1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Nghiên cứu và phát triển kit chẩn đoán đồng thời các genotype HPV nguy cơ cao và thấp bằng kỹ thuật realtime PCR

84 11 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 84
Dung lượng 2,06 MB

Nội dung

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Ngô Thị Hồng NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KIT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC KIỂU GEN HPV NGUY CƠ GÂY UNG THƢ BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL TIME PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, năm 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Ngô Thị Hồng NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KIT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC KIỂU GEN HPV NGUY CƠ GÂY UNG THƢ BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL TIME PCR Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội, năm 2018 LỜI CẢM ƠN Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh, ngƣời thầy tận tình bảo, hƣớng dẫn suốt thời gian học tập thực luận văn Tôi xin đƣợc trân trọng cảm ơn tới thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học, đặc biệt thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy dìu dắt suốt thời gian học tập trƣờng Tôi xin đƣợc cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo, anh chị, bạn, em, đặc biệt CN Chu Văn Sơn CN Trần Thị Ngọc Ánh, Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi q trình học tập thực luận văn phịng Tơi xin đƣợc bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến ban lãnh đạo Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh (trƣớc Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh Bắc Ninh) tạo điều kiện thuận lợi cho tơi để hồn thành khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn cơng ty cổ phần ANABIO R&D hỗ trợ kinh phí để thực nghiên cứu này, cảm ơn Bệnh viện Phụ sản Trung ƣơng, Bệnh viện Da Liễu Trung Ƣơng, Học viện Quân Y Bệnh viện Bạch Mai cung cấp mẫu tham chiếu cho nghiên cứu Cuối cùng, tơi vơ biết ơn gia đình bạn bè ln khích lệ, động viên tơi suốt thời gian qua Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Ngô Thị Hồng BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt HPV Human Papillomavirus Papillomavirus gây bệnh ngƣời ADN/ARN (Deoxi)ribonucleic acid Vật chất di truyền Primer - Mồi Probe - Đầu dò gắn huỳnh quang VLP Virus Like Particle Hạt giả virus ORF Open Reading Frame Khung đọc mở gen LRC Long Control Region Vùng kiểm soát dài gen URR Upstream Regulatory Vùng điều hòa gen Region ORI Origin Vị trí khởi đầu tái ATP Adenosine Triphosphat Phân tử mang lƣợng NST - Nhiễm sắc thể Hr-HPV High risk HPV Nhóm HPV nguy cao Lr-HPV Low risk HPV Nhóm HPV nguy thấp PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase (phản ứng khuếch đại gen) FDA ELISA Food and Drug Cục quản lý thực phẩm dƣợc Administration phẩm Hoa Kỳ Enzyme-Linked Kỹ thuật miễn dịch Enzyme ImmunoSorbent Assay UTCTC - Ung thƣ cổ tử cung CDC Centers for Disease Control Trung tâm kiểm soát bệnh tật USA United States of America Hoa Kỳ MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu HPV 1.1.1 Tình hình nhiễm HPV giới Việt Nam 1.1.2 Đặc điểm hình thái HPV 1.1.3 Đặc điểm hệ gen HPV 1.1.4 Phân loại HPV 12 1.1.5 Đƣờng lây truyền HPV .14 1.1.6 Chu kỳ nhân lên HPV .15 1.1.7 Các bệnh lý HPV gây nên 16 1.2 Các phƣơng pháp xét nghiệm HPV 18 1.2.1 Các phƣơng pháp xét nghiệm protein virus 18 1.2.2 Phƣơng pháp phát gen virus .19 1.2.3 Tình hình nghiên cứu phƣơng pháp chẩn đốn HPV giới Việt Nam 25 1.3 Đề xuất nghiên cứu 27 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.1.2 Đạo đức nghiên cứu .29 