Nghiên cứu phát triển KIT chẩn đoán virus viêm gan b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *** - NGUYỄN NGỌC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐỐN VIRUS VIÊM GAN B CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG HÀ NỘI - 2017 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu luận văn Các kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực, số liệu, tính tốn hồn tồn xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Mọi liệu, hình ảnh trích dẫn tham khảo luận văn thu thập sử dụng nguồn liệu mở trích dẫn rõ nguồn gốc Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Ngọc Phương Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PSG.TS Trương Quốc Phong – Trưởng phòng thí nghiệm Proteomic ( Trung tâm Nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội) tận tình định hướng, hướng dẫn truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn học viên, sinh viên công tác Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội góp ý kiến q báu cho tơi, giúp đỡ tơi q trình thực đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, người thân động viên, khuyến khích giúp tơi vượt qua khó khăn suốt q trình nghiên cứu Do điều kiện, khả thời gian thực có giới hạn nên đề tài khơng thể tránh sai sót Tơi mong nhận đóng góp thầy bạn đề đề tài hồn thiện Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Ngọc Phương Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AuNPs : Gold nanoparticle BSA : Bovine Albumine Serum cDNA : Complementary DNA DNA : Deoxyribonucleic Acid ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Ig : Immunoglobulin HBV : Hepatitis B virus HBcAg : Hepatitis B core antigen HBeAg : Hepatitis B viral protein HBsAg : Hepatitis B surface antigen mRNA : Messenger RNA NSP : Non-Structural Protein PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid RIA : Radio Immuno Assay WHO : World Health Organization Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Đặc tính kháng nguyên HBV………………………………………………… Bảng 1.2: Tình hình nhiễm HBV Châu lục……………………………………… 19 Bảng 1.3: Tỷ lệ người mang HBsAg cộng đồng người Việt Nam……………… 20 Bảng 1.4: Tỷ lệ viêm gan B số bệnh nhân viêm gan B cấp số bệnh viện nước…………………………………………………………………………………… 21 Bảng 1.5: Đặc tính vật liệu chế tạo miếng cộng hợp………………………… 36 Bảng 3.1: Bảng công thức đệm tạo cộng hợp……………………………………………51 Bảng 3.2: Đặc tính loại vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp……………… 53 Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Virus viêm gan B kính hiển vi điện tử………………………………… Hình 1.2: Cấu trúc virus viêm gan B…………………………………………………….5 Hình 1.3: Cấu trúc gen virus viêm gan B…………………………………………… Hình 1.4: Nguyên lý xác định kháng nguyên HBsAg………………………………… 23 Hình 1.5: Nguyên lý xác định kháng thể HBsAb……………………………………… 24 Hình 1.6: Nguyên lý phương pháp ELISA sandwich……………………………………26 Hình 1.7: Nguyên lý phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang…………………… 27 Hình 1.8: Ngun tắc kỹ thuật PCR…………………………………………………… 29 Hình 1.9: Nguyên tắc khuyếch đại tín hiệu bDNA………………………………… 30 Hình 1.10: Cấu tạo que thử phát nhanh virus viêm gan B theo nguyên lý sắc ký miễn dịch……………………………………………………………………………………….32 Hình 3.1: Kiểm tra hoạt động que thử với điều kiện thiết lập ban đầu…………… 46 Hình 3.2: Xác định giá trị pH thích hợp cho phản ứng tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng………………………………………………………………………………………47 Hình 3.3: Xác định lượng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng………………………49 Hình 3.4: Xác định thời gian thích hợp tạo cộng hợp……………………………………50 Hình 3.5: Xác định nhiệt độ thích hợp tạo cộng hợp ……………………………………51 Hình 3.6: Ảnh hưởng đệm tạo cộng hợp đến tín hiệu que thử………………………52 Hình 3.7: Kết thử nghiệm loại vật liệu khác làm miếng cộng hợp……… 54 Hình 3.8: Xác định nhiệt độ thích hợp xử lý miếng cộng hợp………………………… 55 Hình 3.9: Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp………………………………………56 Hình 3.10: Xác định hàm lượng kháng thể thích hợp cố định lên màng nitrocellulose 57 Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Hình 3.11: Kết thử nghiệm loại đệm khác cố định kháng thể lên màng…58 Hình 3.12: Ảnh hưởng thời gian sấy đến tín hiệu que thử………………………… 59 Hình 3.13: Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng nitrocellulose……………………….60 Hình 3.14: Ảnh hưởng miếng thấm mẫu đến tín hiệu que thử………………………61 Hình 3.15: Kết thử nghiệm dung dịch ly giải mẫu khác nhau………………… 62 Hình 3.16: Kết kiểm tra ngưỡng phát que thử…………………………… 63 Hình 3.17: Thử nghiệm que thử với tác nhân lây bệnh qua đường máu………………64 Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG I…………………………………………………………………………………………………3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm virus viêm gan B 1.1.1 Lịch sử virus viêm gan B 1.1.2 Cấu trúc virus viêm gan B 1.1.2.1 Danh pháp phân loại học 1.1.2.2 Hình dạng cấu tạo chung 1.1.2.3 Cấu trúc gen HBV 1.1.2.4 Các protein cấu trúc virus viêm gan B .8 1.1.2.4.1 Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt ( Anti- HBs) .8 1.1.2.4.2 Kháng thể kháng kháng nguyên lõi ( anti- HBc) .9 1.1.2.4.3 Kháng thể kháng kháng nguyên e ( anti-HBe) 10 1.1.2.4.4 HBV- DNA .10 1.1.3 Đặc điểm lý hóa 10 1.1.4 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus HBV 11 1.1.4.1 Mối liên quan cấu trúc xâm nhiễm HBV vào tế bào gan 11 1.1.4.2 Cơ chế xâm nhiễm tái HBV 12 1.1.4.2.1 Tấn công .12 1.1.4.2.2 Thâm nhập 13 1.1.4.2.3 Quá trình phiên mã gen HBV 14 1.1.4.2.4 Quá trình dịch mã .15 1.1.4.2.5 Tổng hợp genome virus .15 1.1.4.2.6 Lắp ráp tạo hạt virus hoàn chỉnh 16 1.1.4.2.7 Giải phóng 16 1.1.5 Các đường lây truyền viêm gan B .16 1.1.6 Tình hình nhiễm virus viêm gan B giới Việt Nam 18 1.1.6.1 Trên giới 18 1.1.6.2 Tại Việt Nam 19 Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật 1.2 Các phƣơng pháp chẩn đoán viêm gan B 22 1.2.1 Phương pháp miễn dịch 22 1.2.1.1 Phương pháp dựa nguyên lý sắc kí miễn dịch (que thử) .22 1.2.1.2 Phương pháp ELISA sandwich .25 1.2.1.3 Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang ( ECLIA) 26 1.2.1.4 Phương pháp miễn dịch phóng xạ(Radio Immuno Assay-RIA) 27 1.2.1.5 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang .28 1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 28 1.2.2.2 Kỹ thuật PCR 28 1.2.2.3 Phương pháp lai thấm điểm 29 1.2.2.4 Khuyếch đại tín hiệu bDNA 29 1.2.2.5 Phương pháp lai chéo tác dụng tia UV 30 1.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gene .30 1.3 Nguyên lý que thử .31 1.3.1 Nguyên lý 31 1.3.2 Đặc tính thành phần que thử .32 1.3.2.1 Hạt nano vàng (AuNPs) 32 1.3.2.2 Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 34 1.3.2.3 Miếng thấm mẫu (Sample pad) 34 1.3.2.4 Miếng cộng hợp 35 1.3.2.5 Màng nitrocellulose (membrane) 37 1.3.2.6 Miếng thấm hút (absorbent pad) 38 CHƢƠNG II .39 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu 39 2.1.1 Hóa chất kháng thể 39 2.1.2 Các vật liệu chế tạo que thử 39 2.1.3 Thiết bị 40 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Phương pháp gắn kháng thể kháng virus HBV lên bề mặt hạt nano vàng 40 Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật 2.2.1.1 Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể nano vàng .40 2.2.1.2 Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 41 2.2.1.3 Phương pháp tối ưu nồng độ kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng 43 2.2.2 Phương pháp tối ưu nồng độ kháng thể đa dòng dê phun lên màng 43 2.2.3 Phương pháp cố định kháng thể lên màng 44 2.2.4 Phương pháp phân tích mẫu que thử 44 2.2.5 Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu que thử 44 CHƢƠNG III 46 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Thiết lập điều kiện tạo que thử 46 3.