Tách dòng và đánh giá mức độ khoáng hóa xương của cá medaka chuyển gen rankl HSE CFP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Thanh TÁCH DÕNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KHỐNG HĨA XƢƠNG CỦA CÁ MEDAKA CHUYỂN GEN rankl:HSE:CFP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Thanh TÁCH DÕNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KHỐNG HĨA XƢƠNG CỦA CÁ MEDAKA CHUYỂN GEN rankl:HSE:CFP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Tô Thanh Thúy TS Trần Đức Long Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Tô Thanh Thúy TS Trần Đức Long, thầy cô ngƣời hƣớng dẫn tơi thực khóa luận tốt nghiệp Đại học luận văn cao học Thầy cô hết lịng giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình, truyền đạt kiến thức nhƣ kinh nghiệm làm việc động viên suốt thời gian học tập, nghiên cứu khoa học hồn thành luận văn Trong q trình làm việc, nhận đƣợc lời nhận xét, góp ý q báu từ thầy để thực tốt nghiên cứu Khơng vậy, thầy cô giúp đỡ nhiều sống Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn GS Christoph Winkler cung cấp dòng cá, thiết bị hóa chất thí nghiệm để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Lai Thành, PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, chia sẻ kinh nghiệm nuôi cá, hỗ trợ thiết bị kính hiển vi cần thiết cho q trình nghiên cứu học tập Tôi chân thành cảm ơn thầy cán nhân viên Phịng thí nghiệm Tế bào hết lòng bảo tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian tơi hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Hồng Thái, TS Đỗ Minh Hà cho bảo, góp ý q báu, thầy cán nhân viên, sinh viên Phịng thí nghiệm Proteomic Sinh học cấu trúc giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành tốt nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cơng tác môn Sinh lý học Sinh học ngƣời, TS Vũ Thị Thu, ThS Phạm Trọng Khá dẫn, giúp đỡ nhƣ thầy cô Khoa Sinh học truyền đạt cho kiến thức sở để tơi thực đƣợc luận văn nhƣ vận dụng công việc sau Tơi xin cảm ơn tập thể sinh viên phịng thí nghiệm “Gia đình cá medaka”, đặc biệt CN Phạm Văn Cƣờng, sinh viên Nguyễn Thùy Linh bên cạnh giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian tơi thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, anh chị em, ngƣời cổ vũ động viên giúp đỡ Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ ngƣời thân gia đình giúp đỡ, tạo điều kiện cho đƣợc học tập nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc thực dựa kinh phí hỗ trợ từ đề tài QG 14.21 Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Phạm Thị Thanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng – TỔNG QUAN 1.1 RANKL VÀ BỆNH LOÃNG XƢƠNG 1.1.1 Cân nội mơ xƣơng q trình tái tạo xƣơng 1.1.2 Bệnh loãng xƣơng 1.1.3 RANKL kích thích hình thành, biệt hóa hoạt động tế bào hủy xƣơng 1.2 CÁC MƠ HÌNH ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH LOÃNG XƢƠNG 1.3 CÁ MEDAKA LÀM MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH LỖNG XƢƠNG 1.3.1 Giới thiệu chung cá medaka 1.3.2 Cá medaka làm mô hình cho nghiên cứu xƣơng 1.4 CÁ MEDAKA CHUYỂN GEN rankl:HSE:CFP LÀM MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH LOÃNG XƢƠNG 10 1.5 TÍNH CẤP THIẾT CỦA VIỆC TẠO CÁC DÕNG CÁ CHUYỂN GEN rankl:HSE:CFP ĐỒNG ĐỀU VỀ DI TRUYỀN VỚI GEN CHUYỂN 12 1.5.1 Các cá thể cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu có mức độ tổn thƣơng xƣơng khơng đồng có đặc điểm di truyền gen chuyển khác 12 1.5.2 Cá dị hợp tử đoạn chèn với gen chuyển rankl:HSE:CFP đƣợc dùng làm nguồn để tạo dòng cá đồng di truyền kiểu hình lỗng xƣơng 14 1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP, KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ XƢƠNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA THUỐC VÀ HOẠT CHẤT CHỐNG LOÃNG XƢƠNG .16 1.7 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 19 Chƣơng – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .20 2.2 Thiết bị, dụng cụ dùng nghiên cứu 20 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 20 2.2.2 Các phần mềm dùng nghiên cứu, viết luận văn 22 2.3 Hóa chất dùng nghiên cứu .22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Phƣơng pháp ni trì dịng cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP 24 2.4.2 Phƣơng pháp lai phân tách dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu 27 2.4.3 Cách đặt tên cá cho phép lai 27 2.4.4 Phƣơng pháp sốc nhiệt .28 2.4.5 Phƣơng pháp nhuộm xƣơng ấu trùng cá 28 2.4.6 Phƣơng pháp chụp ảnh xử lý hình ảnh 30 2.4.7 Phân tích thống kê 31 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 LAI TÁCH TẠO ĐƢỢC BỐN DÕNG CÁ MEDAKA MANG MỘT ĐOẠN CHÈN VỚI GEN CHUYỂN rankl:HSE:CFP .32 3.1.1 Lai ngoại phối cá rankl:HSE:CFP hệ F0 32 3.1.2 Kết lai phân tích hệ F1, F2 hai cá c7F0 d1F0 khẳng định hai cá thể cá dị hợp tử với đoạn chèn gen chuyển .34 3.1.3 Lai phân tích hệ F1, F2 F3 cá c9F0 d4F0 tìm hai cá thể c9d1F1 d4d1F1 cá dị hợp tử đoạn chèn với gen chuyển 37 3.2 SỰ BIỂU HIỆN HUỲNH QUANG CFP VÀ KIỂU HÌNH GIỐNG LỖNG XƢƠNG CỦA BỐN DÕNG CÁ c7, c9d1, d1, d4d1 41 3.2.1 Sự biểu huỳnh quang CFP 41 3.2.2 Kiểu hình giống lỗng xƣơng bốn dòng cá c7, c9d1, d1, d4d1 43 3.2.3 Tổng kết kết lai tách dòng cá rankl:HSE:CFP 52 3.3 PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ KHỐNG HĨA VÀ MỨC ĐỘ TỔN THƢƠNG XƢƠNG CỦA ẤU TRÙNG CÁ 52 3.3.1 Phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp mức độ khống hóa tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá bị tổn thƣơng cung xƣơng thần kinh – Phƣơng pháp Im cung thần kinh 53 3.3.2 Phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp mức độ khống hóa tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá bị tổn thƣơng thân đốt sống – Phƣơng pháp Im thân đốt sống 62 3.3.3 Tổng kết bàn luận kết xây dựng phƣơng pháp định lƣợng mức độ khống hóa mức