tốt nghiệp Quy trình phát hiện listeria monocytogenes trong thủy hải sản đông lạnh dưới đây để nắm bắt thông tin chi tiết.
Trang 1LỜI MỞ ĐẦU
Listeria monocytogenes những năm gần đây nổi lên như một tác nhân gây bệnh từ thực phẩm quan trọng Đây là một loại trực khuân Gram dương ngắn, nhỏ, không sinh bào tử, thường có kiểu chuyên động xoay tròn quanh trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt treo Chúng có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy đơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9 Trên môi trường thạch rắn, khuân lạc của chúng trông như những giọt sương trong suốt, hơi nhuốm màu lam nhạt khi nhìn qua anh sang phản chiếu đưới góc 45°
Vé mit sinh héa Listeria monocytogenes dé bi nham véi nhitng vi sinh vật như
Lactobacillus, Brochothrix, Erysipelothrix và Kurthia Một số thử nghiệm sinh hóa đã được áp dụng để phân biệt Listeria monocytogenes với các loai Listeria khac nhu Listeria innocua, Listeria welshimeri va Listerisamurrayi Xác định kiểu huyết thanh cũng là một cách định danh quan trọng đối với vi sinh vật này
Listeria thuộc loại ưa lạnh, có thể phát tirển ở nhiệt độ thấp đến 2,5°C và cao đến
44°C Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý việc làm vệ sinh ống dẫn lạnh
trên trần vì đó là nơi có điều kién thuan loi cho Listeria phát triển và tích tụ Liều lượng gây bệnh của L¿is/eria monocytogenes hiện vẫn chưa được biết Bệnh bắt đầu từ đường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ Trường
hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các đại thực bào và gây nhiễm trùng máu Vi khuẩn tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thé xâm nhập vào bào thai trong bệnh mẹ gây sây thai, đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi
Listeria monocytogenes đã được phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau như
thịt, cá, rau, sữa và cà bề mặt nước Cần lưu ý kiểm tra sự hiện diện của vi sinh
Trang 3CHUONG I: MO DAU
1.1 Đặt vấn đề
— Đất nước ta có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển ngành nuôi trồng thủy hải sản Bờ biển Việt Nam khá dài và rộng, lại nằm trong vùng giao
nhau giữa các dòng nước và có khí hậu nhiệt đới nên trữ lượng hải sản rất
dồi dào và có giá trị kinh tế cao Vì vậy, ngành đánh bắt nuôi trồng thủy hải sản ở nước ta không ngừng phát triển, không những đáp ứng mhu cầu
trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường nước ngoài như: Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật, Mỹ, Anh Chất lượng vệ sinh thực phẩm
hiện nay đang là mối quan tâm hàng đầu khi xuất khâu thực phẩm sang
các quốc gia khác, đặc biệt là đối với mặt hàng thủy hải sản đông lạnh
—_ Tuy nhiên, việc xuất khẩu thủy hải sản của nước ta đang gặp khá nhiều khó khăn và một trong nhửng vấn đề đó là việc nhiễm các tác nhân gây
bệnh, gây độc như: dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh và Listeria monocyfogenes là một trong những tác nhân gây bệnh và gây ngộ
độc trong sản phẩm thủy hải sản đông lạnh
— Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, vi khudn Listeria monocytogenes gay ra bệnh Losteriosis Ca đầu tiên của bệnh Listeriosis đã được nói đến cách
đây 70 năm, nhưng phải đợi đến những năm 1980, vi khuẩn Listeria
monocyfogenes mới được chính thức xác nhận là tác nhân gây ngộ độc từ
thực phẩm L¿sferia monocyfogenes hình thành nên các triệu chứng như;
sốt, khó chịu, đau lưng Nếu độc tố đủ mạnh, chúng sẽ gây ra ngộ độc thực
Trang 4— Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn như vậy, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “quy trình phát hién Listeria trong thủy sản đông lạnh”
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Trang 5CHƯƠNG 2: TỎNG QUAN
2.1 Giới thiệu về thủy hải sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới
2.1.1 Giới thiệu chung về thủy hải sản
— Hải sản là bất kỳ động vật hoặc thực vật biển đươc phục vụ như thực
phẩm và là thức ăn của con người Hải sản bao gồm động vật biến như; cá
và các động vất có vỏ khác ( bao gồm cả động vật thân mềm và động vật
giáp xác.)
— Việc thu hoạch thủy hải sản tự nhiên được gọi là đánh bắt cá Ngành đánh bắt cá và nuôi trồng thủy hải sản được biết đến như là: nuôi biển, nuôi
trồng thủy sản, hoặc trong trường hợp của cá thì nuôi cá Hải sản thường
đươc phân biệt với thịt Mặc dù, nó vẫn có một số tính chất của động vật
và nó được loại trừ trong một số chế độ ăn chay Hải sản là một nguồn quan trọng trong việc bổ sung nguồn protein trong nhiều khâu phần ăn
trên thế giới, đặc biệt ở các vùng ven biển
— Hiện có hơn 32000 loài cá được sử dụng làm nguồn thực phẩm cho con người Ví dụ như: cá đối, cá chép, cá da trơn, cá chim lớn, cá trích, cá thu, cá mè, cá cơm và một số loài khác
— Thủy hải sản đông lạnh là thủy hải sản sạch được sơ chế, chế biến theo
quy trình nghiêm ngặt về vệ sinh an toàn thực phẩm Quy trình sơ chế, chế biến và đưa ra sản phẩm theo phương pháp IQF đưa ra sản phẩm đông lạnh với chất lượng tốt nhất Ngay từ khâu nguyên liệu được tuyển chọn
kỹ lượng với chất lượng đảm bảo và sau đó sẽ được sản xuất trên đây truyền vô trùng tuyệt đối đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, từ đó sẽ đưa
Trang 6dùng, chúng được kiểm tra bởi các cơ quan y tế và được cấp giấy phép vệ
sinh an toàn thực phâm Chính vì vậy, thực phẩm đông lạnh là sản phẩm
có chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm rất cao
2.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản Việt Nam
- Trong 3 mùa hè liên tiếp, Viện dinh dưỡng quốc gia đã thực hiện đề tài nghiên cứu: “Thực trạng ô nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm thủy hải sản
đông lạnh và chế biến trên địa bàn Hà Nội” Kết quả kiểm tra vi sinh vật
tại phòng thí nghiệm 300 mẫu thực phẩm thủy hải sản đông lạnh và chế
biến sẵn (được lấy ngẫu nhiên) từ một số chợ và siêu thị trong 6 quận thành Hà Nội cho thấy 82 mẫu không đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực
phẩm Trong đó có 36 mầu cá đông lạnh, 29 mẫu tôm, cua sơ chế, § mẫu tép và 6 mẫu nem chả giò
— Đặt biệt có tới gần 30% mẫu không đạt nhiễm một số loại vi sinh vật vượt
quá giới hạn cho phép Trong dó có 49 mẫu không đạt tiêu chuẩn về Coliforms ( chiếm 16.3%), 34 mẫu khong dat vé E.coli (11%), 28 mau
không dat vé C.perfrigens (9.3%) va 7 mau không đạt vé Vibrio parahaemolyticus(2.3%) Trong 28 mau nhiém C.perfrigens chu yéu 1a:
mẫu mắm tôm, mắm tép có thê gây ngộ độc bắt cứ lúc nào Nguy hại hơn cả là trong hải sản đông lạnh có vi khuẩn Wibrio parahaemolyticus đươc xác nhận là nguyên nhân gây ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn do cá biển và hải sản Bệnh hầu hết xãy ra vào mùa hè đối với những người ăn gỏi cá và những thực phâm chưa chín, có thể gây ngộ độc, gây đau bụng, nôn,
sốt, đặc biệt là gây ra tiêu chảy
Trang 7Ngộ độc tiêu chảy được phát hiện vào năm 1976 từ con trai nhiễm độc tại
Nhật Bản
Ngộ độc Wenerupin đầu tiên bùng phát do ăn hào và nghêu chỉ có trong
vùng biển nước Nhật vào một thời điểm đặt biệt nào đó trong năm, chất độc tạo ra bở nhiều sinh vật sinh sản mau lẹ, rất nhiều trong cuối mùa đông, đôi khi xuất hiện ngoài khơi nước Bồ Đào Nha Cơn bệnh có thế
làm hư gan, chết khoảng 1/3 nạn nhân
Cuối năm 1987, ngộ dộc mất trí nhớ được để ý khi nó phát triển nhiều tại phía Đông Canada thủ phạm là chất acid domoic, một chất độc
neurotoxinmanh phat sinh từ tao diatom Nitzschia punens trong nước
lạnh.Nạn nhân sẽ bị mất trí nhớ trong một thời gian ngắn, một số ca đẫn
đến tử vong
Ăn phải tảo đỏ gây ra ngộ độc nguy hiểm, vào năm 1991 tại đảo Guam đã có 13 trường hợp ngộ độc do ăn phải tảo đỏ Polycavemosa tsudai, có 3 trong số đó bị chết
Năm 2004 đã có 53 cảnh báo về vượt quá giới hạn sulphit trong tôm Trong đó mặt hàng tôm chín chiếm 31 cảnh báo, đây cũng là mặt hàng có quy định sulphit nghiêm ngặt nhất (không quá 50 miligram/kg tôm) Quy
định này cũng có nghĩa là: mặc dù, nếu một nhà chế biến thực phẩm tuân
thủ nghiêm các tiêu chuẩn đối với tôm nguyên liệu, nhưng sau khi nấu chín tôm thì công ty này vẫn có thể vi phạm giới hạn tiêu chuẩn (do giới hạn quy định đối với tôm chín thấp hơn rất nhiều)
Trang 8- Cũng theo hệ thống cảnh báo của Rasff, năm ngoái có 39 cảnh báo về sự xuất hiện của Histamin trong thủy sản Trong đó, cá ngừ chiếm 31 cảnh báo và hầu hết là mặt hàng ướp lạnh, sau khi nhập khẩu đã được đóng túi chân không ở Hà Lan Nước bị cảnh báo nhiều nhất là Inđônêxia
— Các thanh tra của Italia cũng đã phát hiện và cảnh báo 41 lần về việc lây nhiễm ký sinh trùng (Anisakis), chủ yếu trong cá thu tươi xuất xứ từ Nauy, Đan Mạch, và cá vây chân từ Anh
— Cảnh báo về dư lượng Cactimi trong thủy hải sản chiếm 43 lần, ít hơn một nửa so với số lượng cảnh báo hồi năm 2003 (103) lần, và chủ yếu liên
quan đến các sản phẩm cá kiếm và nhuyễn thể chân đầu Số lần cảnh báo
Trang 9— Chi Listeria dugc dat theo tên nhà ngoại khoa người Anh, Joseph Lister Năm 1918, một loại vi khuẩn tương tự như Erysipelothrix rhusiopathiae được phân lập từ dịch não tủy của một quân nhân người Pháp Chủng vi khuẩn này được lưu giữ tại viện Pasteur Paris, nhưng phải nhiều năm sau
đó, vi khuân này mới được mệnh danh là Listeria monocytogenes
— Năm 1924, Murray và cộng sự, trong quá trình nghiên cứu một dịch bệnh
trên các động vật thí nghiệm, đã phân lập được một chủng vi khuẩn từ các
hạch Lympho của các động vật bị bệnh Sau đó , lấy vi khuân này tiêm cho các con khỏe mạnh thì thấy ở chúng, có hiện tượng tăng bạch cầu đơn nhân, tương tự như bệnh của quân nhân người Pháp nói trên Vì vậy, ông
đặt tên cho nó là: Bacillus monocyfogenes Ba năm sau, tai Nam Phi, Piie
khi đó đang nghiên cứu sự mang Yersinia pepris trên chuột đã phân lập được một vi khuẩn từ gan chuột và ông đặt tên nó là Lisferia hepatolytica
Trực khuẩn này không thê phân biệt với Bøcillus monocyfogenes và chủng
vi khuẩn lưu giữ ở viện Pasteur Paris Chính vì vậy, pirie đã đề xuất một tên mới chỉ chung cho các chủng này là Lis/eria monocyfogenes
— Năm 1929, Nyfeldt phân lập được Lisferia monocyfogenes từ máu của một bệnh nhân bị sốt kèm theo viêm hạch và ông tin rằng đó là tác nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng Tất nhiên, nhiều tác giả khác đã
không đồng ý với lập luận của Nifeldt Nhiều năm sau đó, những công bố
kinh điển về bệnh nhiễm L¿s/eria (Listeriosis) trên người, kể cả ở trẻ sơ
Trang 10- Năm 1950, những nghiên cứu đầu tiên, thực sự mang tính hệ thống về nhiém Listeria trên người đã thực hiện Tuy nhiên, phải mất thêm ba thập
kỷ nữa, sau hàng loạt các báo cáo dịch được công bố mới thấy, nghiên cứu về Listeria monocytogenes từ chỗ tương đối bế tắc đã trở nên sáng sủa hơn Từ đó tới nay, chủ đề này đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều chuyên ngành, không chỉ bởi vì tầm quan trọng của /is/eria monocytogenes với sức khỏe cộng đồng, mà còn là vì, vi khuẩn này đã trở