2.1.3 Kit vật tƣ tiêu hao .31 2.1.4 Máy móc thiết bị .31 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 2.2.1 Nghiên cứu phát triển phƣơng pháp phát đồng thời 14 kiểu gen HPV nguy cao kiểu gen nguy thấp (6, 11) kỹ thuật multiplex real time PCR .32 2.2.2 Đánh giá tƣơng đồng kit chế tạo với kit thƣơng mại 42 2.2.3 Thử nghiệm khả ứng dụng kit phát kiểu gen HPV mẫu bệnh nhân 43 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Nghiên cứu phát triển phƣơng pháp phát đồng thời type HPV nhóm nguy cao phổ biến nhóm nguy thấp kỹ thuật multiplex real time PCR 45 3.1.1 Phản ứng PCR khuếch đại trình tự đích 45 3.1.2 Nhân dòng trình tự đích tạo chứng dƣơng 46 3.1.3 Xác định tính đặc hiệu mồi đầu dò phản ứng real time PCR 47 3.1.4 Xác định ngƣỡng phát phản ứng tối ƣu nồng độ chuẩn dƣơng .50 3.1.5 Xác định độ đặc hiệu phản ứng 55 3.1.6 Bộ kit hoàn chỉnh 57 3.3 Thử nghiệm khả ứng dụng kit phát kiểu gen HPV mẫu bệnh nhân 62 KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Phụ lục 1: Phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu 72 Phụ lục 2: Danh mục trình tự tham chiếu genome HPV tạo sở liệu trình tự HPV 74 Phụ lục 3: Kết giải trình tự gen số type HPV đại diện đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng kit 75 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tổng hợp chức gen HPV 11 Bảng 1.2 Tổng hợp bệnh lý HPV gây nên [31] .18 Bảng 1.3 Đặc điểm phƣơng pháp phát HPV [43] .25 Bảng 2.1: Trình tự đoạn mồi đầu dò đƣợc sử dụng phản ứng real time PCR phát kiểu gen HPV .33 Bảng 2.2: Thành phần mastermix phản ứng PCR nhân đoạn gene đặc hiệu cho kiểu gen HPV 35 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đoạn gene đặc hiệu cho kiểu gen HPV 35 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng nhân dòng .36 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR kiểm tra plasmid mang đoạn chèn .37 Bảng 2.6: Thành phần kỹ thuật real time PCR đơn cặp mồi đầu dò .38 Bảng 2.7 Thiết kế phản ứng real time PCR phát 14 type HPV nguy cao type HPV nguy thấp .39 Bảng 2.8: Thành phần kỹ thuật real time PCR đa cặp mồi đầu dị 39 Bảng 2.9: Chu trình nhiệt phản ứng real time PCR nhƣ sau 39 Bảng 2.10: Thành phần dự kiến kit hoàn chỉnh .41 Bảng 2.11: So sánh tƣơng đồng kit nghiên cứu kit thƣơng mại 43 Bảng 3.1: Kết kiểm tra tính đặc hiệu mồi đầu dò phản ứng 50 Bảng 3.2: Kết real time PCR xác định ngƣỡng phát type HPV 53 Bảng 3.3 : Kết thí nghiệm xác định độ đặc hiệu phƣơng pháp 56 Bảng 3.4: So sánh phƣơng pháp xây dựng với sinh phẩm thƣơng mại 61 Bảng 3.5: Sự tƣơng đồng kit nghiên cứu kit thƣơng mại 62 Bảng 3.6 Thử nghiệm kit xây dựng mẫu bệnh nhân 62 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Tỷ lệ mắc ung thƣ cổ cung (theo độ tuổi/100.000 dân) giới Hình 1.2 Hạt virus HPV Hình 1.3 Sơ đồ gen HPV .6 Hình 1.4: Cây phát sinh lồi Papilomavirus dựa trình tự gen vùng L1 .13 Hình 1.5 Chu kỳ nhân lên HPV 16 Hình 1.6 Phƣơng pháp lai phân tử phát HPV 21 Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự 16 type HPV cặp mồi đặc hiệu .45 Hình 3.2: Hình ảnh kết khuẩn lạc E.coli mang đoạn gen HPV 46 Hình 3.3 Ảnh điện di kiểm tra kết nhân dịng trình tự đích mồi vector 47 Hình 3.4 Đƣờng tín hiệu huỳnh quang kiểm tra tính đặc hiệu mồi đầu dị phản ứng .49 Bảng 3.1: Kết kiểm tra tính đặc hiệu mồi đầu dị phản ứng 50 Hình 3.5 Đƣờng chuẩn biểu diễn đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR biểu đồ tƣơng quan tuyến tính chu kì ngƣỡng số plasmid 52 Hình 3.6: Đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR mẫu đối chứng dƣơng tƣơng 54 Hình 3.7 Đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu 55 Hình 3.8 Bộ kit HPV Genotypes qPCR mini kit 57 MỞ ĐẦU Human papillomavirus (HPV) nguyên nhân gây bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục phổ biến nam phụ nữ giới đƣợc cho nguyên nhân gây bệnh virus lây truyền phổ biến Hoa Kỳ [20] Hơn 200 kiểu gen HPV đƣợc xác định sở liệu trình tự ADN cho thấy khác biệt gen Dựa liên quan chúng với ung thƣ tổn thƣơng tiền thân, HPV đƣợc xếp vào nhóm HPV nguy gây ung thƣ cao (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , 66, 68, 70) HPV nguy gây ung thƣ thấp (HPV 6, 11, 42, 43, 44) [20] Một số chứng lâm sàng, dịch tễ học, phân tử thực nghiệm thiết lập mối quan hệ bệnh học số kiểu gen HPV ung thƣ giới Nhiễm HPV nguy cao kết gây nên tổn thƣơng tiền ung thƣ làm tăng nguy ung thƣ cổ tử cung, âm hộ, âm đạo, dƣơng vật, hậu môn, miệng cổ họng [9, 17, 18, 37, 44, 47] Đồng thời, HPV nguyên nhân nhiều bệnh lý lâm sàng da niêm mạc nhƣ hạt cơm, sùi mào gà sinh dục - hậu môn, u nhú quản trẻ sơ sinh [26] Tỷ lệ nhiễm HPV tồn cầu ƣớc tính 11,7% Châu Phi (24%), Đông Âu (21,4%) Mỹ Latin (16,1%) vùng tỷ lệ nhiễm cao Đặc biệt, nhiễm HPV có đỉnh độ tuổi trẻ 25 tuổi [12] Tại Việt Nam nghiên cứu Cao Minh Nga cộng (2011) phụ nữ đến khám có bệnh lý sinh dục nhƣng tế bào học bình thƣờng bệnh viện Đại học Y dƣợc thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi từ 18 - 69 cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV 19,79%, tỷ lệ đồng nhiễm từ type HPV trở lên 40,31%, tỷ lệ nhiễm type HPV nguy cao 63,57%, nhóm vừa nguy cao nguy thấp 20,54%, type nguy thấp 15,89% [1] HPV tiếp tục chủ đề quan trọng tỷ lệ nhiễm virus tiếp tục tăng nhanh, tỷ lệ đồng nhiễm cao (20 - 30%) nhiều ảnh hƣởng virus đến sức khỏe ngƣời đƣợc cơng bố Tầm sốt dự phịng HPV vắc xin đƣợc triển khai nhiều quốc gia giới từ năm 2006 Tháng 12/2014, vắc xin Gardasil đƣợc FDA (Hoa Kỳ) phê chuẩn cho phép lƣu hành để phòng ngừa type HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58 Một số quốc gia (Mỹ, Hà Lan ) đƣa xét nghiệm HPV ADN xét nghiệm tầm soát ung thƣ cổ tử cung định kỳ cho phụ nữ Do đó, việc chẩn đốn phân biệt type HPV có nguy gây ung thƣ cao nguy gây ung thƣ thấp ngày trở nên cần thiết, giúp phân loại, điều trị, theo dõi bệnh nhân bị nhiễm HPV, xác định vai trò type HPV trƣờng hợp đồng nhiễm đánh giá hiệu vắc xin Hiện nay, kỹ thuật sinh học phân tử phƣơng pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao để phát kiểu gen HPV mẫu bệnh phẩm lâm sàng Ở nƣớc, chƣa có thơng tin nghiên cứu phát triển phƣơng pháp hay kít phát HPV nguy thấp mà có thơng tin kit phát nguy cao (Khoa Thƣơng) Một số hãng sinh phẩm nƣớc ngồi (Sacace - Italy) phát type HPV nguy cao thấp nhƣng thiết kế tách riêng thành hai sinh phẩm dẫn tới việc chẩn đoán nhiễm type HPV cho bệnh nhân tốn kinh phí, thời gian Do đó, phát triển phƣơng pháp phát đồng thời kiểu gen nguy cao thấp cần thiết Xuất phát từ thực tiễn trên, luận văn “Nghiên cứu phát triển kit phát đồng thời kiểu gen HPV nguy gây ung thƣ kỹ thuật multiplex real time PCR” đƣợc thực với mục tiêu sau: Nghiên cứu chế tạo kit multiplex real time PCR phát đồng thời 16 kiểu gen HPV có nguy gây ung thƣ phổ biến (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 68) Đánh giá tƣơng đồng kit chế tạo với kit thƣơng mại Thử nghiệm khả ứng dụng kit phát kiểu gen HPV mẫu bệnh nhân Bảng 3.5 Sự tương đồng kit nghiên cứu kit thương mại Kit thƣơng mại (Dƣơng tính) Kít thƣơng mại (Âm tính) Tổng số Tổng số Kit nghiên Kit nghiên cứu (Dƣơng tính) cứu (Âm tính) 28 30 20 20 28 22 50 Tiến hành đánh giá tƣơng đồng kit nghiên cứu với kit thƣơng mại thông qua hệ số phù hợp Kappa, có đƣợc số OA: 0,96%, EA: 0,48% Từ đó, nhóm nghiên cứu đƣa đƣợc tỷ lệ tƣơng đồng kit nghiên cứu với kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test (Roche - USA) HPV 6/11 Real-TM (Saccase Italy) 92% Các phƣơng pháp có ƣu điểm kỹ thuật multiplex real time PCR nói chung nhanh, độ xác cao, phát đồng thời nhiều tác nhân Tuy nhiên, giá thành kit nghiên cứu rẻ đáng kể so với kit thƣơng mại nhập ngoại, với tổng chi phí khoảng 350-400.000 VNĐ/1 xét nghiệm Trong đó, kit thƣơng mại Roche Sacace, để sàng lọc đƣợc type nguy cao thấp phải sử dụng hai kit, gây tốn thời gian sinh phẩm Chi phí cho xét nghiệm sàng lọc 14 type nguy cao với kit Cobas® HPV Test (Roche Diagnostic, USA) 750.000 VNĐ/1 xét nghiệm, HPV genotypes 14 Real-TM Quant (Sacace, Italy) 390.000 VNĐ/1 xét nghiệm HPV 6/11 Real-TM 178.000 VNĐ/1 xét nghiệm 3.3 Thử nghiệm khả ứng dụng kit phát kiểu gen HPV mẫu bệnh nhân Bảng 3.6 Thử nghiệm kit xây dựng mẫu bệnh nhân Kiểu gen HPV Số lƣợng 62 Tỷ lệ % 16/18 7 Nguy cao 5 Nguy thấp 3 16/18 + Nguy cao 1 16/18 + Nguy thấp 0 16/18 + Nguy cao + Nguy thấp 0 Nguy cao + Nguy thấp 0 Tỷ lệ nhiễm HPV 16 16 Âm tính 84 84 Kết thử nghiệm kit xây dựng mẫu thực bệnh nhân đến khám Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh năm 2017 2018 cho thấy: tỷ lệ nhiễm HPV đƣợc phát kỹ thuật real time PCR 16% (16 trƣờng hợp) Tỷ lệ thấp so với nghiên cứu Cao Minh Nga cộng (2009) 19,97% [1, 3] Tuy nhiên, tỷ lệ cao nhiều so với nghiên cứu khác nƣớc nhƣ Phạm Thị Hoàng Anh (2003) 10,9% [34], Phạm Thọ Dƣợc (2013) 11,8% [4] cao nhiều so với nghiên cứu Lê Trung Thọ (2008) 5,13% [2] Sự khác biệt tiêu chuẩn chọn mẫu Các tác giả Phạm Thị Hoàng Anh, Phạm Thọ Dƣợc Lê Trung Thọ chọn mẫu nghiên cứu cộng đồng dân cƣ, có chƣa có bệnh lý phụ khoa Trong nghiên cứu Cao Minh Nga, bệnh phẩm đƣợc thu nhận sở y tế, nơi bệnh nhân đến để kiểm tra bất thƣờng hữu, tỷ lệ nhiễm HPV cao so với nghiên cứu khác cộng đồng Trong 100 mẫu bệnh phẩm có trƣờng hợp nhiễm type HPV 16/18 (7%), trƣờng hợp nhiễm type HPV nhóm nguy cao (5%), trƣờng hợp nhiễm type HPV nhóm nguy thấp (3%) có trƣờng hợp đồng nhiễm HPV type 16/18 nguy cao (1%) Tỷ lệ nhiễm type HPV 16/18 43,75%, tỷ lệ nhiễm type nguy cao 31,25%, tỷ lệ nhiễm type nguy thấp HPV 6/11 21,4%, tỷ lệ đồng nhiễm type nguy cao 7% Tuy nhiên số lƣợng cỡ mẫu thử nghiệm 63 không lớn (n = 100), thử nghiệm đƣợc tiến hành bệnh có biểu bất thƣờng lâm sàng nên nhóm nghiên cứu khơng so sánh tỷ lệ nhiễm type HPV với số nghiên cứu khác Việt Nam 64 KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, đạt đƣợc số kết sau: Phát triển thành công kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng đầu dò Taqman cải tiến kit để phát đồng thời 16 type nguy cao thấp phổ biến (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , 66, 68, 6, 11) Phản ứng đƣợc chia thành hai hỗn hợp mix, HPV type 6/11 (kênh HEX), HPV type 16/18 (kênh Cy5), 12 loại nguy cao khác (kênh FAM), gen kiểm soát nội ATCB (kênh Texas) Độ nhạy phản ứng mức 5.101 sao/phản ứng type HPV 6, 11, 18, 31, 33/52, 35 5.102 type HPV 16, 39/68, 45, 51, 56/66, 58, 59 độ đặc hiệu đạt đƣợc 100% So sánh kit tạo thành nghiên cứu với kit thƣơng mại uy tín Real time Cobas®HPV (Roche Diagnostics) phát 14 type HPV nguy cao HPV 6/11Real-TM (Sacace) phát type nguy thấp, cho thấy mức độ tƣơng đồng đạt tới 92% Thử nghiệm 100 mẫu dịch phết cổ tử cung phụ nữ đến khám CDC Bắc Ninh cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV 16%, mẫu dƣơng tính với HPV 16/18 (7%), mẫu dƣơng tính với 12 type nguy cao (5 %), mẫu dƣơng tính với 6/11 (3 %) có mẫu đồng nhiễm HPV type HPV 16/18 nguy cao (1%) Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cơng bố 01 báo tạp chí Nghiên cứu Y học số năm 2018 với tên "Phát triển kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng Taqman probe cải tiến để phát HPV nguy thấp type 11 với độ đặc hiệu độ nhạy cao" 65 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu số hạn chế nhƣ: (i) độ nhạy kit chế tạo phối hợp HPV nguy cao nguy thấp so với độ nhạy kit thƣơng mại có uy tín phát HPV nguy cao (HPV- Cobas® HPV Test/ Roche Diagnostic, USA; 16/18 Real-TM Quant/Sacace, Italy) nguy thấp (HPV 6/11 Real-TM/Sacace, Italy) (ii) phải sử dụng 02 mix song song để phát 16 type HPV mà chƣa đƣa đƣợc 01 mix để giảm thao tác tối đa cho kỹ thuật viên; (iii) Nghiên cứu đƣa đƣợc tỷ lệ nhiễm HPV phạm vi hẹp bệnh nhân đến khám sức khỏe sinh sản trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, chƣa đƣa đƣợc tỷ lệ nhiễm HPV cộng đồng Do đó, hƣớng nghiên cứu dự định tiến hành là: + Tối ƣu thêm thành phần bổ sung vào kit để tăng độ nhạy cho phản ứng giảm xuống 01 mix để tiết kiệm sinh phẩm sử dụng thao tác cho kỹ thuật viên + Mở rộng cỡ mẫu để đánh giá tỷ lệ nhiễm HPV cộng đồng 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.Dƣơng T Thanh Hƣơng, Cao Minh Nga, Lục T Vân Bích cộng (2011), "Sự phân bố kiểu gen HPV (Human papillomavirus) phụ nữ yếu tố liên quan", Y Học TP Hồ Chí Minh Tập 15 2.Trần Văn Hợp, Lê Trung Thọ (2009), "Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HPV cộng đồng phụ nữ Hà Nội, tìm hiểu số yếu tố liên quan", Y Hoc TP Ho Chi Minh Tập 13, phụ số 1, tr 185 – 189 3.Cao Minh Nga, Lục Thị Vân Bích, Hồ Lê Ân, Huỳnh Ngọc Phƣơng Thảo (2011), "Khảo sát tình hình nhiễm HPV kiểu gen HPV (Human Papillomavirrus) phụ nữ Việt Nam độ tuổi từ 18 - 69 kỹ thuật sinh học phân tử", Y Học TP Hồ Chí Minh Tập 15, Phụ Số 4.Nguyễn Thị Tuyết Vân, Phạm Thọ Dƣợc, Ngô Thị Tú Thủy cộng (2013), "Xác định tỷ lệ nhiễm HPV khảo sát kiến thức, thái độ thực hành bệnh ung thƣ cổ tử cung phụ nữ tuổi sinh sản Đăk Lăk năm 2013", Tạp chí y học Dự Phòng Tập XXV, số (168) 2015 Số đặc biệt, tr 314 Tiếng Anh 5.Harari A (2014), "HPV Genomics: Past, Present and Future" 45, pp 1-18 6.McBride A A (2013), "The Papillomavirus E2 Proteins", Virology 445(0), pp 57-79 7.W W Newcomb, N H Olson L M Cowsert C Olson Baker T S., J C Brown (1991), " Structures of bovine and human papillomaviruses Analysis by cryoelectron microscopy and three-dimensional image reconstruction", Biophys J 60, pp 1445-1456 8.Monika Bergvall, Melendy, Thomas, Archambault, Jacques (2013)," The E1 proteins", Virology 445, pp.35–56 9.Heideman D A., Bleeker M C., Snijders P J et al (2009), "Penile cancer: epidemiology, pathogenesis and prevention", World J Urol 27(2), pp 141-50 10 De Flammineis E., Brianti P., and S R Mercuri (2017), "Review of HPVrelated diseases and cancers", New Microbiol 40(2), pp 80-85 67 11 Snijders P.J., Brink A.A., Meijer C.J (2007), "HPV detection methods", Dis Markers 23(4), pp 273-81 12 Bruni L., Diaz M., Castellsague X., Ferrer E et al (2010), "Cervical human papillomavirus prevalence in continents: meta-analysis of million women with normal cytological findings", J Infect Dis 202(12), pp 1789-99 13 Day P M., Buck C B., Trus B L (2013), "The Papillomavirus Major Capsid Protein L1", Virology 445(0), pp 169-74 14 Fisher C (2015), "Recent Insights into the Control of Human Papillomavirus (HPV) Genome Stability, Loss, and Degradation", J Clin Med 4(2), pp 204-30 15 WHO - International agency for research on cancer (2007), "IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans - Human Papillomaviruses" 90, pp 66-71 16 WHO - International agency for research on cancer (2007), "IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans - Human Papillomaviruses" 90, pp 87-112 17 Rodriguez A C., Castle P E., Porras C et al (2007), "A