độ tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá 68 KẾT LUẬN .70 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình số Tên hình Trang Q trình tái tạo xƣơng với giai đoạn: hoạt hóa Hình 1.1 (activation), hủy xƣơng (resorption), trung gian (reversal), tạo xƣơng (bone formation) khống hóa (mineralization) Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 RANKL đƣợc tạo từ tế bào tạo xƣơng kích thích biệt hóa hoạt động tế bào hủy xƣơng Cá medaka (Oryzias latipes) Cấu trúc gen chuyển rankl:HSE:CFP hệ gen cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP Kiểu hình lỗng xƣơng ấu trùng cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP Sự không đồng di truyền với gen chuyển cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu 10 11 13 Các kiểu gen với gen chuyển (kí hiệu đoạn màu xanh Hình 1.7 tím than) có hệ F1 lai ngoại phối cá 15 rankl:HSE:CFP ban đầu (F0) với cá chủng dại Tỉ lệ phân ly 1:1 gen chuyển theo Men đen cá F2 Hình 1.8 lai phân tích cá thể F1 dị hợp tử đoạn chèn gen 16 chuyển với cá chủng dại Hình 2.1 Khay ni cá medaka có thiết bị lọc nƣớc nhỏ, rong rêu, ốc 25 Hình 2.2 Bộ kit huỳnh quang 30 Hình 2.3 Lam kính dùng để làm tiêu ấu trùng cá nhuộm xƣơng để chụp ảnh 31 Hình 3.1 Các mức độ biểu CFP phơi từ bốn dịng cá c7, 42 c9d1, d1, d4d1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Sự khống hóa xƣơng ấu trùng cá đối chứng 11 ngày tuổi Sự tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá dòng c7 11 ngày tuổi Sự tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá dòng c9d1 11 ngày tuổi Sự tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá dòng d1 11 ngày tuổi Sự tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá dòng d4d1 11 ngày tuổi So sánh kiểu hình lỗng xƣơng bốn dịng cá c7, c9d1, d1, d4d1 Hình ảnh đo chiều dài cung xƣơng thần kinh ấu trùng cá 11 ngày tuổi phần mềm ImageJ 44 45 46 48 49 51 54 Giao diện phần mềm ImageJ với tính “Segmented Hình 3.9 Line” (A), ROI Manager (B) bảng kết đo chiều dài 56 cung xƣơng thần kinh (C) Phần cột sống ấu trùng cá medaka 11dpf nhuộm với Hình 3.10 Alizarin Red đƣợc chụp hai tƣ mặt bên trái phải để 57 đo độ dài cung thần kinh bên Hình 3.11 Hình 3.12 Chỉ số khống hóa Im dịng cá đƣợc đo tính dựa theo phƣơng pháp Im ((*) p < 0,0001) Chỉ số tổn thƣơng xƣơng H ba dòng cá c7, c9d1 d1 60 61 Các diện tích xƣơng khống hóa thân đốt sống đƣợc đo Hình 3.13 phần mềm ImageJ hình ảnh chụp mặt bên với độ phóng đại 10x 15 đốt sống đầu cột sống ấu trùng cá 64 đối chứng cá dòng d4d1 đƣợc nhuộm với Alizarin Red Giao diện phần mềm ImageJ với tính “Polygon Hình 3.14 selection” (A), ROI Manager (B) bảng kết diện tích 66 khống hóa (C) Hình 3.15 Chỉ số khống hóa dịng cá d4d1 đƣợc đo tính dựa theo phƣơng pháp Im thân đốt sống ((*) p < 0,0001) 67 Phụ lục 01 Bảng 1: Kết lai ngoại phối hệ F1 cá c9F0 Cá thể F1 Tổng số phôi (F2) CFP+ CFP- c9c1F1 40 20 32 c9c2F1 68 