thành một mẫu hình nghiên cứu thực nghiệm cho hiện tượng ký sinh nội bào không bắt buộc
2.2.2 Phân loại
Hinh 2.2 Vi khuan Listeria monocytogenes
— Loài khuẩn giéng Listeria 1a nhimg vi khuan hinh que Gram duong, ngan, chúng ky khí, dương tính với catalase, âm tính với oxidase, di động 6 20-
25°C và không đi động ở 370C
—_ Phân loại học của Lis/eria.spp trong giới vi sinh vật như sau: s* Thuộc giới: Bacteria
s* Ngành : Fimicufes ** Lớp: Bacili
Trang 11s* Bộ: Bacillales s* Ho: Listeriaceae s* Giống: Lisferia —_ Hiện tại có 7 lồi L¡sferia được cơng nhận: “+ Listeria monocytogenes “ Listeria ivanovii “+ Listeria innocua “ Listeria wells * Listeria seeligeri
* Listeria grayi (loài này hiện bao gồm cả loài cấp đưới Listeria murayi.) —_ Trong đó, các loài này chỉ có 2 loài gây bệnh qua thực nghiệm và tự nhiên,
Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii Trước kia, chúng gây bệnh cho người và động vật, sau này chúng gây bệnh chủ yếu cho động vật Cả 2 loài này và loài Listeria seeligeri déu san sinh ra B_ haemolysis trên
Sheep Blood Agar va day chinh 1a sợi dây nối kết với mầm bệnh Tuy
nhién, Listeria seeligeri không gây bệnh vì thế không thể xem xét một cách riêng biệt đặc điểm này như là một giả định về khả năng gây bệnh của các loài Lisferia
2.2.3 Đặc điểm chung của chỉ Listeria
— Mối liên quan giữa các loài trong chi Listeria là chủ đề được tranh luận nhiều nhất Ban đầu, chỉ này được cho là một thành viên của họ
Corynebacteriaceae, bởi vì các đặc điểm hình thái học và sau đó nghiên
cứu phân loại hóa học lại cho thấy các loài Lis£eria tương đối khác biệt so
với Corynebacteriaceae Cho đến năm 1984, trình tự từng phần với 16S rRNA đã khẳng định chính xác vị trí trên cây di truyền của chỉ 1¿sferia
Trang 12trong nhóm (Closfridium- Bacilius-Lactobacilus, với Brochothrix thermosphacta là gần nhất
—_ Chỉ Listeria ban đầu được mô tả là đơn type với duy nhất một thành viên là Listeria monocyfogenes Những năm sau này, thêm 7 loài khác được xác định: Listeria invanovii (trudc day goi 1a Listeria monocytogenes serovar5), Listeria innocua, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri,
Listeria muarrayi, Listeria grayi va Listeria denitrificans Listeria denitrificans dugc phan loai 1a Jonesia denitrifocans Listeria murrays và Listeria grayi từng được cho là có khác biệt so với các loài Lisferia khác
để đảm bảo cho sự thành lập một chỉ mới, Murraya, nhưng ngày nay được
xép thanh mét loai duy nhat Listeria grayi Gan day, Listeria ivanovii
được chia thành hai loài phụ 1a: subsp.ivanovii, va subsp.londonniensis Trong s6 cdc loai khong thuéc “monocytogenes” chi duy nhat Listeria iyanovii được xác định là tác nhân gây bệnh trên người
2.2.4 Đặc điểm hình thái và kháng nguyên
— Các loài J¿sferia là trực khuẩn Gram dương có kích thước ngắn (0.4-
0.5x0.5-2.0 um) Chúng mọc trên các môi trường nuôi cấy không acid, không sinh nha bào Ở 20C, chúng chỉ di động bằng lông mọc xung quanh than, nhưng sự di động không quan sát được ở 37C Chúng là vi
khuẩn ky khí không bắt buộc và có thể mọc trên khoảng nhiệt độ dao động từ 0-45°C ( tối ưu là 30-36°C), mặc dù tốc độ mọc ở nhiệt độ thấp là chậm
Chúng cũng mọc trên một khoảng pH dao động rộng, một số chủng có thể
mọc ở pH 9.6, nhưng đạt điều kiện tối ưu ở môi trường trung tính hoặc hơi kiềm
Trang 13— Kháng nguyên chính của các loài L7s/eria là kháng nguyên thân (O) và
kháng nguyên lông (H).Quy trình định type huyết thanh hiện nay dựa trên các kháng nguyên này, đã phân loại được 6 nhóm huyết thanh (1/2, 3, 4, 5,
6 và 7) và phân loại sâu hơn thành các serovar cho tất cả các loài trừ Listeria grayu va Listeria invanoii Trong khi Listeria invanoii va Listeria
welshimeri có thê được phân biệt với Listeria monocytogenes khang dinh type huyết thanh thì các loài khác có thể có chung một hoặc nhiều kháng nguyên tring voi Listeria monocytogenes Vi du, mot sé ching Listeria seeligeri có thê không phân biệt được về mặt kháng nguyên so với chủng thudc Listeria monocytogenes ở nhó, huyết thanh 1⁄2 Cũng cần lưu ý rằng,
mặc dù có 13 serovar cua Listeria monocytogenes mdi được xác định hiện nay, trong khi hơn 90% các chủng phân lập trên lâm sang chỉ thuộc về 3
serovar: 1/2a; 1/2b va 4b, điều này làm hạn chế giá trị của kỹ thuật này
trong các nghiên cứu dịch tễ học Các đặc tính quan trọng được liệt kê ở Bảng 2.1 Dùng để phân biệt cdc loai Listeria Loại test g 2 “% s ES So ® R š > 3 ~ 5 |e 8 & is |e 8 lỀ 3 š § | ` | Đ =5 l ơ ¬ J sj sj nm n
Tan mau beta (B) + - + + - - -
Trang 14Acid từ - - - + - - + D-Manitol L-Rhamnose D-Xylose o-Methyl-D- - - + + + glucoside + V - - - - ơ-Mcthyl-D- mannoside - - + - - - - + + + + V Vv Vv + + - - V V V Với (+)> 90% các chủng dương tính (-) < 10% các chủng dương tính (V) 11-89% các chủng dương tính (W)_ các chủng đương tính yếu 2.2.5 Cấu trúc 2.2.5.1 Cầu trúc di truyền
— Genome cua Listeria monocytogenes va Listeria innocua dugc giải trình tự có độ dài là 2.94 Mbp với 2583 khung đọc mở và mol % G+C là 39 Listeria innocua có genome dài 3.01 Mbp với 2973 khung đọc mở và
thành phần mol 5% G+C là 37 Một điều đáng chú ý là nhiều protein được