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng 47 3.2.1 Xác định giá trị pH thích hợp tạo cộng hợp 47 3.2.2 Tối ưu nồng độ kháng thể chuột tạo cộng hợp với hạt nano vàng .48 3.2.3 Thời gian tạo cộng hợp .49 3.2.4 Nhiệt độ tạo cộng hợp 50 3.2.5 Tối ưu đệm cộng hợp 51 3.3 Nghiên cứu điều kiện tối ƣu tạo miếng cộng hợp chứa phức kháng thể hạt nano vàng (conjugate pad) 53 3.3.1 Lựa chọn vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp 53 3.3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp xử lý miếng cộng hợp 55 3.3.3 Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp 56 3.4 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai .57 3.4.1 Xác định hàm lượng kháng thể dê thích hợp cố định lên màng nitrocellulose .57 3.4.2 Lựa chọn đệm hòa tan kháng thể cố định màng 58 3.4.3 Tối ưu thời gian sấy màng nitrocellulose .60 3.4.4 Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng nitrocellulose 60 3.5 Tối ƣu vật liệu làm miếng thấm mẫu .61 3.6 Lựa chọn dung dịch ly giải mẫu (SPS) 62 3.7 Đánh giá que thử 63 3.7.1 Ngưỡng phát .63 3.7.2 Phản ứng chéo .64 Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Hình 3.7: Kết thử nghiệm loại vật liệu khác làm miếng cộng hợp Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần 3.3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp xử lý miếng cộng hợp Miếng cộng hợp tạo cách nhúng vật liệu Alstrom 6613 vào dung dịch cộng hợp (Ab – AuNPs) sau làm khơ Trong nghiên cứu này, q trình làm khơ thực nhiệt độ Nhiệt độ cao thời gian làm khơ nhanh, nhiệt độ cao ảnh hưởng đến hoạt tính kháng thể Để xác định nhiệt độ xử lý tối ưu miếng cộng hợp sau thấm dung dịch chứa cộng hợp Ab – AuNPs xử lý : 4oC, 25oC qua đêm 42oC 30 phút Kết cho thấy ba điều kiện xử lý nhiệt độ xuất tín hiệu, nhiên, điều kiện 42oC cho kết rõ (Hình 3.8) Ở nhiệt độ thấp hơn, cường độ tín hiệu giảm thời gian xử lý dài làm giảm hoạt tính kháng thể Với thời gian xử lý ngắn cho kết tốt nên điều kiện xử lý miếng cộng hợp 42oC 30 phút lựa chọn cho nghiên cứu Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 55 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật oC Hình 3.8: Xác định nhiệt độ thích hợp xử lý miếng cộng hợp Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát 3.3.3 Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp Thời gian sấy miếng cộng hợp ảnh hưởng lớn đến chất lượng que thử Nếu miếng cộng hợp có độ ẩm lớn ảnh hưởng đến khả thấm mẫu, thời gian bảo quản que thử, sấy thời gian dài ảnh hưởng đến hoạt tính kháng thể chi phí lượng Do vậy, miếng cộng hợp nhúng vào dung dịch cộng hợp kháng thể hạt nano vàng , sấy nhiệt độ 42oC, thời gian: 120 phút, 90 phút, 60 phút, 30 phút 15 phút Kết cho thấy, thời gian sấy 15 phút nhỏ mẫu lên que thử, mẫu thấm ướt không tốt, vạch xuất không rõ ràng Ở thời gian sấy 120 phút 90 phút, mẫu thấm ướt tốt vạch hồng tía xuất khơng rõ ràng, thời gian sấy lâu làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng thể Ở thời gian sấy 60 phút 30 phút, vạch hồng tía xuất rõ nét, mẫu thấm ướt tốt Để tiết kiệm chi phí lượng mã đảm bảo chất lượng que thử, ta chọn thời gian sấy miếng cộng hợp 30 phút cho thử nghiệm Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 56 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Hình 