63 c9c3F1 135 95 40 c9c4F1 35 16 19 c9d1F1 415 212 193 c9d2F1 85 55 30 c9d3F1 97 71 26 i Bảng 2: Kết lai ngoại phối hệ F1 cá d4F0 Cá thể F1 Tổng số phôi (F2) CFP+ CFP- d4d1F1 340 173 167 d4d2F1 98 23 75 d4d3F1 191 176 15 d4d4F1 76 39 37 d4d5F1 81 30 51 d4c1F1 79 30 49 d4c2F1 76 52 24 d4c3F1 133 92 41 d4c4F1 134 59 75 d4c5F1 40 20 20 ii Phụ lục 02 Hình ảnh biểu tín hiệu huỳnh quang CFP đồng phơi cá dịng ngày tuổi từ bốn dịng c7, c9d1, d1 d4d1 (A): phơi thu từ dịng d4d1 (B): phơi thu từ dịng d1 (C): phơi thu từ dịng c9d1 (D): phơi thu từ dịng c7 iii Phụ lục 03 Hình ảnh số cấu trúc xƣơng phần đầu bốn dòng cá phân tách (c7, c9d1, d1, d4d1) bị tổn thƣơng Hình 1: Xƣơng đỡ nắp mang (cleithrum) bị tổn thƣơng ấu trùng cá bốn dòng c7, c9d1, d1, d4d1 đƣợc quan sát hai bên trái phải Hàng trên: hình chụp mặt bên trái xƣơng đỡ nắp mang; Hàng dƣới: hình chụp mặt bên phải xƣơng đỡ nắp mang (A, A’): ấu trùng cá đối chứng cho thấy cấu trúc xƣơng cleithrum nguyên vẹn (B, B’): xƣơng cleithrum ấu trùng cá dòng d4d1 bị tổn thƣơng nghiêm trọng nhất, bị hoàn toàn hai bên (C, C’): xƣơng cleithrum ấu trùng cá dòng d1 bị mảnh bị phần cấu trúc (D, D’): xƣơng cleithrum ấu trùng cá dòng c9d1 bị phần cấu trúc (E, E’): xƣơng cleithrum ấu trùng cá dòng c7 bị đứt gãy cấu trúc iv Hình 2: Hình ảnh cấu trúc xƣơng parasphenoid (ps) bị tổn thƣơng bốn dịng cá c7 (Hình E), dịng c9d1 (Hình D), dịng d1 (Hình C), dịng d4d1 (Hình B) so với cá đối chứng (Hình A) v Phụ lục 04 Bảng 1: Tổng chiều dài cung xƣơng thần kinh hai tƣ mặt bên trái phải ấu trùng cá đối chứng STT ấu Im mặt trái trùng Im mặt STT ấu phải trùng Im mặt trái Im mặt phải 3022,821 3102,412 17 3209,888 3280,321 2620,240 2604,736 18 3572,758 3494,902 2864,798 2887,092 19 3203,581 3214,569 3120,816 3069,540 20 2887,093 2871,963 3278,798 3204,112 21 3072,867 3128,540 2955,249 2894,429 22 3013,253 3054,017 2451,028 2422,876 23 2256,275 2242,816 2176,017 2062,888 24 2971,965 2864,798 3278,040 3224,543 25 2825,647 2814,028 10 3476,405 3468,921 26 2650,514 2644,257 11 3170,508 3021,924 27 2506,175 2519,184 12 2543,024 2654,902 28 3344,957 3302,974 13 3376,666 3312,563 29 2645,158 2624,816 14 2517,878 2647,022 30 3103,770 3209,211 15 3015,540 3120,677 31 2536,736 2498,922 16 3176,808 3202,854 32 3030,285 3118,276 vi Bảng 2: Tổng diện tích vùng thân đốt sống nguyên vẹn hai tƣ mặt bên trái phải ấu trùng cá đối chứng STT ấu Im mặt trái trùng Im mặt STT ấu phải trùng Im mặt trái Im mặt phải 442565 406745 17 419568 407451 322874 321826 18 392376 450698 370278 368900 19 419909 434822 377094 366180 20 406241 389928 432244 443867 21 371030 367251 469928 482481 22 445282 434176 447253 444373 23 370979 371461 392629 416727 24 388256 431812 291666 316331 25 395458 395956 10 389608 391503 26 480875 475108 11 438966 447606 27 389179 393541 12 364222 366101 28 398985 417887 13 468296 466207 29 363965 373498 14 395956 365325 30 