mã hóa bởi vi khuẩn này mang độ tương đồng rất cao so với Bacillus subtilis Listeria monocytogenes có mức độ đa đạng thường ở nhiều quần thể, do vậy,chúng có tới 331 gen mã hóa cho các protein vận chuyển khác
Trang 15nhau (11,6% trong số tất cả các gen dự kiến) và 209 các vị trí điều hòa quá
trình địch mã được tìm thấy trên loại vi khuẩn này
— Khoảng 0-79% cac chung Listeria monocytogenes c6 chita plasmid này ở
dạng ấn, sự đề kháng với cađmium là hiện tượng phụ thuộc plasmid và các
plasmid đặc hiệu cho hiện tượng đề kháng với một hoặc nhiều loại kháng sinh đã được ghi nhận Plasmid thường thấy trong các chủng Lis/eria
monocytogenes thuộc nhóm huyết thanh 1
2.2.5.2 Cầu trúc tế bào
— Nhân: là vùng nhân nguyên thủy, chưa có màng nhân nên không có hình
dạng cố định vì vậy còn gọi là vùng nhân
— Ribosome: nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng của tế bào chất Ribosome gồm hai tiểu phần ( 50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosome 70S
— Lông ( khuẩn mao ): là những sợi lông rất mảnh, chúng có tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể
Màng tế bào: Màng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL) chiếm 30 — 40% khối
lượng của màng, các protein chiếm 60 -70% khối lượng các màng Đầu phosphate của PL tích điện phân cực, ưa nước Đầu hydrocacbon không tích
điện, không phân cực, và có tính ky nước
Trang 16
Hình 2.3 Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes Chức năng chủ yếu của màng
Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất Duy trì áp suất thâm thấu bình thường của tế bào
Là nơi sinh tổng hợp của thành phần tế bào và các polymer của bao nhày Là nơi sinh tổng hợp của nhiều enzyme, các protein của chuỗi hô hấp Cung cấp năng lượng cho sự hoạt động của tiên mao
Tiên mao: chúng quyết định khả năng và phu7o7nmg pháp di động của vi khuẩn, tiên mao là nhũng sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có
Trang 17thể quan sát cấu trúc khi nhuộm theo phương pháp riêng Dưới kính hiển vi điện tử có thê thấy rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao
Thành tế bào:
Peptidoglycan chiếm 30 — 95%, là loại xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi ba
thành phần:
N-Acetylglucolsamin (NAG) Acid NO- acetylmuramic (NAM) 'Tetrapepid chứa cả D- và L- axit amin
Thành tế bào rất dày, hấp thu và giữ lại màu tím khi nhuộm với thuốc nhuộm tím tỉnh thê
Thành tế bào làm những nhiệm vụ sau :
Tham gia quá trình trao đôi chat
Là nơi chứa đựng nhiều chất có chứa hoạt tính sinh học
Bao nhay :
Bào vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn
Bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi bị thực bào
Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn Giúp vi khuẩn bám vào giá thể
Hình 2.4 Lông roi của vi khuẩn L¿sferia monocyfogenes
Trang 182.2.6 Yếu tố độc lực
2.2.6.1 Tổ hợp gen của Listeria monocytogenes
Gen prfA (prfA): hoat hoá quá trình lây lan cho tế bào chủ của vi khuẩn Gen plcA (PI-PLC) (phosphatidy linocitol-specific phospholipase C) 1a protein được mã hoá bởi gen plcA,33kDa), có tác dụng dung giải màng không bào của thé thực bào
Gen plcB(PC-PLC) (phosphatidulcholine-spefic phospholipase C, 1a protein được mã hoá bởi gen pclB, 29kDa):, có tác dụng dung giải màng
không bào của thê thực bào
Gen hly (LLO là protein được mã hoá bởi gen hly, 58.5kDa), có tác dụng giải phóng vi khuẩn ra khỏi Ikhông bào của tế bào chủ
Gen mpl (Mp! metallprotease dugc ma hod boi gen mpl,60kDa) là gen chứa 510 amino axit, có vai trò tham gia vào quá trình hoạt động của gen
pIcB
Gen actA ( AtceA là protein được mã hoá bởi gen ACTa,97kDa) có chức
năng giúp vi khuẩn lây lan từ tế bào này sang tế bào khác
Gen inlA (InIA là protein được ma hoa boi gen inlA, 80kDa) Protein InlA ảnh hưởng mạnh tới internalin khác, xoá bỏ inIA thì sẽ dẫn tới biểu hiện inIB cao hơn, có chức năng nội bộ hoá tế bào chủ
Gen ¡inIB (InIB là protein được mã hoá bởi gen inIB, 67kDa), có chức năng nội bộ hoá tế bào chủ
Trong đó gen prfA có vai trò như yếu tố điều hoà chính nhằm ổn định hoạt động của cdc gen plcA, plcB, hly, mpl, actA, inlA, inIB Ngoai ra, con cé gen hly mã hoá protein tao ra sản phẩm Listeriolysin O (LLO) là tác nhân gây bệnh Listerlosis ở người và động vật, plcA mã hoá tạo PI-PLC và gen
Trang 19plcB ma hoa tao PC-PLC, gen inlA ,mã hoá cho internalin A, gen inIB mã hoá cho internalin B, gen inIC mã hoá cho internalin C tất cả các gen này đều phụ thuộpc vào gen prfA
2.2.6.2 Độc tổ listeriolysin A (LLO)
Listeriosin A (LLO) là một độc tố protêin được tiết bởi L.monocytogenes
thóat khỏi không bào và thực bào chủ có trọng lương 58.6 kDa, hình thành 1 chuỗi polypeptide gồm 529 amino acid Trình tự đầu N có đặc điểm là phần đầu có tính ái nước, mang điện tích dương và đượ theo sau bởi 20 đầu ky nước trình tự này mã hoá trực tiếp cho protein và được phân cắt sau vi tri lysine 25 kết quả là LLO được bắt đầu từ amino axit thứ 26 và
có trọng lượng phân tử là 55.8kDa, dài 504 axit amin
LLO thuộc nhóm độc tố gắn lên cholesterol được hoạt hoá bởi nhóm thiol được tạo ra ở hầu hết các vi khuan Gram (+)
Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan đến pH của môi trường Nó
hoạt động cao nhất ở pH 5.5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7.0 Sự phát
hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của
Listeria monocyfogenes Sau quá trình thực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hoá LLO Chính độc tố này xúc