3.9: Xác định thời gian sấy miếng cộng hợp Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát 3.4 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 3.4.1 Xác định hàm lượng kháng thể dê thích hợp cố định lên màng nitrocellulose Theo nguyên lý que thử, kháng nguyên virus HBV qua conjugate pad tương tác với kháng thể cộng hợp hạt nano vàng để tạo thành phức kháng nguyên- kháng thểhạt nano vàng (Ag-Ab-AuNPs) tiếp tục di chuyển vào phần màng nitrocellulose Kháng thể cố định lên màng nitrocellulose cho phép bắt giữ phức Ag -Ab-AuNPs dòng mao dẫn chạy qua Do đó, lượng kháng thể cố định ảnh hưởng đến độ nhạy (tức ngưỡng phát hiện) que thử Tuy nhiên, que thử kháng thể lại yếu tố có giá thành cao định giá thành que thử Tương tự kháng thể tạo cộng hợp Ab-AuNPs, kháng thể thứ hai kháng virus HBV cố định lên màng nitrocellulose nồng độ khác nhau: 0,1 μg; 0,3 μg; 0,6 μg; 0,9 μg/vạch/que để xác định lượng kháng thể phù hợp vừa cho phép hiển thị vạch tín hiệu rõ ràng vừa sử dụng kháng thể Kết cho thấy, hàm lượng kháng thể giảm cường độ băng tín hiệu giảm (Hình 3.10) Tuy vậy, với lượng kháng thể 0,3 μg/ vạch/ que cho băng tín hiệu đậm rõ nét Do vậy, lượng kháng thể cố định lên màng nitrocellulose lựa chọn 0,3 μg/ vạch/ que Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 57 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Hình 3.10: Xác định hàm lƣợng kháng thể thích hợp cố định lên màng nitrocellulose Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát 3.4.2 Lựa chọn đệm hòa tan kháng thể cố định màng Đệm cố định kháng thể thành phần có vai trò quan trọng que thử Thành phần nồng độ chất đệm cố định kháng thể ảnh hưởng đến dòng mao dẫn đặc biệt độ bền kháng thể cố định trình bảo quản Thông thường que thử bảo quản 4oC nhiệt độ phòng, độ bền kháng thể yếu tố quan trọng Trong nghiên cứu này, ba loại đệm cố định kháng thể khác sử dụng để đánh giá lựa chọn hệ đệm phù hợp Ba hệ đệm bao gồm: CT1: PBS 1X pH 7.4, 5% MeOH; CT2: PBS 1X pH 7.4, 5% MeOH, 2% sucrose; CT3: PBS 1X pH 7.4, 5% MeOH, 2% sucrose, 1% BSA Kháng thể sau cố định, hoạt tính kiểm tra theo theo thời gian bảo quản Sau tháng bảo quản, ta thấy kết ổn định với công thức đệm CT1 (Hình 3.10) Trong hoạt tính kháng thể giảm Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 58 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật hẳn từ tuần thứ công thức đệm CT3 tuần thứ công thức đệm CT2 Từ kết thu được, lựa chọn công thức đệm CT1 để cố định kháng thể lên màng nitrocellulose Hình 3.11: Kết thử nghiệm loại đệm khác cố định kháng thể lên màng Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 59 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật 3.4.3 Tối ưu thời gian sấy màng nitrocellulose Sau phun kháng thể lên màng, màng cần phải sấy khô để cố định kháng thể lên màng Sự cố định giúp kháng thể không bị trôi dòng mão dẫn dung dịch phân tích chảy qua Ngồi cố định có vai trò trì hoạt tính (độ bền) kháng thể q trình bảo quản Thời gian sấy có ảnh hưởng lớn đến chất lượng que thử, thời gian sấy kéo dài làm biến tính kháng thể kháng thể có chất protein rút ngắn thời gian sấy thời gian bảo quản rút ngắn khơng thể cố định vị trí kháng thể màng khiến vạch không rõ nét gây ảnh hưởng đến kết xét nghiệm Do vậy, phép thử này, ta sấy màng nitrocellulose phun kháng thể khoảng thời gian là: 120 phút, 90 phút, 60 phút, 30 phút 15 phút Từ thực nghiệm cho thấy, sấy khoảng thời gian 30 phút không làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng thể, đảm bảo chất lượng que thử, vạch hồng tía đậm, rõ nét Ta chọn tối ưu thời gian sấy màng nitrocellulose 30 phút cho phép thử Hình 3.12: Ảnh hƣởng thời gian sấy đến tín hiệu