Comparison of Cervical and Vaginal Human Papillomavirus", Sex Transm Dis 34(11), pp 849-55 18 Engels E.A., Chaturvedi A.K., Pfeiffer R.M et al (2011), "Human Papillomavirus and Rising Oropharyngeal Cancer Incidence in the United States", J Clin Oncol 29(32), pp 4294-301 19 Foroni A.R., Dutra I., Couto M., Lima J., Bruges-Armas (2012), "Human Papillomavirus and Related Diseases– From Bench to Bedside – Research Aspects", pp 203-246 20 Burd Eileen M (2003), "Human Papillomavirus and Cervical Cancer", American Society for Microbiology, pp p 1–17 Vol 16 21.Sereday K.A., Flores-Díaz E., Ferreira S et al (2017), "HPV-6 Molecular Variants Association With the Development of Genital Warts in Men: The HIM Study", J Infect Dis 215(4), pp 559-565 68 22 De Martel C Forman D., Lacey C.J., Soerjomataram I et al (2012), "Global burden of human papillomavirus and related diseases", Vaccine 30 Suppl 5, pp F12-23 23 Lloveras B., Guimera N., Lindeman J et al (2013), "The occasional role of low-risk human papillomaviruses 6, 11, 42, 44, and 70 in anogenital carcinoma defined by laser capture microdissection/PCR methodology: results from a global study", Am J Surg Pathol 37(9), pp 1299-310 24 Doorbar J (2013), "The E4 protein; structure, function and patterns of expression", Virology 445(1-2), pp 80-98 25 Roman Klingelhutz A J (2012), "Cellular transformation by human papillomaviruses: lessons learned by comparing high- and low-risk viruses", Virology 424(2), pp 77-98 26 Watts S.L Krzyzek R.A., Anderson D.L et al (1980), "Anogenital warts contain several distinct species of human papillomavirus", Journal of Virology 36(1), pp 236-244 27 Trimble C., LaCour D.E (2012), "Human papillomavirus in infants: transmission, prevalence, and persistence", J Pediatr Adolesc Gynecol 25(2), pp 93-97 28 Lee N.W., Lee J.H., Hong S.W and ect (2011), "Establishment of an efficient multiplex real-time PCR assay for human papillomavirus genotyping in cervical cytology specimens: comparison with hybrid capture II", Cytopathology 22(4), pp 261-8 29 Park J S., Lee S M., Norwitz E R and ect (2013), "Risk of vertical transmission of human papillomavirus throughout pregnancy: a prospective study", PLoS One 8(6), pp e66368 30 Gorander S., Lindh M., Andersson E et al (2007), "Real-time Taqman PCR targeting 14 human papilloma virus types", J Clin Virol 40(4), pp 321-4 31 Burd E M (2003), "Human Papillomavirus and Cervical Cancer", Clin Microbiol Rev 16(1), pp 1-17 69 32 Alison A., McBride (2013), " The Papillomavirus E2 proteins", Virology 445, pp 57–79 33 Lee S W., Park H., Lee I H et al (2012), "Rate of vertical transmission of human papillomavirus from mothers to infants: relationship between infection rate and mode of delivery", Virol J 9, pp 80 34 Nguyen T.H Pham T.H., Herrero R et al (2003), "Human papillomavirus infection among women in South and North Vietnam", Int J Cancer 104(2), pp 213-20 35 Grénman S E., Rintala M A M., Puranen M H et al (2005), "Transmission of High-Risk Human Papillomavirus (HPV) between Parents and Infant: a Prospective Study of HPV in Families in Finland", J Clin Microbiol 43(1), pp 376-81 36 Munger K Roman A (2013), "The papillomavirus E7 proteins", Virology 445(0), pp 138-68 37 Koshiol J., Rositch A F., Hudgens M et al (2013), "Patterns of persistent genital human papilomavirus infection among women woldwide: a literature review and meta-analysis", Int J Cancer 133(6), pp 1271-85 38 Eric J Ryndock, Meyers Craig (2014), "A risk for non-sexual transmission of human papillomavirus?", Journal, pp 1165-1170 39 Andrews E., Seaman W T., Couch M et al (2010), "Detection and quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by real time PCR", Virol J 7, pp 194 40 Lambert P.F., Spurgeon M.E (2017),"Human Papillomavirus and the Stroma: Bidirectional Crosstalk during the Virus Life Cycle and Carcinogenesis", Viruses 9(8) 41 Paolini F Venuti A., Nasir L., Corteggio A., Roperto S et al (2011), "Papillomavirus E5: the smallest oncoprotein with many functions", Mol Cancer 10, pp 140 70 42 Henley S J., Viens L J., Watson M et al (2016), "Human PapillomavirusAssociated Cancers - United States, 2008-2012", MMWR Morb Mortal Wkly Rep 65(26), pp 661-6 43 Luisa Lina Villa (2009), "Laboratory Methods for Detection of Human Papillomavirus Infection", Springer-Verlag Berlin Heidelberg 44 Jacobs M.V., Walboomers J.M., Manos M M et al (1999), "Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide", J Pathol 189(1), pp 12-9 45 Li L.J Yang H., Xie L.X., Luo Z.Y et al (2016), "Clinical validation of a novel real-time human papillomavirus assay for simultaneous detection of 14 highrisk HPV type and genotyping HPV type 16 and 18 in China", Arch Virol 161(2), pp 449-54 46 Chen Y., Yu D., Wu S., Wang B et al (2012), "Simultaneous detection and differentiation of human papillomavirus genotypes 6, 11, 16 and 18 by AllGlo quadruplex quantitative PCR", PLoS One 7(11), pp e48972 47 Danny A., Milner (2015), "Diagnostic Pathology: Infectious Diseases", Elsevier Health Sciences 48 Nguyen V.D., Christopher V., Chu C.H et al (2016) Validation of a novel real time PCR assay for detection of HLA-B*15:02 allele for prevention of carbamazepine-Induced Stevens-Johnson syndrome/Toxic Epidermal Necrolysis in individuals of Asian ancestry, Hum.Immunol, 77, 1140-1146 Protocol hãng sản xuất 49 "AccuPid HR-HPV Genotyping Kit (16, 18)" 50 "cobas® HPV Test " 51 "HC2 High-Risk HPV ADN Test" 52 "HPV 6/11 Real-TM " 53 "HPV 16/18 Real-TM Quant " 54 "HPV Genotypes 14 Real-TM Quant " 71 Phụ lục 1: Phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu BẢN CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU Dành cho ngƣời tham gia nghiên cứu Tài liệu đƣợc thông báo đầy đủ đến đối tƣợng tham gia nghiên cứu, trang hay phần tài liệu đƣợc bỏ qua Những nội dung tài liệu cần phải đƣợc giải thích rõ lời với đối tƣợng tham gia nghiên cứu Bản chấp thuận dành cho bệnh nhân đến khám điều trị phụ khoa Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, đƣợc mời tham gia nghiên cứu dựa theo tiêu chuẩn lựa chọn tiêu chuẩn loại trừ mà nghiên cứu đặt Nghiên cứu mang tên “Nghiên cứu phát triển kit phát đồng thời kiểu gen HPV nguy gây ung thƣ kỹ thuật multiplex real time PCR” THÔNG TIN DÀNH CHO BỆNH NHÂN Chúng tiến hành nghiên cứu phát triển sinh phẩm sử dụng kỹ thuật multiplex real time PCR để phát đồng thời 16 kiểu gen virus HPV nguy cao thấp phổ biến nhằm góp phần tầm sốt tỷ lệ nhiễm HPV đánh giá hiệu vacxin dự phịng Chúng tơi xin đƣa số thông tin sau mời quý vị tham gia vào nghiên cứu Quý vị đồng ý/từ chối định sau Chúng tơi giải đáp có câu hỏi hay thắc mắc Virus HPV loại virut gây u nhú ngƣời Đây bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục phổ biến Hơn 200 loại HPV đƣợc xác định dựa khác biệt vật liệu di truyền Các loại HPV đƣợc chia thành nhóm nguy cao nguy thấp theo khả gây ung thƣ xâm lấn Các nghiên cứu tiềm gây ung thƣ HPV chứng minh HPV nguy cao nguyên nhân gây ung thƣ cổ tử cung, HPV nguy thấp nguyên nhân bệnh lý da niêm mạc 72 Trong nghiên cứu này, mẫu dịch phết cổ tử cung bệnh nhân đến khám điều trị phụ khoa Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh đƣợc thu thập để sàng lọc virus HPV kỹ thuật multiplex real time PCR sử dụng probe cải tiến Bệnh nhân không bị ảnh hƣởng nghiên cứu  Tiêu chuẩn lựa chọn: - Phụ nữ độ tuổi từ 18 - 65 tuổi  Tiêu chuẩn loại trừ - Bệnh nhân cắt cổ tử cung hoàn toàn - Bệnh nhân thời kỳ kinh nguyệt - Bệnh nhân đặt thuốc  Sự chấp thuận bệnh nhân hồn tồn tự nguyện  Q trình chẩn đốn điều trị bệnh nhân trung tâm không bị ảnh hƣởng bệnh nhân chấp nhận/ từ chối tham gia nghiên cứu  Bệnh nhân có quyền thay đổi định kể có chấp nhận/ từ chối trƣớc  Kết đƣợc thơng báo cho bệnh nhân sau thực xét nghiệm sử dụng cho mục đích nghiên cứu Tất thơng tin cá nhân bệnh nhân đƣợc bảo mật tuyệt đối XÁC NHẬN ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU Tôi đọc thông tin nêu Các câu hỏi thắc mắc đƣợc nghiên cứu viên giải đáp Tôi tình nguyện tham gia nghiên cứu Họ tên ngƣời tham gia: Chữ ký ngƣời tham gia: Ngày (ngày/tháng/năm): Phần dành cho nghiên cứu viên: Tôi đảm bảo ngƣời tham gia nghiên cứu đƣợc cung cấp thông tin đầy đủ nghiên cứu Tất câu hỏi ngƣời tham gia đƣợc giải đáp xác, ngƣời tham gia nghiên cứu tự nguyện không chịu ép buộc Họ tên nghiên cứu viên: Chữ ký nghiên cứu viên: 73 Phụ lục 2: Danh mục trình tự tham chiếu genome HPV tạo sở liệu trình tự HPV STT Kiểu gen HPV NCBI Accession Number 06 HG793938.1 11 JQ773411.1 16 NC001526.4 18 MF288722.1 31 KU298889.1 33 KU298892.1 35 HQ537711.1 39 KX514417.1 45 KC470255.1 10 51 KU298903 11 52 KU298906.1 12 56 KU298915.1 13 58 KY225918.1 14 59 KC470261.1 15 66 KU298926.1 16 68 GQ472851.1 74 Phụ lục 3: Kết giải trình tự gen số type HPV đại diện đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng kit HPV 16.E6 Kết giải trình tự gen CTGCTACGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGATATCGCC CTTATGTATAGTTGTTTGCAGCAGCTCTGTGCATAACTGTGTCGTAACTTTCTTG GTCGCTCCTGTGGGTCCTGAAACATTGCAGTTCTCTTTTGGTGCATAAAATGTC TGCTTTTATACTAACCGGTTTCGGTTCAAGGGCGAATTCTGC Kết HPV 16 Blast (ID: 96%) HPV 11.L1 Kết giả trình tự gen CTTTCTTCACAAATATCATTATCATATGCCCACTGCACCATTACAGTTAATTTA AATTGACTGTCAGCCAAACTATGTTCAATAACGGTCTGGCGCGTTATCCATTCC GGCGCCTCCCCTAATACTGTACTTGCAAGGGCGAATTCTGAGATATCCATCAG ACTGGGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCA Kết HPV 11 Blast (ID: 98%) HPV 31.E6 Kết giải trình tự gen ACTCTACGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTTCGC CCTTATCAGTAGGGTATTTCCAATGCCGAGCTTAGTTCATGCAATTTCCGAGGT CTTTCTGCAGGATTTTTGAACATGGCGTCTGTAGGTTTGCACAAAATACTATGT GCTTTATATACCAACCGTTTTCGGTTCAAGGGCGAATTC 75 Kết HPV 31 Blast (ID:100%) HPV 18.E6 Kết giải trình tự gen CTGCTCCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCC CTTCAGTGAAGTGTTCAGTTCCGTGCACAGATCAGGTAGCTTGTAGGGTCGCC GTGTTGGATCCTCAAAGCGCGCCATAGTATTGTGGTGTGTTTCTCSCATCTTTTA TATACACCGTTTTCGGTCCAAGGGCGAATTCTGCAGATA Kết HPV 18 Blast (ID: 98%) HPV 51.L1 Kết giải trình tự gen ACTGTACGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCC CTTATTCATACCTTCCCCATGCCTAATATATTGCTTAAAGTTACTTGGAGTAAA TGTTGGGGAAACTGCAGCAGATGGCAAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCA CACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCA Kết HPV 51 Blast (ID: 97%) 76 ... bình /cao Trung bình /cao Cao /cao Cao /cao khuếch đại tín hiệu để phát Hybrid Capture genome HPV HPV Khuếch đại trình PCR tự đích Realtime PCR Cao/ cao Rất cao/ cao Rất cao - cao/ cao trung bình Rất cao. .. Phát Thấp /cao Thấp/ thấp Thấp /cao Thấp/ thấp ELISA Thấp/ thấp Thấp/ thấp Hợp E6/E7 Cao/ trung bình protein HPV Kính hiển vi điện tử Phát kháng thể HPV Phƣơng pháp Southern blot Thấp - trung bình /Cao. .. đó, phát triển phƣơng pháp phát đồng thời kiểu gen nguy gây ung thƣ cao nguy gây ung thƣ thấp cần thiết Xuất phát từ thực tiễn trên, đề xuất ? ?Nghiên cứu phát triển kit phát đồng thời kiểu gen HPV

Ngày đăng: 17/04/2021, 17:13

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w