tiến quá trình ly giải không bào và vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất, trong khi đó pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO
2.2.6.3 Vai trò của yếu tổ độc lực
— Listeria monocyfogenes tồn tại trong môi trường đa dạng như: môi trường
sống bao gồm đất, nước, thức phẩm, động vật Gen prfA quy định sự biểu
hiện của các gen có tính độc đó Bên ngoài tế bào chủ, gen prfA tồn tại ở
Trang 20trạng thái hoạt động thấp Khi ở bên trong tế bào chủ, gen prfAkích hoạt
(prfA*) và biểu hiện các gen cần thiết cho cuộc xâm nhập vào tế bào chủ Listeria monocytogenes x4m nhap vào tế bào của cơ thê vật chủ thông qua
co ché thyc bao Néu Listeria monocytogenes van còn sống sau giai đoạn
đầu xâm nhiễm này, nó được cơ thê vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt đượ gọi là internalin A (inlA) và internalin B (inIB) InIA tương tác với e- Carherin tạo điều kién cho Listeria monocyfogenes đi vào tế bào biểu mô,
InIB nhận diện Clq-R ( hoặc Met) cho phép Lis/eria monocyfogenes xâm
nhập vào trong nhiều loại tế bào của vật chủ Sauk hi xâm nhiễm được vào
tế bào vật chủ, Listeria monocytogenes phan giải không bào tạo ra các lỗ
trên màng tế bào và hoạt giải độc tính lưu huỳnh PI-PLC kết hợp với PC-
PLC, giúp LLO phân giảikhông bào
Trang 21—— Ílsterid monocyt0gentes a Lysis of b .— Phagosome phagosome and replication in cytosol d F-actin —Ÿ—= Double-membraned vacuole rn Lysis of vacuole “ay “—===
Copyright © 2006 Nature Publishing Group Nature Reviews | Microbiology
Trang 22
Sau khi phân giải không bao, Listeria monocytogenes được phóng thích vào cytosol, tại đây chúng phát triển và nhân lên, trong giai đoạn này đòi hỏi phải có protein bề mặt khác như ActA để nó di chuyên từ tế bào này sang tế bào khác, và tổng hợp actin Đuôi actin cho phép vi khuẩn xâm
nhập vào tế bào chủ khác, nó phụ thuộc vào hoạt động của PC-PLC và MpI
2.2.7 Bénh va trigu ching cia bénh do vi khudn “Listeria monocytogenes” gay ra
2.2.7.1 Bénh do vi khudn “Listeria monocytogenes” gay ra
— Nhiém Listeria ở phụ nữ mang thai:
s* Hội chứng này xuất hiện trong khoảng một phần ba các trường hợp nhiễm
Listeria mặc đù tỷ lệ này có thể cao hơn nhiều trong các đợt dịch Hầu hết
các trường hợp nhiễm khuẩn đều xãy ra vào 3 tháng cuối của thai kỳ Đa
sé phy nit mang thai bi nhiém Listeria monocytogenes c6 dau hiéu: sốt ,
mệt mỏi và đau lưng, có khi thấy bị tiêu chảy, đau bụng, buồn nôn hoặc nôn trong suốt thời kỳ nhiễm khuẩn Vi khuẩn có thể lây truyền qua rau thai dẫn đến nhiễm khuẩn tử cung, viêm màng đệm và màng ối, sinh non,
hoặc bệnh khởi phát ở giai đoạn sớm ở những trẻ mới sinh Phụ nữ nhiễm bệnh dễ bị sãy thai tự nhiên Trẻ sơ sinh tuần lễ đầu tiên khởi phát bệnh với những dấu hiệu nhiễm khuẩn, khó thở, những tổn thương ở da, hội
chứng u hạt nhiễm khuẩn đặc trưng bởi những ô áp-xe rải rác ở gan, lách, tuyến thượng thận, phổi và những cơ quan khác Nếu nhiễm khuẩn bào thai ở giai đoạn sớm thường đi kèm với những biến chứng sản khoa như : sinh non và viêm màng đệm và màng ối
— Nhiém Listeria 6 tré sơ sinh:
Trang 23` oo a 4
a
Gần giống như các trường hợp nhiễm khuẩn liên cầu nhóm B ở trẻ sơ sinh, nhiém Listeria ở trẻ sơ sinh có thể được chia thành hai nhóm khởi phát sớm và muộn Khởi phát sớm là biểu hiện nhiễm khuẩn trong vòng 5 ngày, nhất là khoảng 48 giờ sau sinh Bệnh khởi phát muộn thì phát bệnh sau 5 ngày từ khi sinh, trung bình là 14 ngày Tỷ lệ tử vong cao tới 60% cho nhóm khởi phát sớm và 25% cho nhóm khởi phát muộn
Đa số các trường hợp bệnh khởi phát sớm bị truyền nhiễm 1/⁄sferia monocyfogenes từ trong tử cung qua nguồn vi khuẩn trong máu mẹ Nhiễm khuẩn từ âm đạo là cực kỳ hiếm gặp Biểu hiện kinh điển của bệnh khởi phát sớm là bệnh u hạt nhiễm khuẩn ở trẻ sơ sinh vời đặc tính là có u hạt rải rác ở một số cơ quan nội tạng Mặc đù biểu hiện điển hình hơn của
dạng bệnh này là nhiễm khuẩn huyết kèm theo viêm phổi và viêm màng
não Có thể có ban sần và ban dạng gờ nhú Trên thực tế thường khó phan
biệt giữa bệnh Listeriosis khởi phát sớm và các thể khác của nhiễm khuẩn
trẻ sơ sinh trên các bệnh cảnh lâm sàng đơn độc
Trái ngược với thể khởi phát sớm của bệnh này, trẻ sơ sinh có khởi phát
muộn thường biểu hiện khỏe mạnh lúc trẻ mới sinh Người ta cho rằng trẻ
sơ sinh bị vi khuẩn ngay từ lúc mới sinh, nhưng do các yếu tố chưa biết nào đó, việc khởi phát bệnh bị chậm lại Cũng giống như vậy, nhưng các trường hợp nhiễm khuẩn do nhiễm trùng bệnh viện xãy ra sau khi trẻ được sinh ra đã được ghi nhận trong nhiều báo cáo về các nhóm nhiễm Lis/eria khởi phát muộn Bệnh khởi phát muộn hay có viêm màng não hoặc viêm não màng não (ở 90% các trường hợp) Khởi phát muôn thường âm thầm hơn so với thể bệnh khởi phát sớm với những triệu chứng thường gặp như
Trang 24— Nhiễm I¿s/eria ở người trưởng thành
s* Nhiễm /⁄s/eria ở người trưởng thành thường gặp trên các bệnh cảnh suy
giảm miễn dịch, đặc biệt khi hệ miễn dịch của tế bào bị suy giảm như
trong u hệ Iympho, các hệ thống điều trị chống thải ghép trong các ca ghép
cơ quan nội tạng hoặc ghép tủy xương tự thân hoặc cùng loài, khi đó bệnh
xãy ra điển hình đưới dạng một biến chứng muộn Ngay trong thời kỳ đầu của dai dich AIDS, Listeria monocytogenes khong được coi là tác nhân