que thử Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát 3.4.4 Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng nitrocellulose Theo lý thuyết nhiệt độ xử lý cao ảnh hưởng đến hoạt tính kháng thể Trong nghiên cứu này, q trình sấy khô thực 4oC 25oC qua đêm, 42oC 30 phút Kết cho thấy, tăng nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính kháng thể, với phép thử này, sấy màng nhiệt độ 42oC 30 phút hoạt Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 60 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật tính kháng thể giảm khơng đáng kể So với thực 4oC nhiệt độ phòng để qua đêm, thời gian làm khơ kéo dài mà chất lượng que thử không tốt Từ kết thu được, nhiệt độ xử lý sấy khô màng lựa chọn 42oC 30 phút Hình 3.13: Xác định nhiệt độ thích hợp sấy màng nitrocellulose Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát Thí nghiệm lặp lại lần 3.5 Tối ƣu vật liệu làm miếng thấm mẫu Để mẫu huyết tương mao dẫn tốt, thấm hút nhanh vật liệu làm miếng thấm mẫu đóng vai trò vô quan trọng để mẫu tiếp xúc với thành phần lại que thử Đặc tính miếng thấm mẫu ảnh hưởng đến lượng mẫu cần cho phép thử, lượng mẫu cần thiết tối thiểu đảm bảo tính xác xét nghiệm Trong phép thử này, sử dụng loại vật liệu khác độ dày để làm miếng thấm mẫu: GLB02 (0,57 mm), GL0194 (0,41 mm), Y3 (0,52 mm), Y2 (0,35 mm), Y1 (0,28 mm) Với kết thực nghiệm, ta thấy tín hiệu que thử đậm, rõ nét với miếng thấm mẫu GL0194 Đối với vật liệu thấm mẫu dày lượng mẫu cần nhiều,với lượng mẫu nạp vào khơng đủ để mao dẫn, miếng thấm mẫu mỏng mẫu chạy nhanh Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 61 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật khiến kháng thể bắt cặp không tốt, ảnh hưởng đến tín hiệu que thử Do vậy, chúng tơi chọn vật liệu làm miếng thấm mẫu GL0194 Hình 3.14: Ảnh hƣởng miếng thấm mẫu đến tín hiệu que thử Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát Thí nghiệm lặp lại lần 3.6.1 Lựa chọn dung dịch ly giải mẫu (SPS) Đặc trưng mẫu huyết tương độ nhớt cao giảm khả mao dẫn, không đủ khả thấm ướt gây sai lệch kết khó khăn việc nhận định kết Dung dịch ly giải mẫu làm giảm độ nhớt huyết tương, tăng tính thấm, trẻ em khó lấy máu, việc sử dụng dung dịch ly giải làm giảm lượng huyết tương cần sử dụng cho phép thử Chúng tiến hành sử dụng ba loại dung dịch ly giải mẫu:  SPS1: 1X PBS(pH7,4), 0,1M NaCl, 0,5% Tween 20  SPS2: 0.1M SB, 1% Triton X-100  SPS3: 0.02% Tween 20, 0.5% sữa gầy, 0.05% SDS Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 62 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật Hình 3.15: Kết thử nghiệm dung dịch ly giải mẫu khác Vạch tín hiệu đƣợc thể cửa sổ quan sát Thí nghiệm lặp lại lần Kết cho thấy, dung dịch ly giải SPS1 SPS3, dịch chạy không màng, vạch xuất mờ không xuất Đối với dung dịch ly giải SPS2, dịch mẫu đồng nhất, dịch chạy màng, vạch xuất rõ nét chứng tỏ dung dịch ly giải SPS2 không làm ảnh hưởng đến chất lượng mẫu, khả cộng hợp kháng thể hạt nano vàng hoạt tính kháng thể Do vậy, chúng tơi chọn dung dịch ly giải mẫu SPS2 3.7 Đánh giá que thử Với điều kiện tối ưu trên, tiến hành chế tạo que thử đánh giá số thông số que thử tạo Đối với kit chẩn đoán hai yếu tố quan trọng cần quan tâm độ nhạy độ đặc hiệu Về độ nhạy yêu cầu phát bệnh mức số lượng hạt virus thấp Độ đặc hiệu phản ánh khả chẩn đốn xác mầm bệnh phát mà không bị phản ứng chéo với loại khác thuộc họ với tác nhân bệnh Ngoài chất lượng sản phẩm giá thành yếu tố mà người tiêu dùng quan tâm Bên cạnh đó, người sử dụng quan tâm đến cách thức tiến hành thời gian đọc xét nghiệm 3.7.1 Ngưỡng phát Để xác định ngưỡng phát que thử, dải nồng độ virus HBV sử dụng để thử nghiệm: 1x 109 