333718 333124 15 418418 417185 31 393238 406745 16 440709 435228 32 375881 402868 33 467478 467369 vii Phụ lục 05 Bảng 1: Chỉ số khống hóa hai tƣ mặt bên trái phải ấu trùng cá dòng c7 STT ấu Im mặt trái trùng Im mặt STT ấu phải trùng Im mặt trái Im mặt phải 967,428 937,139 19 996,105 1013,678 1370,653 1277,703 20 1301,161 967,308 958,645 1164,665 21 1170,044 1201,645 1225,718 1055,443 22 940,946 937,308 924,434 922,909 23 975,582 907,085 948,274 955,904 24 1271,927 1489,750 899,278 914,381 25 1026,333 1052,247 937,947 960,949 26 1000,508 998,163 1669,546 1634,499 27 1247,837 1131,732 10 1401,048 1164,137 28 1117,923 1866,647 11 1505,405 1359,399 29 1022,217 884,529 12 1065,802 999,378 30 1483,426 1594,520 13 844,741 885,221 31 1252,166 1282,587 14 1113,568 1261,367 32 1623,822 1463,173 15 1238,506 1095,411 33 1042,171 1038,354 16 1255,132 1545,063 34 1120,423 1002,726 17 1326,141 1394,919 35 924,189 967,452 18 876,779 901,886 36 1207,722 1129,378 37 899,521 926,481 38 1256,734 1292,124 viii Bảng 2: Chỉ số khoáng hóa hai tƣ mặt bên trái phải ấu trùng cá dòng c9d1 STT ấu Im mặt trái trùng Im mặt STT ấu phải trùng Im mặt trái Im mặt phải 321,217 316,394 19 555,299 534,028 405,963 449,505 20 506,918 517,698 324,095 350,254 21 404,674 492,906 426,901 417,085 22 391,185 436,629 342,045 369,043 23 527,641 514,094 391,193 405,769 24 521,304 512,452 438,016 458,216 25 441,985 463,589 513,777 475,946 26 586,942 545,749 541,049 490,091 27 392,144 389,701 10 390,413 371,988 28 445,269 467,966 11 488,999 486,346 29 473,970 479,369 12 533,603 512,382 30 522,939 493,761 13 358,299 378,164 31 381,809 375,617 14 438,777 413,874 32 356,493 408,422 15 393,632 390,984 33 367,255 361,815 16 419,048 475,150 34 385,532 425,108 17 389,479 456,758 35 457,628 426,742 18 538,862 569,777 ix Bảng 3: Chỉ số khống hóa hai tƣ mặt bên trái phải ấu trùng cá dòng cá d1 STT ấu Im mặt trái trùng Im mặt STT ấu phải trùng Im mặt trái Im mặt phải 123,350 186,055 18 74,794 154,236 118,529 19 124,839 94,149 151,243 238,411 20 133,796 87,500 200,230 99,030 21 260,882 72,879 109,490 58,008 22 311,823 217,637 53,307 23 50,289 33,838 24 65,622 65,756 106,308 25 52,557 77,527 32 26 0 10 60,934 222,113 27 0 11 0 28 92,713 76,226 12 0 29 0 13 0 30 0 14 0 31 0 15 0 32 0 16 0 33 0 17 0 34 0 x Bảng 4: Chỉ số khống hóa hai tƣ mặt bên trái phải ấu trùng cá dòng cá d4d1 STT ấu Im mặt trái trùng Im mặt STT ấu phải trùng Im mặt trái Im mặt phải 297585 261765 17 257551 252300 242739 228604 18 230234 291485 311695 301642 19 229686 244599 329171 319696 20 272807 256494 311702 326101 21 234816 231037 438276 346771 22 265347 254241 274491 241707 23 234791 229273 238839 260757 24 253265 296821 212616 227758 25 280900 271398 10 258397 217091 26 374748 339981 11 253926 297135 27 274244 266606 12 283982 274836 28 305810 297712 13 300476 290119 29 239722 232255 14 229679 214308 30 197263 208669 