gây bệnh quan trọng với bệnh nhân nhiễm HIV, và có một số ý kiến giải thích khá thuyết phục cho hiện tượng này như hoạt tinh khang Listeria cha cotrimoxazole được dùng trong điều trị đự phòng nhiém Pneumocystis
jiroveci trước đó Những nghiên cứu gần đây lại cho thay, nhiém Listeria xãy ra ở bệnh nhân dương tính với HIV cao hơn 150-300 lần so với nhóm đối chứng Những bệnh mạn tính khác như nghiện rượu và tiểu đường
cũng là điều kiện thuận lợi cho việc lay nhiém Listeria monocytogenes
4 4 » Nhiém Listeria tién trién 6 ngudi truéng thanh có thể được xếp thành ba nhóm tùy theo các biểu hiện lâm sàng: bệnh liên quan đến hệ thống thần kinh trung ương (CNS) chiếm khoảng 75% các trường hợp, nhiễm khuẩn huyết nguyên phát và nhóm các loại khác bao gồm phổ rộng các loại nhiễm trùng tại chỗ
— Nhiễm khuẩn hệ thần kinh:
s* Viêm màng não có hoặc không có dấu hiệu thần kinh cục bộ là biểu hiện 4
hay gap nhat cua nhiém Listeria hé thần kinh trung ương Giống như các trường hợp viêm màng não mủ khác, viêm màng não do Lis/eria thường khởi phát cấp tính với sốt cao, cứng gáy và sợ ánh sáng, nhưng có thêm
Trang 25các rối loạn vận động như run rấy hoặc mất khả năng điều hòa Co giật cũng thường hay xuất hiện hơn so với các thê khác của viêm màng não
s* Biểu hiện của viêm màng não hay gặp nhất của nhiễm L¿s7eriz hệ thần 4
kinh trung ương là viêm màng não, thường hay ảnh hưởng nhất đến vùng
não sau Thế này có tiến triển theo kiểu hai thì điển hình: tiền triệu chứng
không đặc hiệu như đau đầu, buồn nôn, nôn và sốt, tiếp đó là liệt dây thần
kinh không đối xứng tiến triển, các dấu hiệu tiểu não hoặc liệt nhẹ nửa người và suy giảm ý thức Tiên lượng bệnh xấu, tỷ lệ di chứng thần kinh
cao ở các trường hợp sống sót Nguồn gốc nhiễm khuẩn thần kinh là từ nhiễm khuẩn huyết, không có bằng chứng cho thấy là lây bệnh từ những vị trí nhiễm bệnh khác
~ Nhiễm khuẩn huyết:
4 * Nhiễm khuẩn huyết nguyên phát là biểu hiện hay gặp thứ hai trong nhiễm 4
Listeria tién trién 6 ngudi lớn tuổi không mang thai, khoảng 25-50% các
trường hợp Không có đặc điểm lâm sàng phân biệt cho thể hiện nhiễm Listeria này Bệnh nhân có thể bị tụt huyết áp nặng với bệnh cảnh lâm
sang tương tự như trong shock nôi độc tố vi khuẩn Gram âm, là trường
hợp có thể kèm theo hội chứng suy giảm hô hấp ở người lớn
-_ Viêm màng trong tim xãy ra trên các van tim đã có tôn thương từ trước,
hay gây tình trạng nghẽn mạch hệ thống
—_ Viêm đạ dày ruột cấp tính gây tiêu chảy ở những người bị suy giảm miễn dịch
— Nhiễm khuẩn ở động vật:
s* Trong số các động vật, bệnh do Lis/eria monocyfogenes tác động chuyên biệt trên gia súc, cứu và dê với thời gian ủ bệnh từ 2-6 tuần Động vật bị
Trang 26nhiém Listeria monocytogenes chi yéu 1A qua thite 4n bi nhiém Listeria
monocytogenes, qua đường hô hấphoặc do tiếp xúc trực tiếp Sự phát bệnh
xãy ra kèm theo sự suy giảm miễn dịch đối với tác nhân gây bệnh do các
yếu tố gây stress (mang thai, sự đông đúc, sự vận chuyển, điều kiện môi trường kém) Động vật bị nhiễm bệnh do 1sferia monocyfogenes thường
sốt, biếng ăn, suy nhược và bị mất phương hướng
2.2.7.2 Các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra
— Các triệu chứng của Listeriosis thường bắt đầu xuất hiện vài ngày sau khi ăn uống phải các loại thực phẩm bị nhiễm khuẩn Tuy nhiên, có một số trường hợp thời gian kéo dài đến 2 tháng mới xuất hiện các dấu hiệu đầu
tiên của bệnh Các dấu hiệu và triệu chứng của bệnh thường gặp là: tiêu chảy, sốt 38°C ( 100,4”F) hoặc cao hơn, đau các cơ, có các cơn ớn lạnh
hoặc rung mình buôn nôn
— Nếu xuất hiện tình trang nhiém Listeria vao hé than kinh, mét sé cdc dau
hiệu bệnh và triệu chimg ciing gan tuong tw v6i nhiém Listeria khu trd
Bao gồm: sốt, đau các cơ và các cơn rung mình, ớn lạnh nhưng chúng
thường diễn biến nặng hơn các triệu chứng và bệnh lý thường có ở tình
trang lan tỏa Có những thay đổi về tâm thần Có xáo trộn về mặt nhận thức và tỉnh thần, có cơn co giật, nhứt đầu, mất thăng bằng, đau ở cô ( cô có thể bị cứng, khó chuyển động), có cơn động kinh, mất kiểm soát vận động các chỉ
2.2.8 Cơ chế gây bệnh
Trang 27a wee pee LULO-depandent destruction Wy088 independant
ol vacuolar theriyAne, ‘ale immune wctivation
‘ndependert Induction of COL2> and © MYD88 dependent, TLA-modistod 4 Diterontiation of menocytes to THDOS
-medisted recrukment of nonocyles ‘activation of monocytes ond NOS duction and bactorial kilng,
T900
Nature Reviews | Immunology
Hình 2.6 Cơ chế gây bệnh của vi khuan Listeria monocytogenes —_ Từ lâu, các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi khuan Listeria lay lan tir
tế bào này sang tế bào khác trong co thé con người
— Sau khi xâm nhập vào cơ thể qua duwong tiéu hda, Listeria monocytogenes tiếp tục di chuyển qua đạ dày rồi đi vào các mô ở ruột non của vật chủ, bao gồm các tế bào biểu mô và các đại thực bào của mảng Peyer Trong suốt quá trình di chuyền chúng sẽ không gây ra những thương tôn mô học
Trang 28nếu liều lượng không đủ lớn Trong dịch lympho hoặc máu thì Listeria
monocyfogenes dì chuyên rất nhanh đến hạch bạch huyết, lá lách và gan
rồi nhanh chóng đi sâu vào không bào, hầu hết vi khuẩn xâm nhập và phá hủy không bào nhờ kết hợp với pH thấp, các enzyme thủy phân và oxy
hóa trong không bào
Từ không bào chúng sẽ dy chuyển vào tế bào chất và nhân lên trong vòng