hạt/ml, 2x 108 hạt/ml, 2x 107 hạt/ml, 2x106 hạt/ml Kết cho Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 63 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật thấy nồng độ 2x106 hạt/ml xuất vạch tín hiệu mờ Do đó, chúng tơi xác định ngưỡng phát que thử x106 hạt/ml Hình 3.16: Kết kiểm tra ngƣỡng phát que thử 3.7.2 Phản ứng chéo Chúng tiến hành thử phản ứng chéo với số tác nhân lây bệnh qua đường máu thường gặp như: Giang mai (Treponema pallidum), CMV (Cytomegalovirus),EBV (Virus Epstein-Barr), HIV(Human Immuno-deficiency Virus), HCV (Hepatitis C virus) Kết cho thấy khơng có tác nhân gây dương tính với que thử phát virus HBV Điều khẳng định kháng thể kháng virus HBV đặc hiệu với virus HBV khơng có phản ứng chéo với tác nhân Hình 3.17: Thử nghiệm que thử với tác nhân lây bệnh qua đƣờng máu Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 64 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật 3.7.3 Độ nhạy độ đặc hiệu Chúng tiến hành xác lập độ nhạy độ đặc hiệu với 126 mẫu máu người hiến máu kiểm tra virus HBV phương pháp ELISA mẫu âm với phương pháp que thử (test nhanh) mẫu dương (tại bệnh viện Nhi Trung Ương) thấy độ nhạy, độ đặc hiệu đạt 100% Trong 126 mẫu máu, có 96 mẫu âm với virus HBV 30 mẫu dương với virus HBV Kết kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu thể phụ lục I Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 65 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu được, chúng tơi có số kết luận sau: - Đã xác định điều kiện thích hợp quan trọng để tạo nên que thử nhanh phát virus viêm gan B như: hàm lượng kháng thể để tạo cộng hợp 0,3 µg, nhiệt độ thích hợp để tạo cộng hợp kháng thể hạt nano vàng 25 oC, đệm cộng hợp (CB 20mM; 2% BSA; 3% sucrose; 0,6M NaCl; 0,2% Tween), vật liệu để tạo miếng cộng hợp Ahlstrom 6613, lượng kháng thể cố định lên màng 0,3 µg - Chế tạo đánh giá số thông số que thử: ngưỡng phát 2x 106 hạt virus/ml; độ nhạy độ đặc hiệu đạt 100%; khơng có phản ứng chéo với số tác nhân lây qua đường máu giang mai, CMV, EBV, HIV, HCV - Bước đầu thử nghiệm kit thử với 126 mẫu máu người hiến máu cho kết tương tự kit thương mại sử dụng KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện que thử - Thiết kế que thử với cấu tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng, hạn chế thao tác xét nghiệm - Cải tiến que thử để lượng mẫu đưa vào mà đảm bảo chất lượng xét nghiệm Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 66 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ- Hà Nội 6/2004 Chương trình hành động phòng chống lây lan virus viêm gan B đến năm 2010 – viện y học biển Việt Nam Bùi Đại (2002), "Tổng quan loại viêm gan virus Các xét nghiệm viêm gan virus", Viêm gan virus B D, Nhà xuất Y học, tr 21-26, 218-236 Hướng dẫn sử dụng Test nhanh Viêm gan B (HBsAb) hãng AbonTQtankieu.vn/uploads/shops/2016_09/huong-dan-su-dung-abon-HBsAb.pdf Lê Minh Hồng, Nguyễn Thạc Tuấn, Nguyễn Anh Trí (2003), "Khảo sát dấu ấn HBeAg AntiHBe người có HBsAg dương tính", Tạp chí Y học thực hành, Số 2, tr 96-98 Nguyễn Đạt Anh, Nguyễn Thị Hương, Lương Tấn Thành (2012), "Huyết học chẩn đoán virus viêm gan B", Các xét nghiệm thường quy áp dụng thực hành lâm sàng, Nhà xuất Y học, tr 237-248 Nguyễn Thu Vân ( 2008 ) : “Viêm gan virus B vaccine dự phòng ” Đặc san y tế dự phòng số 7,Cục y tế dự phòng Hải phòng, Hải phòng Phạm Văn Ty (2005), Virus học, nhà xuất giáo dục, Hà Nội Viêm gan virus A, B, non A non B Bách khoa thư bệnh học , tập II TÀI LIỆU TIẾNG ANH Altman DG, Bland JM (1994) “Diagnostic tests 1: Sensitivity and specificity” BMJ 308 (6943): 1552 10 Atlas Link INC (2007), "Introduction for use of Hepatitis B virus e antigen