15 284921 300379 31 245592 254099 16 358104 355245 32 239426 255222 33 286864 330301 xi Phụ lục 06 TỔNG QUAN PHÉP LAI PHÂN TÁCH BỐN DÕNG CÁ c7, c9d1, d1 d4d1 Cá thể cá c7F0 mang gen chuyển rankl:HSE:CFP đƣợc ngoại phối với cá chủng dại (Hình 1) Ngay từ hệ (F0), cá thể đƣợc chứng minh dị hợp tử cặp gen thông qua phép kiểm định thống kê Khi bình phƣơng, kết đƣợc khẳng định lại chắn qua hệ (F1, F2) (Hình 1) Đây dịng cá có mức độ biểu CFP yếu tƣơng ứng với kiểu hình lỗng xƣơng nhẹ Hình 1: Tổng quan phép lai dùng để phân tách đƣợc dòng cá c7 Cũng giống nhƣ cá thể c7F0, cá c9F0 mang gen chuyển rankl:HSE:CFP đƣợc ngoại phối với cá đực chủng dại (Hình 2) Tuy nhiên, hệ F0, hầu hết phôi thu đƣợc biểu tín CFP nên phải đến hệ F1 xác định đƣợc cá thể c9d1F1 dị hợp tử kiểu gen kiểu hình (đối với gen chuyển) (Hình 2) Kết đƣợc khẳng định qua hai hệ (F2, F3) Mặc dù, c9d1 dòng cá biểu mức độ CFP yếu nhƣng tín hiệu CFP quan sát đƣợc kiểu hình lỗng xƣơng lại mạnh dịng cá c7 xii Hình 2: Tổng quan phép lai dùng để phân tách đƣợc dòng cá c9d1 Cá thể cá đực d1F0 mang gen chuyển đƣợc ngoại phối với cá chủng dại để xác định kiểu gen (đối với gen chuyển) (Hình 3) Ở hệ F0, cá thể biểu kiểu gen dị hợp tử, đƣợc khẳng định hai hệ sau (F1, F2) (Hình 3) Dịng cá d1F0 phân tách đƣợc biểu mức độ CFP tƣơng ứng với kiểu hình lỗng xƣơng mạnh hai dịng cá c7F0 c9F0 Hình 3.10: Tổng quan phép lai dùng để phân tách đƣợc dòng cá d1 xiii Cá thể cá đực d4F0 mang gen chuyển rankl:HSE:CFP đƣợc ngoại phối với cá chủng dại (Hình 4) Cũng giống nhƣ cá thể c9F0, hệ F0, tất phôi thu đƣợc phép lai phân tích cá thể d4F0 biểu tín hiệu CFP Tuy nhiên, hệ F1, xác định đƣợc cá thể d4d1F1 biểu kiểu gen dị hợp tử kết đƣợc khẳng định lại thông qua hai phép lai hệ sau (F2, F3) (Hình 4) Dịng cá d4d1 có tín hiệu CFP mạnh nhất, tƣơng ứng với kiểu hình lỗng xƣơng nặng Hình 4: Tổng quan phép lai dùng để phân tách đƣợc dòng cá d4d1 Nhƣ vậy, từ cá thể cá mang gen chuyển rankl:HSE:CFP ban đầu, phép lai phân tích cá mang gen chuyển cá chủng dại, chúng tơi phân tách đƣợc bốn dịng cá dị hợp tử khác kiểu gen kiểu hình (đối với gen chuyển) Bốn dòng cá phân tách đƣợc có mức độ biểu CFP, Rankl kiểu hình loãng xƣơng khác biểu mức Rankl khác dòng xiv Phụ lục 07 Xƣơng bị phá hủy nhiều 15 đốt sống xv ... đề tài ? ?Tách dòng đánh giá mức độ khống hóa xƣơng cá medaka chuyển gen rankl: HSE: CFP? ?? với hai mục tiêu chính: Tách dịng cá chuyển gen rankl: HSE: CFP ban đầu thành số dòng cá, dịng gồm cá thể có... phân tách dòng cá chuyển gen rankl: HSE: CFP ban đầu Dòng cá medaka chuyển gen rankl: HSE: CFP ban đầu đƣợc lai ngoại phối với cá chủng dại để phân tách gen chuyển vào cá thể cá hệ F1 Những cá thể... biệt hóa hoạt động tế bào hủy xƣơng Cá medaka (Oryzias latipes) Cấu trúc gen chuyển rankl: HSE: CFP hệ gen cá medaka chuyển gen rankl: HSE: CFP Kiểu hình lỗng xƣơng ấu trùng cá medaka chuyển gen rankl: HSE: CFP