30 phút sau khi xâm nhiễm, từ 40-60 phút ở trong tế bào gan và đại thực bào Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hoàn thành sau 5-7 ngày Tuy nhiên, nếu không đạt được đáp ứng được miễn dịch ở tế bào bạch huyết CD8* va gamma, interferon gián tiếp hoạt hóa đại thực bào Nếu tế bào
của vật chủ không tạo ra đủ đáp ứng miễn dịch thi Listeria monocytogenes
sẽ đi chuyên đến các vị trí khác trong cơ thê như não và nhau thai Gây ra
hiện tượng sây thai ở phụ nữ, các di tat bam sinh ở trẻ em, viêm màng não,
gây tử vong cho thai nhi
Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóngtạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và đây sang tế bào liền kề
Khi đó, vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kể đó
Giáo sư Ireton và nhóm của ông đã phát hiện ra một quá trình thứ hai hổ trợ việc lây lan của vi khuân sang những tế bào khỏe mạnh mà trước đây chưa được biết đến Qúa trình này dần dần đã làm suy yếu khả năng tự vệ khỏi việc nhiễm bệnh của tế bào thir hai Vi khuan Listeria di chuyên qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người sử dụng một phần khung của tế
bàogọi là sợi actin Vi khuẩn Iis£eria có màu xanh và sới actin có màu đỏ Sợi actin hình thành một cấu trúc đạng đuôi phía sau vi khuẩn Những sợi
Trang 29actin nay, c6 téc dung day vi khuan Listeria qua té bao chat của té bào
trong cơ thé người
- Màng tế bào hay lớp ngoài cùng của tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra Tình trạng căng đó kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn /is£eria không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề
~ Tuy nhiên phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại protein trong vi khuan Listeria goi 14 InIC xuat hiện làm giảm đi độ căng
của màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc đi
chuyển của vi khuân để xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn Phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton cũng đưa ra bản báo cáo cho thấy cách mà InIC làm giảm độ căng
là ngăn chặn chức năng protein Tuba trong cơ thể người Thông thường,
chức năng của Tuba trong tế bào người không nhiễm bệnh là tạo ra độ căng của màng tế bào Protein InIC trong vi khuan Listeria da khéng ché sự hoạt động của Tuba, làm giảm độ căng và giúp vi khuẩn lây lan sang các tế bào liền kề Vi khuẩn mang mầm bệnh có thể lây lan bằng cách kiểm soát độ căng của màng tế bào trong tế bào người
2.2.9 Tinh hinh nhiém listeria monocytogenes ở Việt Nam và trên thế giới - Đến những năm 1980, thực phẩm được coi là tác nhân chính gây truyền
nhiễm Listeriosis
— Vào những năm 1981, tại Canada , một trận đại dịch từ thực phẩm đã làm ảnh hưởng đến 41 bệnh nhân là do ăn phải cải bắp lây nhiễm từ các phân
tử cừu bị nhiễm bệnh
— Vao nim 1983, ở Boston có 49 người bị nhiễm bệnh Listeriosis đo tiêu thụ
phải sữa không được tuyệt trùng kỹ lưỡng
Trang 30- Năm 1985, các trận dịch bệnh lớn xãy ra ở Bắc Mỹ tại California bắt
nguồn từ phomat mềm có 142 người bị nhiễm, những phomat khác gây ra 122 trườnghợp bị nhiễm Listeriosis ở Switzerland Trong khi ở Anh, có 300 trường hợp bị nhiễm trùng Listeriosis
- Những năm 1990, ở Pháp dịch bện xãy ra do ăn phải lưỡi lợn, thịt lợn,
phomat mềm bị nhiễm khuẩn
- Trong thời gian vừa qua, trước tình hình số lượng các mẫu cá tra đông
lạnh bi phat hién nhiém Listeria monocytogenes ngay cang gia tang, thyc hiện chỉ đạo của lãnh đạo bộ, cục quản lý chất lượng nông lâm thủy hải sản (NAFIQAD) đã có quyết định thành lập nhóm công tác chủ trì thực
hiện đề tài khoa học cấp cơ sở “Xác định nguyên nhân lây nhiễm và đề xuất giải pháp kiém xodt méi nguy hiém Listeria monocytogenes trong san phẩm cá tra đông lạnh” Ngày 6/11/2009, cục đã tô chức hội nghị nghiệm
thu đánh giá kết quả thực hiện đề tài
—_ Theo số liệu các kết quả phân tích của dé tai cho thấy 162/485 mẫu (bao
gồm 29/120 mẫu nguyên liệu được lấy tại các nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh công nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay công nhân, 24/36
mau ban thanh pham) bi phat hién nhiém Listeria monocytogenes
— Vào ngày 19/3/2007, cơ quan quản lý thực phẩm Anh quốc có lệnh thu hồi
các loại bánh mì kẹp thịt, do công ty thực phẩm Anchor cung cấp cho hệ thống bệnh viện và trường học tại Luân Đôn, đo sản phẩm này bị nhiễm vi khuan Listeria monocytogenes
— Đây không phải là lần đầu, mà từ nhiều năm qua vi khuẩn này đã gây ra
các vụ ngộ độc thực phẩm lớn tại một số quốc gia trên thế giới (Mỹ, Uc,
Canada, Pháp, Bi ) Chúng ta có thê điểm qua vài vụ ngộ độc điển hình
Trang 31như sau: Vào tháng 12 năm 1999, tại Pháp có vụ ngộ độc do ăn phải hamburger có nhiễm vi khuẩn Listeria gay cho 27 ngudi mac bénh Trong
đó, có 7 người chết Theo thống kê của Mỹ, hàng năm số bệnh lây nhiễm Listeria khoảng 2500 người, với gần 500 người chết Thống kê tại Anh từ năm 2001-2005 có 1933 người mắc bệnh do vi khuẩn Listeria gây ra
~ Trong những năm qua, những con cá hun khói, và bơ có liên quan đến dịh Listeriosis do vi khuẩn Listeria gay ra tại Thụy Điền va Finland
— Cơ quan hữu quan các nước trên từng cảnh báo về loại vi khuẩn này Đồng thời cũng đề ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt nguồn nguyên liệu thực phẩm Nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ gây ra ngộ độc thực phẩm mà quan trọng hơn là chúng gây ra các bệnh lý nguy hiểm như xảy thai, viêm màng não, nhiễm trùng huyết Thường giai đoạn ủ bệnh từ vài ngày đến 2 tháng Chính vì vậy, người ta thường không nhận biết được ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này Dấu hiệu khởi phát của bệnh là có sốt, khó chịu, đau lưng Nếu độc tố đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng nôn mủa, tiêu chảy, đau quặn bụng, nhức đầu
2.2.10 Nguyên tắc điều trị
- Mặc dù trên inviro cho thấy còn nhạy cảm với nhiều thuốc (trừ
Cephalosporin va Fosfomycin), kết quả điều trị bằng liệu phápkháng sinh trong bệnh nhiễm 1is/eriz tiến triển thường không tốt, một phần do sự chậm chễ trong việc bắt đầu điều trị bằng kháng sinh thích hợp khi chưa đưa ra được chẩn đoán sớm trong quá trình bệnh và một phần do nhiều bệnh nhân có tình trạng suy giảm mién dich Hon nita, Listeria
monocyfogenes là một loại vi khuẩn ký sinh nội tế bào không bắt buộc, và
Trang 32nhiều thuốc kháng sinh có khả năng thâm nhập bên trong tế bào kém
Thậm chí nếu có thể thâm nhập được, các thuốc này có thê không ổn định hoặc giảm hoạt tính trong điều kiện môi trường này
Khả năng thâm nhập nội bào kém và nhiều ý kiến cho rằng các B-lactam chỉ có khả năng kìm khuẩn đối với Lis/eria monocyfogenes, nhưng các aminopenicillins, amoxicillin và ampicillin được cho là các thuốc thích hợp trong các trường hợp L¿s/eria xâm nhiễm làm gây bệnh Listeriosis Mặc dù phải dùng ở liều cao hơn so với bình thường (8-12g/ngày, chia 2 lần) Nhiều tác giả khuyến cáo nên sử dụng thêm một aminoglycoside, như gentamicin 5-7mg/kg/ngày Các mô hình động vật thực nghiệm sử dụng ampicillin gắn liposomal hoặc phân tử nano cũng cho kết quả khả quan mặc dù hiện tượng này vẫn được đánh giá lại trên lâm sàng
Thời gian tối ưu của liệu pháp kháng sinh cho bệnh Listeriosis vẫn chưa được xác định, điều này phụ thuộc vào nhiều biểu hiện lâm sàng khác
nhau và các điều kiện thuận lợi để gây bệnh, nhưng nói chung được
khuyến cáo tối thiểu là 2 tuần trong nhiễm khuẩn nguyên phát và nhiễm Listeria ở phụ nữ mang thai ít nhất 3 tuần với viêm màng não và bệnh ở
trẻ sơ sinh Liệu trình ngắn hơn có thể làm bệnh tái phát Viêm màng trong tim có thể cần được điều trị tối 6 tuần
Với những bệnh nhân không dung nạp với ampicillin +/- aminoglycoside, cotrimoxazole được coi là liệu pháp thay thế chấp nhận được
Việc lựa chọn kháng sinh cho bệnh nhân trong trường hợp không dung nạp với cả ampicillin và cotrimoxazole là một vấn đề khó khăn Điều trị bằng Vancomycin cũng cho kết quả kém, và mặc dù các thuốc khác như carbapenem, fluoroquinolone thế hệ mới hơn, linezelid va
Trang 33quinupristin/dalfopristin có hoạt tính tốt trên invitro chống lai Listeria monocyfogenes, nhưng kinh nghiệm với những thuốc này trên lâm sàng
vẫn còn rất hạn chế
Kháng kháng sinh mắc phải ở các chủng phân lập trên lâm sàng tương đối hiếm gặp, mặc dù kháng tetracycline ở các chủng mang gen tetM đã được ghi nhận với khả năng kháng thuốc qua plasmid Với nhiều loại kháng sinh khác cơ chế đề kháng qua trung gian plasmid cũng đã được ghi nhận 2.2.11 Cách phòng ngừa
Giữ thức ăn ngoài giới hạn của vùng nhiệt độ nguy hiểm từ 4°C đến 60°C
Thức ăn nào cần giữ lạnh thì phải giữ ở nhiệt độ 4”C hoặc thấp hơn, còn
những thức ăn nóng thì phải giữ ở nhiệt độ trên 60°C trở lên Nấu chín toàn bộ thức ăn tươi có nguồn gốc từ động vật
Giữ vệ sinh tối đa lúc nâu nướng hay chuẩn bị bữa ăn Chùi rita dung cụ,
dao, thớt bằng dung dịch Javel pha loãng trong nước
Cần thận với các loại cá và đồ biển hun khói
Rửa tay bằng savon
Thường xuyên chùi rữa, tẩy trùng tủ lạnh Không nên dung thực phẩm có mùi lạ
Không dung thực phẩm quá thời hạn sử dụng
Không để thực phẩm tươi sống chung với thức ăn đã nấu chin Thức ăn nấu chín dung ngay không để lâu ngày trong tủ lạnh
Rữa kỹ thức ăn trước khi sử dụng
Giữ thức ăn đã được nấu chín tách biệt khỏi rau, thực phẩm chưa chế biến
Trang 34CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUÂN L.MNOCYTOGENES
3.1 Phương pháp xác định truyền thống
3.1.1 Nguyên lý và phương pháp
Sử dụng phương pháp cấy đếm Iisteria monocyfogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 48h chọn các khuan lac nghi ngd khang dinh Listeria monocytogenes bang cdc thir
nghiệm sinh hóa
3.1.2 Phạm vi phát hiện vi khuẩn
Phát hiện sy hién dién cua vi khuan Listeria monocytogenes trong thủy san
3.1.3 Dụng cụ sử dụng
Mẫu thực phẩm cần kiểm tra
Bình tam giác 500ml, ống lên men (Durham) Tủ ám 30-50°C Que cấy vòng Que cấy thẳng Kính hiển vi Đĩa petri Pipettes 25,10 va Iml ống nghiệm có nắp đậy 3.1.4.Môi trường để nuôi cấy
Canh tăng sinh sơ cấp Listeria Enrichment Broth I(LB I) Canh tăng sinh thứ cấp Listeria Enrichment Broth II (LB II)
Trang 35-_ Môi trường Enrichment Broth (EB) cải tiến từ môi trường LB, được sử
dụng trong môi trường tăng sinh từng giai đọan -_ Môi trường Oxford Agar, nôi trường Palcam Agar
-_ Thạch máu
-_ Môi trường thạch mềm BHI
Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR) Thuốc thử catalase, oxidase
3.1.5.Quy trình phân tích vi khuẩn Listeria Monocyfogenes 3.1.5.1 Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes
Trang 36Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml LB I, ủ ở 30°C, 24h J Cấy 0.1ml canh khuẩn sang 10ml môi trường LB II ủ ở 30°C,24h r Ria 1én dia Oxford Agar hoac dia Palcam Agar, ủ ở 30°C, 48h Ỷ Chọn các khuẩn lạc đặc trung cua Listeria Ria lén dia thach TSA, ủ qua đêm r vy | Ỷ
CAMP Thạch Thạch Soi Thử Thử Canh Canh
với máu,ở | mềm,ủ | canh nghiệm || nghiệm | RPR, XPR,