ELISA Kit", pp.1-5 11 Billerica, MA: (2008): “Rapid Lateral Flow Test Strips, Considerations for product development”,Millipore Corporation, 1-23 Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 67 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật 12 Chen P, Yu C, Wu W, Wang J, Ruan B, Ren J, Yang S, Xu K, Yu L, Li L (2013), "Serolological Profile Among HBsAg-Positive Infections in Southeast China: A Community-Based Study", Hepat Mon., 13:3 767-789 13 Christoph Seeger* and William S Mason Hepatitis B Virus Biology 14 Delius H, Gough M N, Cameron H C and Murray K.( March 2016 )“ Structure of the hepatitis B virus genome” 65:3 502-511 15 Grant RA, Lin TC, Webster RE, Konigsberg W (1981)“Structure of filamentous bacteriophage: isolation, characterization, and localization of the minor coat proteins and orientation of the DNA” Prog Clin Biol Res.64:413–428 16 Liang TJ 2009 May; Hepatology.49(5 Suppl):S13-21 17 Liaw YF1, Brunetto MR, Hadziyannis S 2010 “The natural history of chronic HBV infection and geographical differences.”;15 Suppl 3:25-33 18 Lok, A, S-F 2000- “Hepatitis B infection – Pathogenesic and Management” J Hepatol 32: 89-97 19 Maddrey, W.C (2000) “Hepatitis B, an Important Public Health Issue” J Thed Virol – 61: 362-366 20 Marcellin P, Castelnau C, Martinot-Peignoux M, Boyer N 2005 Mar; “Natural history of hepatitis B” 51(1):63-75 21 Mel Krajden, MD, Gail McNabb, BSc ART, and Martin Petric, PhD 2005 MarApr “The laboratory diagnosis of hepatitis B virus” 16(2): 65–72 22 Proc Natl Acad Sci,(November 2005 ) “A structural model for maturation of the hepatitis B virus core” USA 102:44 15821-15826 23 Rebecca –Horvart T and Gary E- Tegtmeieth (2003)“Serologic Detection of Hepatitis B Antigens and Antibodies” Manual of clinical Microbiology 8th, Edition.1470 – 1471 24 Smith AM, Tedder RS J Virol Methods 1981-Jul “Development of an enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for hepatitis B e antigen and antibody” ; 3(1):1-1 Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 68 Luận văn thạc sĩ kĩ thuật 25 Supran E M , Boxall E H , Craske J, Hart R J , Vandervelde E M, and Gardner P S 1983 May “Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of hepatitis Be antigen and antibody: report of a field trial.”; 36(5): 581–585 26 WHO (2014), "Hepatitis B", Fact sheet N0 204, Updated June 2014 27 Wursthorn K, Jaroszewicz J, Zacher BJ, Darnedde M, Raupach R, Mederacke I, Cornberg M, Manns MP, Wedemeyer H (2011), "Correlation between theElecsys HBsAg II assay and the Architect assay for the quantification of hepatitis B surface antigen (HBsAg) in the serum", J Clin Virol, 50(4), pp 292-306 28 Xu W, Li Y, Wang M, Gu J (2011), "Comparison of two immunoassays for determining hepatitis B virus serum markers", Clin Chem Lab Med, 50(1), pp.153157 CÁC TRANG WEB http:// www.tuplipgroup.com http:// ekoweb.fi http://tapchi.vnha.org.vn https://www.ncbi.nlm.nih.go http://khoahoc.vn https://www.researchgate.net http://www.medhelp.org/posts/Hepatitis-B Nguyễn Ngọc Phương – CH2015A 69 ... thành tế b o, không gây chết tế b o 1.1.5 Các đường lây truyền viêm gan B Virus viêm gan B loại virus hướng gan, gây b nh viêm gan Sau nhiễm virus viêm gan B phần lớn người b nh khơng có biểu b nh,... “ Nghiên cứu phát triển kit chẩn đoán virus viêm gan B ” với mục tiêu: Xác lập số điều kiện thích hợp tạo que thử phát nhanh virus viêm gan B từ mẫu máu( huyết tương huyết thanh) Nội dung nghiên. .. vào tế b o gan 1.1.4.2 Cơ chế xâm nhiễm tái HBV Những tế b o gan tế b o đích virus viêm gan B, để sinh sơi phát triển thể vật chủ HBV phải xâm nhập vào tế b o gan Sự xâm nhập xảy theo b ớc sau: